水牛Tle6基因表達(dá)模式分析及其多克隆抗體制備

陳東榮 黃星晨 張俊俊 楊維菡 張明 付強(qiáng)

摘要：【目的】明確水牛Tle6基因表達(dá)組織特異性及其在卵母細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)模式，并通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白及免疫小鼠制備TLE6多克隆抗體，為進(jìn)一步揭示Tle6基因在水牛生殖發(fā)育中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎肦T-PCR擴(kuò)增水牛Tle6基因編碼區(qū)（CDS）序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析后，分別以半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分析水牛Tle6基因表達(dá)組織特異性及其在卵母細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)模式。構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白免疫小鼠制備TLE6多克隆抗體，再利用TLE6多克隆抗體檢驗(yàn)TLE6蛋白在水牛不同組織及卵母細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)情況。【結(jié)果】水牛Tle6基因CDS序列全長(zhǎng)1731 bp，編碼576個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為64.09 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.69，屬于親水性蛋白。Tle6基因僅在水牛的卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)。重組原核表達(dá)載體pET-32a-Tle6轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6 h，融合蛋白TLE6的表達(dá)量最高，且以可溶性蛋白和包涵體2種形式進(jìn)行表達(dá);以純化的融合蛋白TLE6免疫小鼠成功制備獲得TLE6多克隆抗體，其抗體效價(jià)為1∶64000，能與融合蛋白TLE6及水牛卵母細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，即具有很強(qiáng)的特異性?！窘Y(jié)論】Tle6基因僅在水牛卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)，而在其他組織中未見表達(dá)。不同于其他MEGs的表達(dá)模式，Tle6基因在水牛卵母細(xì)胞及胚胎早期發(fā)育過(guò)程中呈特異性持續(xù)表達(dá)，可能在水牛卵母細(xì)胞成熟及附植前的胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 水牛;Tle6基因;卵母細(xì)胞;胚胎;多克隆抗體;母源效應(yīng)基因

Abstract：【Objective】Characterization of the Tle6 gene expression profile and its expression in different tissues， oocytes and preimplantation embryos in buffalo were studied. TLE6 polyclonal antibody was prepared by constructing a prokaryotic expression vector with induced fusion protein expression and immuned mice. This study laid the foundation for studying the function and regulation mechanism of Tle6 gene in buffalo reproduction development. 【Methods】The sequence of Tle6 gene coding region（CDS） of buffalo was amplified by RT-PCR. After bioinformatics analysis， a prokaryo-tic expression vector was constructed. The mouse were immunized by IPTG induced TLE6 recombinant protein for preparing the polyclonal antibody. The expression profiles of TLE6 protein in different tissues， oocytes and preimplantation embryos of buffalo was examined using TLE6 polyclonal antibody. 【Result】The CDS sequence of buffalo Tle6 gene consisted of 1731 bp， encoding 576 amino acids with the molecular weight of 64.09 kD and isoelectric point（pI） of 5.69. The TLE6 protein belonged to a hydrophilic protein. The Tle6 gene was specificly expressed in oocytes of buffalo. The recombinant pET-32a-Tle6 prokaryotic expression vector was transfer to BL21（DE3） competent cell. TLE6 protein had highest expression by 6 h IPTG induced. TLE6 protein was expressed in two forms：soluble protein and inclusion body. The TLE6 polyclonal antibody was prepared successfully by purified fusion protein TLE6 immunity mouse. The antibody titer was 1∶64000. It had specific reactions with the fusion protein TLE6 and buffalo oocytes， with strong specificity. 【Conclusion】The Tle6 gene is specifically expressed only in buffalo oocytes and is not expressed in other tissues. Different from other MEGs expression pattern， the buffalo Tle6 gene continuously expresses in oocytes and preimplantation embyros， indica-ting that may be function in oocyte maturation and preimplantation embryo development in buffalo.

Key words： buffalo; Tle6 gene; oocyte; embryo; polyclonal antibody; maternal effect genes

0 引言

【研究意義】Tle6（Transducin like enhancer 6）基因是在哺乳動(dòng)物中新發(fā)現(xiàn)的母源效應(yīng)基因（Maternal effect genes，MEGs），其編碼蛋白TLE6稱為轉(zhuǎn)錄素樣增強(qiáng)子6，與Floped、Mater和Filia基因的編碼蛋白在小鼠卵母細(xì)胞及早期胚胎中組成母源效應(yīng)復(fù)合體（Subcortical maternal complex，SCMC）（Li et al.，2008）。SCMC是一種在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞及早期胚胎中特異表達(dá)的多蛋白復(fù)合物，其成分均由MEGs編碼（Li et al.，2008），可能是哺乳動(dòng)物母源調(diào)控向合子調(diào)控轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵樞紐，對(duì)早期胚胎發(fā)育具有調(diào)控作用（王夢(mèng)月和周紅林，2012;Bebbere et al.，2016;王曉晴等，2018）。因此，深入研究水牛Tle6基因的生物學(xué)功能對(duì)揭示其在水牛卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育中的作用機(jī)理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Tle6基因?qū)儆贕roucho/TLE轉(zhuǎn)錄共抑制基因家族成員（Jennings and Ish-Horowicz，2008），該家族包含6個(gè)主要成員基因（Tle1～Tle6）。Tle1～Tle4基因是全長(zhǎng)基因，而Tle5和Tle6基因是可抑制Tle1～Tle4基因功能的短型基因（Feng et al.，2020）。早期研究發(fā)現(xiàn)，Tle6基因可調(diào)節(jié)小鼠和綿羊的早期胚胎發(fā)育及細(xì)胞分裂（Bebbere et al.，2014）;在敲除Tle6基因的雌性小鼠中，其早期胚胎停滯在2-細(xì)胞階段，雌性小鼠繁殖能力完全喪失，進(jìn)一步證實(shí)Tle6基因是胚胎發(fā)育過(guò)程中2-細(xì)胞期所必需的MEGs。TLE6是在小鼠卵母細(xì)胞及早期胚胎中形成SCMC的必需蛋白，具有調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架而控制受精卵對(duì)稱分裂的作用（Yu et al.，2014）。TLE6和SCMC共定位于卵母細(xì)胞及早期胚胎皮質(zhì)下（Zhu et al.，2015）;TLE6還是一種環(huán)磷酸腺cAMP依賴性蛋白激酶A底物，在減數(shù)分裂恢復(fù)后被磷酸化（Duncan et al.，2014）。TLE6磷酸化由蛋白激酶A調(diào)控（Duncan et al.，2014;王曉晴等，2018），但具體的生理學(xué)意義有待進(jìn)一步探究。Alazami等（2015）、Lin等（2020）研究表明，Tle6基因突變會(huì)導(dǎo)致卵裂期胚胎發(fā)育停滯，究其原因是由于TLE6與蛋白激酶A的相關(guān)位點(diǎn)不能被磷酸化。Wang等（2018）、Mohebi和Ghafouri-Fard（2019）在反復(fù)流產(chǎn)婦女的卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Tle6基因突變，其表型與敲除Tle6基因小鼠的表型相似。Bebbere等（2020）研究表明，Tle6基因在綿羊青年及成年期的卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄活躍，且綿羊年齡與卵母細(xì)胞mRNA豐度呈負(fù)相關(guān)。Feng等（2020）研究發(fā)現(xiàn)敲除Tle6基因后小鼠精原細(xì)胞增殖緩慢，即Tle6基因可調(diào)控精原細(xì)胞的增殖及其細(xì)胞周期?？梢姡琓le6基因在動(dòng)物生殖發(fā)育中起關(guān)鍵作用，且在細(xì)胞及胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)Tle6基因的研究主要集中在人類和小鼠上，而有關(guān)Tle6基因?qū)λＢ涯讣?xì)胞及早期胚胎發(fā)育影響的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆水牛Tle6基因編碼區(qū)（CDS）序列，采用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)分析Tle6基因表達(dá)的組織特異性及其在卵母細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)模式，并通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白及免疫小鼠而獲得TLE6多克隆抗體，以期為進(jìn)一步揭示Tle6基因在水牛生殖發(fā)育中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

水牛卵巢等組織取自南寧市肉聯(lián)廠屠宰分廠;大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;高保真酶及膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;RNA微量提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T載體、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司;HRP標(biāo)記馬抗小鼠IgG和FITG驢抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

從NCBI下載水牛Tle6基因（XM_025293142.1），采用SnapGene設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1）。所有引物均委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

通過(guò)RNA微量提取試劑盒提取水牛卵母細(xì)胞總RNA，采用TRIzol法提取水牛大腦、心臟、肝臟及腎臟等組織總RNA，檢測(cè)總RNA的濃度和純度后，以cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系25.0 μL：cDNA模板2.0 μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，RNase-free H2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，確定擴(kuò)增目的片段正確后，向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入10.0 μL 2×Rapid Taq Master Mix，72 ℃作用20 min，即加poly（A）尾。通過(guò)膠回收試劑盒回收目的片段，連接至pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并平鋪于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)12 h后挑選單一菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性菌落送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。

1. 5 Tle6基因生物信息學(xué)分析

采用SeqMan將測(cè)序結(jié)果拼接成完整的Tle6基因CDS序列，通過(guò)MegAlign進(jìn)行同源比對(duì)分析，基于Tle6氨基酸序列相似性以MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale及SWISS-MODEL等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1. 6 半定量PCR檢測(cè)分析

采集水牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、脊髓、舌頭、喉嚨、胃、肌肉、脂肪、睪丸、子宮和卵巢等組織樣品及卵母細(xì)胞，提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)分析，具體PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同1.4，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1. 7 原核表達(dá)載體構(gòu)建

通過(guò)RNA微量提取試劑盒提取水牛卵母細(xì)胞總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參考Tle6基因抗原表位及免疫原性，采用SnapGene設(shè)計(jì)含限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III位點(diǎn)引物（5'-CGGAATTCGGGA TCCAGGAGCATCTCAAGCA-3'和5'-CCCAAGCTT GGACGTCTTCGAAGTCTAGATCCTG-3'）（劃線部分為酶切位點(diǎn)），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將酶切獲得的目的片段連接至pMD18-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-Tle6，然后雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-Tle6和原核表達(dá)載體pET-32a（+），按3∶1的比例在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接6～8 h，接種至LB培養(yǎng)基上，挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定。

1. 8 融合蛋白表達(dá)及純化

以測(cè)序正確的重組原核表達(dá)載體pET-32a-Tle6轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，搖床培養(yǎng)至菌液OD600 nm達(dá)0.6左右時(shí)加入最終濃度0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃下誘導(dǎo)6 h，加入溶解酶，在液氮中反復(fù)凍融裂解菌體，12000 r/min離心2 min，分別收集上清液和包涵體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。采用Ni-NTA親和層析柱純化可溶性融合蛋白，并以His標(biāo)簽進(jìn)行鑒定。

1. 9 多克隆抗體制備與鑒定

將純化后的融合蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合，勻漿乳化，于小鼠背部皮下多點(diǎn)注射1 mL;第2次免疫及以后的加強(qiáng)免疫均采用弗氏不完全佐劑與融合蛋白等體積混合乳化。共免疫4次，最后1次免疫后間隔7 d采集小鼠血清樣品，-80 ℃保存。使用Western blotting檢驗(yàn)TLE6多克隆抗體效價(jià)，同時(shí)以TLE6多克隆抗體為一抗檢驗(yàn)TLE6蛋白在水牛卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞及腦、心臟、腎臟和肌肉等組織中的特異性表達(dá)情況。收集300枚GV期的水牛卵母細(xì)胞及一定量的顆粒細(xì)胞，通過(guò)液氮反復(fù)凍融提取蛋白;腦、心臟、腎臟和肌肉等組織通過(guò)液氮研磨，加入800 μL含1%苯甲基磺酰氟（PMSF）的細(xì)胞裂解液RIPA提取蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳后置于半干轉(zhuǎn)機(jī)上轉(zhuǎn)膜90 min，以5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，加入制備的TLE6多克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌4次，每次5 min;加入HRP標(biāo)記馬抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST洗滌4次，每次5 min;堿性磷酸酯酶顯色后進(jìn)行成像分析。

1. 10 卵母細(xì)胞及早期胚胎免疫熒光染色

將收集的水牛卵母細(xì)胞和早期胚胎分別用含0.1%聚乙烯醇（PVA）的DPBS漂洗3次，4%多聚甲醛溶液固定30 min后以含0.1% PVA的DPBS漂洗3次;轉(zhuǎn)移至1% Triton X-100室溫透膜8 h，再用含0.1% PVA的DPBS漂洗3次;室溫下用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封閉2 h，將水牛卵母細(xì)胞和早期胚胎轉(zhuǎn)移至1∶400的抗體血清稀釋液（一抗）中，4 ℃孵育過(guò)夜;用含0.1% Tween-20和0.01% Triton X-100的PBS漂洗3次，每次漂洗時(shí)間不少于5 min;然后將水牛卵母細(xì)胞和早期胚胎轉(zhuǎn)移至以PBS（含1% BSA）稀釋的FITC驢抗小鼠IgG中，室溫避光孵育1 h，同樣方法漂洗5次，每次5 min;最后滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察及拍照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 水牛Tle6基因克隆及測(cè)序分析結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到的條帶（圖1）與預(yù)期結(jié)果相符，采用SeqMan將3段測(cè)序結(jié)果拼接成完整的CDS序列，得到水牛Tle6基因CDS序列全長(zhǎng)1731 bp，編碼576個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為64.09 kD。

2. 2 水牛Tle6基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果

從NCBI上搜索并下載綿羊（XM_027970670.1）、山羊（XM_018050789.1）、牛（XM_010807024.3）、野豬（XM_021084149.1）、大鼠（XM_032909218.1）、小鼠（NM_053254.2）、獼猴（XM_028839646.1）、人類（XM_005259645.2）和倭黑猩猩（XM_008972692.1）等物種的Tle6核苷酸序列，通過(guò)MegAlign進(jìn)行同源比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果（圖2）顯示，水牛Tle6核苷酸序列與牛、山羊、綿羊和野豬的Tle6核苷酸序列相似性分別為97.5%、95.8%、95.6%和81.5%。

2. 3 水牛TLE6蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果

水牛TLE6蛋白分子量為64.09 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.69，分子式為C2824H4365N801O862S24。ExPasy ProtScale預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，水牛TLE6蛋白親水性平均系數(shù)為-0.447，屬于親水性蛋白。通過(guò)PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)水牛TLE6蛋白功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)該蛋白是由2種結(jié)構(gòu)域組成，較前端是復(fù)雜程度低的簡(jiǎn)單序列，后端是重復(fù)的WD40結(jié)構(gòu)域，屬于轉(zhuǎn)錄輔阻遏蛋白家族成員。通過(guò)DNASTAR對(duì)水牛TLE6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)包含24個(gè)α-螺旋、46個(gè)β-折疊、43個(gè)β-轉(zhuǎn)角及43個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲。SWISS-MODEL預(yù)測(cè)結(jié)果（圖6）表明，水牛TLE6蛋白以α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)為主。

2. 4 Tle6基因在水牛不同組織中的表達(dá)情況

由圖7可知，Tle6基因僅在水牛的卵母細(xì)胞中表達(dá)，在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、脊髓、舌頭、喉嚨、胃、肌肉、脂z肪、睪丸、子宮及卵巢等組織中均不表達(dá)。

2. 5 水牛Tle6基因原核表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果

采用含酶切位點(diǎn)的引物對(duì)水牛Tle6基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得198 bp目的片段，連接至經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶切后的原核表達(dá)載體pET-32a（+）上，即獲得重組原核表達(dá)載體pET-32a-Tle6，然后轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞并接種至LB培養(yǎng)基上，挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，再以含酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果在200 bp附近獲得1條明亮清晰的單一條帶（圖8），與預(yù)期結(jié)果相符，說(shuō)明水牛Tle6基因已插入原核表達(dá)載體pET-32a（+）。送至深圳華大基因科技有限公司的測(cè)序結(jié)果也表明，水牛Tle6基因已正確插入原核表達(dá)載體pET-32a（+），即成功構(gòu)建獲得重組原核表達(dá)載體pET-32a-Tle6。

2. 6 融合蛋白TLE6誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果

重組原核表達(dá)載體pET-32a-Tle6轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6 h，融合蛋白TLE6的表達(dá)量達(dá)最高值，以可溶性蛋白和包涵體2種形式進(jìn)行表達(dá)。由于可溶性蛋白的純化過(guò)程較包涵體的簡(jiǎn)便，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇可溶性蛋白（上清液）為研究對(duì)象。融合蛋白TLE6經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化，其SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示約在25.00 kD處出現(xiàn)預(yù)期的目的蛋白條帶（圖9-A），且純化后融合蛋白TLE6的雜帶較未純化融合蛋白明顯減少，即蛋白純化效果良好，可用于免疫小鼠制備多克隆抗體。以His標(biāo)簽檢驗(yàn)復(fù)性后的可溶性融合蛋白TLE6，Western blotting檢驗(yàn)結(jié)果顯示得到1條約25.00 kD的特異性目的條帶（圖9-B），進(jìn)一步說(shuō)明融合蛋白TLE6純化效果良好。

2. 7 TLE6多克隆抗體效價(jià)

以純化的融合蛋白TLE6免疫小鼠制備TLE6多克隆抗體（血清），按梯度等比（1∶1000～1∶64000）稀釋后，與融合蛋白TLE6進(jìn)行Western blotting檢測(cè)分析，結(jié)果（圖10）顯示在25.00 kD附近能檢測(cè)到預(yù)期的目的條帶，表明已成功制備獲得TLE6多克隆抗體，其抗體效價(jià)為1∶64000。

2. 8 TLE6蛋白在水牛不同組織中的表達(dá)情況

以TLE6多克隆抗體為一抗，按1∶8000稀釋后用于檢測(cè)TLE6蛋白在水牛不同組織及卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，TLE6蛋白僅在水牛卵母細(xì)胞中表達(dá)（圖11），在其他細(xì)胞和組織中均無(wú)表達(dá)分布（圖12），其目的蛋白大小為64.00 kD。在水牛卵母細(xì)胞樣品中，目的蛋白條帶單一且無(wú)雜帶，表明制備獲得的TLE6多克隆抗體具有很強(qiáng)特異性。

2. 9 TLE6蛋白在水牛卵母細(xì)胞及早期胚胎中的表達(dá)情況

為進(jìn)一步確定TLE6蛋白在水牛卵母細(xì)胞中的表達(dá)情況，分別收集不同發(fā)育期的水牛卵母細(xì)胞及早期胚胎進(jìn)行免疫熒光染色。免疫熒光染色結(jié)果（圖13）顯示，在不同發(fā)育期的水牛卵母細(xì)胞及早期胚胎中均能發(fā)現(xiàn)TLE6蛋白熒光信號(hào)，表明TLE6蛋白在水牛卵母細(xì)胞成熟過(guò)程持續(xù)表達(dá)，但呈逐漸降低的變化趨勢(shì)，故推測(cè)TLE6在水牛卵母細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色。

3 討論

Tle6基因是Groucho/TLE轉(zhuǎn)錄共抑制基因家族成員之一，在小鼠胚胎和成年鼠的組織中廣泛表達(dá)（Dang et al.，2001）。Tle6基因于2005年首次在發(fā)育中的人類大腦皮層神經(jīng)祖細(xì)胞中被鑒定（Li et al.，2008）。Bebbere等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，TLE6蛋白僅在綿羊卵母細(xì)胞及胚胎中表達(dá)，在其他胚泡、肺臟、肌肉、腎臟、小腦、睪丸、卵巢、脾臟、肝臟及心臟等組織中均未檢測(cè)到相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本;而Zhu等（2015）研究發(fā)現(xiàn)人類的TLE6轉(zhuǎn)錄本在卵巢和腎臟中高表達(dá)。TLE6能與MATER、FLOPED和FILIA等已證實(shí)的母源性蛋白結(jié)合形成SCMC。TLE6與SCMC的其他成員一樣定位于小鼠卵母細(xì)胞及早期胚胎的皮質(zhì)下，在Tle6基因缺失小鼠中無(wú)法形成SCMC，導(dǎo)致紡錘體偏移，最終產(chǎn)生大量不均等的2-細(xì)胞胚胎，隨后胚胎發(fā)育停滯（Yu et al.，2014），即Tle6基因是小鼠的MEGs。至今，Tle6基因功能僅在小鼠中被證實(shí)，針對(duì)大型家畜的Tle6基因功能尚無(wú)研究報(bào)道，其在水牛卵母細(xì)胞及胚胎早期發(fā)育過(guò)程中是否作為母源性基因有待進(jìn)一步探究。

本研究結(jié)果表明，Tle6基因僅在水牛卵母細(xì)胞中表達(dá)，在其他組織均無(wú)表達(dá)，揭示Tle6基因在水牛卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色，與已報(bào)道的小鼠Tle6基因（Yu et al.，2014）一致。水牛Tle6核苷酸序列與牛、山羊、綿羊和野豬的Tle6核苷酸序列相似性分別為97.5%、95.8%、95.6%和81.5%，說(shuō)明Tle6基因具有較高的保守性。小鼠TLE6蛋白包含581個(gè)氨基酸殘基，分子量為65.00 kD（Feng et al.，2020）;而水牛TLE6蛋白由576個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量為64.09 kD，屬于親水性蛋白，說(shuō)明Tle6基因在不同物種間的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)也有所不同。TLE6蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其具有5個(gè)色氨酸—天冬氨酸重復(fù)單元（WD）（Li and Roberts，2001），但缺少與Groucho/TLE寡聚化有關(guān)的2個(gè)與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的氨基酸，能介導(dǎo)并參與大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子（羧基末端的WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域）的相互作用（Marcal et al.，2005）。

在小鼠中，Tle6基因轉(zhuǎn)錄本在卵母細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程中積累，于生發(fā)泡破裂期（GV）達(dá)高峰，從減數(shù)分裂成熟和排卵后開始降解，在胚胎發(fā)生過(guò)程中完全消失;但TLE6蛋白在植入前的胚胎中一直持續(xù)表達(dá)至囊胚階段（Li et al.，2008）。本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Tle6基因水牛卵母細(xì)胞發(fā)育至桑椹胚前均有表達(dá)，且以4-細(xì)胞期的相對(duì)表達(dá)量最高，隨后開始呈下降趨勢(shì)，在桑椹胚階段其相對(duì)表達(dá)量急劇下降，至囊胚期未能檢測(cè)到Tle6基因表達(dá)，揭示Tle6基因在水牛卵母細(xì)胞生成及胚胎早期發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮一定功能作用，但不同于小鼠Tle6基因的表達(dá)模式，故推測(cè)水牛Tle6基因并非MEGs。

本研究選擇常用的大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞為表達(dá)菌株，采用含His標(biāo)簽的pET-32a（+）載體為原核表達(dá)載體，His標(biāo)簽可鑒定融合蛋白是否正確表達(dá)（陳東榮等，2020）。融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式主要有2種：（1）胞外分泌可溶性蛋白，易純化，保留融合蛋白的天然結(jié)構(gòu)，簡(jiǎn)單透析除去鹽分便可于免疫試驗(yàn);（2）胞內(nèi)表達(dá)的無(wú)活性包涵體，需經(jīng)復(fù)雜的變性、復(fù)性程序才能得到有活性的融合蛋白。IPTG濃度是影響融合蛋白TLE6表達(dá)的主要因素之一，本研究的預(yù)試驗(yàn)通過(guò)設(shè)0.05～1.00 mmol/L共11個(gè)IPTG濃度梯度誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以0.5 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)效果最佳。此外，本研究采用30 ℃作為誘導(dǎo)溫度，可降低融合蛋白誘導(dǎo)合成的速率，而有利于提高融合蛋白的可溶性表達(dá)。以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的純化融合蛋白TLE6免疫小鼠，成功制備獲得TLE6多克隆抗體，其抗體效價(jià)為1∶64000，能與融合蛋白TLE6及水牛卵母細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，即具有很強(qiáng)的特異性，為深入研究TLE6蛋白在水牛卵母細(xì)胞及早期胚胎中的功能作用提供了技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

Tle6基因僅在水牛卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)，而在其他組織中未見表達(dá)。不同于其他MEGs的表達(dá)模式，Tle6基因在水牛卵母細(xì)胞及胚胎的早期發(fā)育過(guò)程呈特異性持續(xù)表達(dá)，可能在水牛卵母細(xì)胞成熟及附植前胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）