森林草莓糖基轉移酶基因家族生物信息學及其表達分析

趙倩倩 宋艷紅 宋盼 陳亞鐸 李剛 趙霞 劉麗鋒 周厚成

摘要：【目的】對森林草莓糖基轉移酶基因（FvUGT）家族進行生物信息學分析及基因表達分析，為深入研究森林草莓UGT基因功能和探索UGT調(diào)控草莓果實發(fā)育及花色苷及品質(zhì)形成提供理論依據(jù)?！痉椒ā炕赑hytozome數(shù)據(jù)庫鑒定得出138個FvUGT基因家族基因，運用生物信息學方法分析其蛋白理化性質(zhì)、基因結構、保守結構域和進化關系，并采用實時熒光定量PCR對UFGT候選基因在森林草莓（紅果和白果2個類型）各組織（根、葉柄、葉和果實）中的表達量進行分析?！窘Y果】FvUGT基因家族可分為12個類群（A、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和N），每個類群分別包含16、2、23、32、8、1、5、5、7、3、21和4個成員;染色體定位發(fā)現(xiàn)FvUGT基因家族成員在除2號染色體之外的其他染色體上均有分布，且分布不均;FvUGT基因內(nèi)含子長度、外顯子位置和數(shù)目在不同成員間均存在差異，F(xiàn)vUGT基因家族在進化過程中產(chǎn)生較強的分化。實時熒光定量PCR檢測結果表明，F(xiàn)vUFGT70基因在森林草莓白果和紅果的葉和葉柄中有較高表達;FvUFGT94基因在各組織中均有表達;FvUFGT67和FvUFGT68基因在根中有較高表達;而FvUFGT95和FvUFGT96基因在果實中有表達，且顯著高于其他組織（P<0.05，下同）。同時，在果實的小綠期、轉色期和成熟期的表達表現(xiàn)為，成熟期FvUFGT33和FvUFGT95這2個基因在森林草莓紅果類型的表達量顯著高于白果類型。【結論】7個FvUFGT基因表現(xiàn)出明顯的組織差異性，其中FvUFGT33和FvUFGT95基因在果實中有較高表達量，且在森林草莓紅果類型表達量顯著高于白果類型，故推測其在花色苷合成中發(fā)揮作用。

關鍵詞： 森林草莓;糖基轉移酶基因（UGT）家族;基因結構;基因功能;表達分析

Abstract：【Objective】In this study， bioinformatics analysis and gene expression analysis of Fragaria vesca glycosyltransferase gene（FvUGT） family were carried out to provide theoretical basis for the FvUGT gene function of F. vesca and the exploration of UGT regulation of fruit development and anthocyanin and quality formation of F. vesca. 【Method】Based on the Phytozome database， 138 FvUGT family genes were identified， bioinformatics methods were used to analyze the protein properties， gene structure， conserved domains and evolutionary relationships of these FvUGT genes， and using real-time fluorescence quantitative PCR method to analyze the expression profiles of UFGT candidate genes in various tissues（root， petiole， leaf and fruit） of F. vesca（red fruit and white fruit）. 【Result】The FvUGT gene family could be divided into 12 subfamilies（A， C， D， E， F， G， H， I， J， K， L and N）， each of which contained 16，2，23，32，8，1，5，5， 7，3，21 and 4 members. Chromosomal localization analysis revealed that the coding genes of 138 FvUGT genefamily members were distributed on all chromosomes except chromosome 2， and the distribution was uneven.? The FvUGT gene intron length， exon position and number were different among different members， and the FvUGT family had a strong differentiation in the process of evolution. qRT-PCR found that the FvUFGT70 gene was highly expressed in leaves and petio-les. The FvUFGT94 gene was expressed in various tissues;FvUFGT67 and FvUFGT68 genes had higher expression in roots;FvUFGT95 and FvUFGT96 genes had expression in fruits， which was significantly higher than that of other tissues（P<0.05，the same below）. At the fruits small green stage， turning stage and ripe stage， and the expression levels of the two genes FvUFGT33 and FvUFGT95 in F. vesca red fruit were significantly higher than white fruit during the ripe stage. 【Conclusion】The 7 FvUFGT genes show obvious tissue differences， and FvUFGT33 and FvUFGT95 have high expression in fruit， and the expression in red fruit type is significantly higher than white fruit type. It is speculated that FvUFGT33 and FvUFGT95 play a role in the synthesis of anthocyanins.

Key words： Fragaria vesca; glycosyltransferase gene（UGT） family; gene structure; gene function; expression analysis

0 引言

【研究意義】草莓是薔薇科多年生草本植物，果實顏色美麗，其色澤由花色苷的種類和含量所決定。類黃酮糖基轉移酶（UDP-flavonoid glycosyltrans-ferase，UFGT）作為花色苷合成的關鍵酶（Boss et al.，1996），可催化花色素進行糖基化，形成穩(wěn)定的花色苷，其在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。因此，研究草莓糖基轉移酶（UDP-glucuronosyl transferas，UGT）家族進化關系及相關基因表達變化，對探索草莓UGT調(diào)控草莓果實發(fā)育及花色苷合成等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物UGT屬于GT1家族，C末端具有44個氨基酸的保守序列，稱為植物二級產(chǎn)物糖基轉移酶盒（PSPG盒），其負責糖基的結合（Caputi et al.，2012）。類黃酮、酚酸、萜類及植物激素等小分子化合物是植物UGT主要的糖基受體，UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖等是糖基供體（Lim et al.，2004;Bowles et al.，2006）。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)UGT作為多基因家族存在于植物中，并在許多植物物種中被研究（Li et al.，2001;Huang et al.，2015），在擬南芥中已鑒定出100多個UGT成員，在其他植物矮牽牛、葡萄和桃等物種中也得到鑒定（Miller et al.，1999;Jones et al.，2003;Ono et al.，2010;Cheng et al.，2014）。UFGT屬于UGT家族，能催化糖基轉移反應，催化很多代謝過程，作為花色苷合成過程中最后一個關鍵酶（Boss et al.，1996），可催化花色素進行糖基化，形成穩(wěn)定的花色苷，而花色苷的積累對植物細胞具有重要調(diào)控作用（Ayenew et al.，2015;Enoki et al.，2017）。研究表明，在葡萄顏色形成過程中，UFGT基因在紅色葡萄品種均能表達，但在白色品種中均不表達（Kobayashi et al.，2001;王軍和于淼，2010;Sun et al.，2016）;AcUFGT3a能使獼猴桃和蘋果的果實呈現(xiàn)紅色（Montefiori et al.，2011;Liu et al.，2017）;擬南芥UGT79B2和UGT79B3通過調(diào)控花色苷的合成而增強植物對低溫、鹽及干旱等非生物脅迫的抗性（Li et al.，2017）;還有研究發(fā)現(xiàn)FaGT1不僅參與花色苷的合成過程，還影響植物果實的成熟發(fā)育（Griesser et al.，2008a），在草莓中，F(xiàn)aGT6可催化槲皮素形成3-O-葡萄糖苷，而FaGT7能催化黃酮醇生成單糖苷（Griesser et al.，2008b）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關UGT家族基因在草莓果實發(fā)育成熟及花色苷合成中的作用鮮見研究報道?！緮M解決的關鍵問題】對森林草莓（Fragaria vesca L.）UGT基因（FvUGT）家族的基因結構、保守基序、系統(tǒng)進化及其表達特性等進行分析，為深入研究FvUGT基因功能、探索UGT調(diào)控草莓果實發(fā)育及花色苷等品質(zhì)形成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為森林草莓的紅果（紅皮紅肉，以下簡稱森林紅果）和白果（白皮白肉，以下簡稱森林白果）2種類型，種植于鄭州果樹研究所草莓基地，在2020年3—5月取樣。于生長盛期分別采集根、葉柄和葉;并在3個時期采集果實，即小綠期（開花后5～7 d）、轉色期（花后23～25 d）及成熟期（花后29～31 d）（圖1）。采3個生物重復樣品，在液氮中冷凍，并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 FvUGT基因家族基因獲取及其在染色體上的分布 將FvUGT基因家族基因輸入Phytozome數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）進行BLAST分析得到FvUGT基因家族的隱馬氏模型序列譜（PF00201），隨后，分析得到FvUGT基因家族的基因組序列、CDS序列和蛋白序列。通過ExPASy預測每種UGT蛋白的長度、分子量和理論等電點（pI）。在Phytozome數(shù)據(jù)庫中檢索獲取UGT染色體的信息（位置和長度），通過MapChart分析FvUGT基因家族基因在染色體上的分布情況

1. 2. 2 FvUGT基因家族的基因結構、基序、蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析和KEGG信號通路富集 根據(jù)FvUGT基因家族的CDS序列及其基因組DNA序列，利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）在線分析FvUGT基因家族基因的結構。采用MEME（http：//meme.sdsc.edu/meme/meme-in.tro.html）分析FvUGT基因家族基因的基序模式，將基序數(shù)設置為8，分析FvUGT基因家族基因的保守基序。使用ClustalW程序通過鄰接法（Neighbor-joining，NJ）對草莓與擬南芥的UGT氨基酸序列進行比對，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。將FvUGT基因家族基因的序列提交至KEGG數(shù)據(jù)庫，通過在線分析UGT基因家族主要參與的代謝途徑。

1. 2. 3 FvUFGT基因家族基因表達分析 取森林草莓的根、葉柄、葉和果實3個時期的樣品，在液氮中研磨，使用E.Z.N.A Plant RNA Kit（Omega USA）試劑盒提取森林草莓各樣品總RNA;參照TaRaKa反轉錄試劑，將總RNA反轉錄合成cDNA，并將cDNA稀釋到200 ng備用。利用Primer 5.0設計實時熒光定量PCR擴增引物（表1），以FvActin為內(nèi)參基因，檢測各樣品中FvUGT基因家族基因的表達情況。反應體系：15.0 μL： SYBR Green I Master Mix7.5 μL，正、反向引物各0.5 ?L，cDNA模板2.0 ?L，ddH2O 4.5 ?L。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 10 s，58 ℃20 s，進行43個循環(huán);72 ℃延伸20 s。每個樣品進行3次重復。目的基因相對表達量采用2-ΔΔCt進行換算（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行整理，并利用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)間的差異顯著性。

2 結果與分析

2. 1 FvUGT基因家族成員獲取及蛋白理化性質(zhì)分析

在Phytozome數(shù)據(jù)庫共檢索獲得138個UGT基因家族成員，分別命名FvUGT1～FvUGT138。FvUGT基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預測結果表明，F(xiàn)vUGT基因家族氨基酸序列長度為171～1751 aa，蛋白分子量為19.64～193.74 kD，F(xiàn)vUGT基因的理論等電點的范圍為4.43～9.54，其中126個蛋白理論等電點小于7.00，偏酸性，其余12個蛋白的大于7.00，偏堿性。FvUFGT蛋白不穩(wěn)定系數(shù)介于29.43～61.27，脂肪族氨基酸指數(shù)在75.52～102.63，GRAVY值在-0.486～0.123，有121個蛋白的疏水性小于0，而FvUGT16、FvUFGT33、FvUGT35和FvUFGT56等17個蛋白的疏水性大于0，表明這些蛋白是親水性蛋白。

2. 2 FvUGT基因家族基因在染色體上的分布情況

為了解FvUGT基因家族基因組分布，從植物基因組數(shù)據(jù)庫中檢索得到基因組注釋信息，分析FvUGT基因的染色體位置（圖2）。結果發(fā)現(xiàn)138個FvUGT基因在6個染色體上分布不均，其中FvUGT76、FvUGT77、FvUGT78、FvUGT79、FvUGT80和FvUGT-81等11個基因無法定位在具體的染色體上;6號染色體包含最多的FvUGT基因（37個成員），其次是位于3號染色體上的34個成員，分布基因最少的是1號染色體，僅6個基因，4號、5號和7號染色體上的FvUGT基因分布較零散（圖2）。

2. 3 FvUGT基因家族成員的基因結構和保守基序分析

利用GSDS對138個FvUGT基因的結構進行分析，發(fā)現(xiàn)外顯子的數(shù)量分布不均勻，包括1～29個（圖3）。外顯子數(shù)目最多的是FvUGT4基因，其基因的結構也最復雜，外顯子數(shù)目29個，內(nèi)含子數(shù)目28個;有54個FvUGT基因的結構比較簡單，只有1個外顯子。進化樹上聚在一起，表明親緣關系越近，F(xiàn)vUGT基因的結構越相似，但FvUGT基因外顯子位置和數(shù)目、內(nèi)含子長度在不同F(xiàn)vUGT基因家族成員間均存在差異，說明FvUGT基因家族成員的結構已發(fā)生一定分化。

為了解FvUGT基因家族基因的保守基序，通過MEME對FvUGT蛋白進行保守基序搜索，共獲得8個保守區(qū)域（圖4）。分析還發(fā)現(xiàn)，聚類在同一分支的FvUGT蛋白具有相似的基序組成，不同進化分支的基序組成存在差異，而保守基序的差異會引起基因功能的改變。聚類在同一分支的FvUGT蛋白，其基序相同，提示聚類在同一分支的不同蛋白功能可能相同。

2. 4 FvUGT基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育進化分析

為揭示FvUGT基因家族成員的同源進化關系，以擬南芥基因家族為參考，將草莓和擬南芥的UGT蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖5）。結果發(fā)現(xiàn)FvUGT基因家族可分為12個類群（A、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和N），每個類群分別包含16、2、23、32、8、1、5、5、57、3、21和4個成員（表2），每個類群均參照擬南芥亞群進行分類，其中B、D、E、F和L組的成員與類黃酮生物合成相關。根據(jù)FvUGT基因的注釋信息，推測D組的FvUGT5、FvUGT87、FvUGT90、FvUGT92、FvUGT93、FvUGT94、FvUGT95和FvUGT-96，E組的FvUGT67、FvUGT68、FvUGT70和FvUGT-74，以及F組的FvUGT33均屬于UFGT基因，并按原有編號（n）命名為FvUFGTn。

2. 5 KEGG信號通路富集分析

將138個FvUGT蛋白序列提交KEGG數(shù)據(jù)庫，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)vUGT蛋白參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成、苯丙烷生物合成、玉米素的生物合成和代謝等途徑（表3）。其中，有6個FvUGT蛋白參與玉米素的生物合成，10個FvUGT蛋白參與苯丙烷生物合成，19個FvUGT蛋白參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成，1個FvUGT蛋白參與類黃酮生物合成等。

2. 6 森林草莓FvUFGT基因表達分析

通過系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，從參與類黃酮相關的D、E和F亞族挑選7個FvUFGT基因，實時熒光定量PCR檢測結果（圖6）表明，7個FvUFGT基因表現(xiàn)出明顯的組織差異性，其中FvUFGT70基因在森林白果和森林紅果的葉和葉柄中均有表達，且在白果中的表達量顯著高于紅果（P<0.05，下同）;FvUFGT94基因在各組織中均有表達，但在森林紅果和森林白果的果實中差異不顯著（P>0.05）。FvUFGT67和FvUFGT68基因在根中有較高表達;FvUFGT33基因在森林紅果的果實中有較高表達，在森林白果的果實中有極低表達;FvUFGT95和FvUFGT96基因在果實中有表達，顯著高于其他組織。本研究通過實時熒光定量PCR分析森林草莓果實小綠期、轉色期和成熟期的表達變化，結果（圖7）顯示，隨著果實的生長，F(xiàn)vUFGT基因的表達模式不同。其中，F(xiàn)vUFGT33基因在森林紅果中隨著果實生長，其表達量越來越高，在成熟期達最高值，而其在森林白果整個果實發(fā)育階段表達量相對極低或不表達;FvUFGT95基因在草莓紅果中的相對表達量一直呈上升趨勢，而在森林白果中的相對表達量呈先上升后下降;在成熟期，F(xiàn)vUFGT33和FvUFGT95基因在森林紅果中的相對表達量顯著高于森林白果。

3 討論

本研究通過Phytozome數(shù)據(jù)庫在森林草莓中獲得138個FvUGT基因，發(fā)現(xiàn)FvUGT基因家族成員總數(shù)較黃瓜（85）和擬南芥（107）多（Li et al.，2001），但比茶（132）、梨（139）、玉米（147）、桃（168）、毛楊果（178）、小麥（179）、水稻（180）、葡萄（181）和蘋果（241）等作物中的UGT成員少（Caputi et al.，2012;Li et al.，2014;Cui et al.，2016;Wu et al.，2017;He et al.，2018）。在不同物種中，UGT家族成員的數(shù)量不同，可能與每個物種基因組中預測的基因總數(shù)和基因組總大小有關（Caputi et al.，2012）。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)vUGT基因家族基因在除2號染色體外的其他6條染色體上均有分布，且在染色體上分散分布。在擬南芥和棉花中也發(fā)現(xiàn)類似的UGT基因家族基因分布模式（Li et al.，2001;Huang et al.，2015）。內(nèi)含子雖然對蛋白氨基酸序列無貢獻，但其位置和數(shù)量會影響蛋白多樣性和整體細胞功能。通過內(nèi)含子的相對位置可預測某些線索，包括基因及其編碼蛋白進化關系，并進一步促進基因家族的多樣化（Rogozin et al.，2000;Li et al.，2014）。本研究中，138個FvUGT基因的內(nèi)含子數(shù)量不同（1～28），其中內(nèi)含子數(shù)目最多的是FvUGT4基因，為28個，其基因的結構也最復雜。在138個已鑒定的FvUGT基因中，有39%缺乏內(nèi)含子，與于擬南芥、亞麻和玉米的報道一致，其分別有58%、55%和60%缺乏內(nèi)含子（Li et al.，2001;Barvkar et al.，2012）。

利用實時熒光定量PCR對7個FvUFGT基因在森林草莓各組織中的表達情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)FvUFGT基因在不同組織中有不同的表達，表明不同基因在不同部位發(fā)揮作用。FvUFGT94基因在森林紅果和森林白果2種不同類型的果實中的表達量無顯著差異，在各組織中有較高表達，可能參與草莓的整個生長發(fā)育過程;FvUFGT67和FvUFGT68基因在根中有較高表達，推測該基因會影響森林草莓根的生長發(fā)育;FvUFGT95和FvUFGT96基因在果實中有較高表達水平，推測其影響森林草莓果實生長。FvUFGT基因不僅在森林草莓果實中表達，在其他組織也均有表達，且表達量較高，推測FvUFGT基因除了在果實中參與花色苷合成，還可能在其他組織中參與類黃酮糖基化。在其他類似研究中，日本牽牛花UFGT基因不僅參與花色苷的合成，對花色素的糖基化和?；财鹱饔茫∕orita et al.，2015）;矮牽牛中的UFT79B31基因可調(diào)控花粉的類黃酮糖基化（Knoch et al.，2018）;草莓中UGT71K3也會影響葡萄糖?；g苯三酚的含量（Song et al.，2016）。本研究通過對FvUFGT基因在果實不同發(fā)育期的表達分析，發(fā)現(xiàn)FvUFGT33和FvUFGT95基因在森林草莓紅果成熟期表達水平極高，而在森林草莓白果成熟期表達量低，推測這2個基因在花色苷合成中發(fā)揮作用。這與許多研究結果類似，如在紅色和白色葡萄相關研究中發(fā)現(xiàn)，UFGT基因在紅色品種中表達，而在白色品種中不表達（Kobayashi et al.，2001;王軍和于淼，2010;Sun et al.，2016）;刺葡萄轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，UFGT基因在黑果刺葡萄中有較高表達，而在白果刺葡萄中不表達。

4 結論

7個FvUFGT基因表現(xiàn)出明顯的組織差異性，其中FvUFGT33和FvUFGT95基因在果實中有較高表達量，且在森林草莓紅果類型表達量顯著高于白果類型，故推測其在花色苷合成中發(fā)揮作用。

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（責任編輯 鄧慧靈）