真空熟制咸鴨蛋“黑圈”產(chǎn)生的原因分析

李秋雨，劉紅梅，李彥，戴幽，李慧中，劉焱*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南長沙 410128）（2.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)中心，湖南長沙 410128）（3.芷江侗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南懷化 419100）（4.長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南長沙 410128）

咸蛋又稱腌蛋、鹽蛋，是一種風味特殊、食用方便的傳統(tǒng)蛋制品，因其質(zhì)地細軟、松沙、蛋白粉嫩雪白、蛋質(zhì)豐潤鮮紅、食味鮮美、可口、營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛[1-3]。近年來，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，人們對方便食品的需求越來越多，而咸蛋傳統(tǒng)的消費習慣（即買腌制好的咸蛋，回家洗去泥糠或黑灰再煮制食用）不受歡迎，大多數(shù)咸蛋加工企業(yè)會在咸蛋腌制成熟后將咸蛋清洗干凈再真空包裝后進行殺菌處理加工成真空熟制咸蛋再銷售。真空熟制咸蛋具有開袋即食、食用方便的特點，符合生活節(jié)奏快的當代人的需求，其產(chǎn)量也越來越大[4]。但真空熟制咸蛋的工業(yè)化生產(chǎn)中存在一個普遍且嚴重的問題：“黑圈”現(xiàn)象，即靠近蛋清的蛋黃顏色有一部分由黃色或橙黃色變?yōu)榘迭S綠色，嚴重的甚至變?yōu)楹谏?，這種現(xiàn)象俗稱“黑圈”。咸蛋黃發(fā)生“黑圈”現(xiàn)象，不僅影響咸蛋黃的外觀，使消費者對其品質(zhì)產(chǎn)生質(zhì)疑，更影響了產(chǎn)品的商業(yè)價值，不利于咸鴨蛋的銷售，從而限制了咸蛋產(chǎn)業(yè)的擴大發(fā)展，解決咸鴨蛋“黑圈”現(xiàn)象迫在眉睫。雖然有不少研究人員從工藝上來改進咸蛋的品質(zhì)，但收效甚微。還有不少研究中涉及到了咸蛋黃的顏色、蛋白質(zhì)狀態(tài)、脂肪、金屬離子變化等各個方面，但并沒有關(guān)于咸蛋“黑圈”現(xiàn)象的直接研究。因此，本課題以真空熟制咸鴨蛋為研究對象，對黑圈蛋黃的黑圈部位及非黑圈蛋黃的相應(yīng)部位進行理化分析，初步確定與黑圈形成有關(guān)的物質(zhì)及其變化規(guī)律，探索真空熟制咸鴨蛋“黑圈”現(xiàn)象形成的原因，為解決熟制咸蛋發(fā)生“黑圈”問題提供重要的理論依據(jù)，這對促進咸蛋加工業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

腌制成熟的咸鴨蛋（65～75 g/個），由湖南洞庭湖蛋業(yè)食品有限公司提供；低分子量蛋白質(zhì)Marker（15～180 ku）、BCA 蛋白定量試劑盒，上海雅酶生物科技有限公司；除金屬離子的卵黃高磷蛋白純品，sigma-aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；其他所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

真空冷凍干燥機（Alpha1-2），德國Martin Christ技術(shù)公司；掃描電子顯微鏡（JSM-6380LV），日本電子；紫外分光光度計（UV-2450），日本島津公司；原子吸收分光光度計（AA-7000），島津企業(yè)管理（中國）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52C），鞏義予華有限公司；測色色差計（CR-400），日本柯尼卡美能達公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

1.2.1.1 理化成分及其性質(zhì)的測定

對黑圈蛋蛋黃的黑圈部位、未變色部位、同一批次非黑圈蛋蛋黃的相應(yīng)部位的水分含量[5]、蛋白質(zhì)含量[6]、脂肪含量[7]、鹽分[8]、色素、硫離子、鐵（Fe）[9]、銅（Cu）[10]、鋅（Zn）[11]、鉛（Pd）[12]、錳（Mn）[13]和硒（Se）[14]以及pH[15]值進行對比分析，測定黑圈蛋各部位的蛋白質(zhì)組分并觀察蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)變化，確定與黑圈形成有關(guān)的物質(zhì)變化規(guī)律，找出與黑圈形成可能有關(guān)的影響因素。每個指標的測定分別取20 個“黑圈”蛋和非“黑圈”蛋。

1.2.1.2 與黑圈形成有關(guān)的純物質(zhì)呈色反應(yīng)

（1）蛋黃的各個組成成分與硫離子的呈色反應(yīng)

分離蛋黃的組成成分（色素、脂肪、水溶性蛋白質(zhì)、蛋黃顆粒、高密度脂蛋白、卵黃高磷蛋白）將其與5%的Na2S 進行反應(yīng)，觀察各組成成分顏色的變化。

（2）金屬離子與硫離子間的呈色反應(yīng)

分別取濃度為5 μg/g、10 μg/g、50 μg/g、100 μg/g的Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Pd2+、Mn2+以及Se2+，將其與質(zhì)量濃度為10%的Na2S 溶液反應(yīng)，觀察其顏色的變化。

（3）不同pH 對色素顏色的影響

取20 mL 丙酮提取的色素粗提液于燒杯中，用0.1 mol/L 的NaOH 和0.1 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)其pH，使色素粗提液的pH 分別為6、7、8，觀察色素粗提物顏色的變化。

1.2.1.3 影響咸蛋黃顏色變化的因素

（1）金屬離子與黑圈程度的相關(guān)性研究

根據(jù)蛋黃黑圈程度的不同，將蛋黃樣品分為四個層次（黑：ΔE*=65～75、較黑：ΔE*=55～65、微黑；ΔE*=50～55 微黑、未變黑：ΔE*=45～50）進行取樣。將試驗樣品分別置于研缽中，研磨均勻，然后對不同黑圈程度樣品的色度值及金屬離子（Fe、Cu、Zn、Pd、Mn 和Se）的含量進行測定，并對黑圈程度與金屬離子含量的關(guān)系進行相關(guān)性分析，以探究金屬離子對鴨蛋黃“黑圈”現(xiàn)象的影響。

（2）硫離子對咸蛋黃顏色變化的影響

取5 g 非黑圈蛋蛋黃于康衛(wèi)氏皿的內(nèi)室，外室分別放置以下溶液：a：5% (NH4)2S、b：5% Na2S+HCl、c：5% CdSO4，另取黑圈蛋的黑圈部位5 g，置于康衛(wèi)氏皿的內(nèi)室，外室分別放置以下溶液：d：5% (NH4)2S、e：5% Na2S+HCl、f：5% CdSO4，觀察咸蛋黃顏色的變化，探究硫離子對咸蛋黃顏色變化的影響。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 色素的提取與測定

色素粗提物的制備參照孫丹丹等[16]、安曉寧[17]的方法進行。將得到的色素提取物溶于丙酮，定容于100 mL 容量瓶中，在450 nm 波長處測吸光度值。

1.2.2.2 硫離子的測定

參考李樹青等[18]的測定方法進行。

1.2.2.3 金屬離子的測定

通過原子吸收分光光度計采用火焰原子吸收法進行測定?？招年帢O燈電流12 mA，狹縫寬0.2 nm，助燃器乙炔-空氣火焰。

1.2.2.4 蛋白質(zhì)組分的變化

采用SDS-PAGE 凝膠電泳進行分析。參考王世東等[19]的方法。

1.2.2.5 微觀結(jié)構(gòu)的變化

采用電子掃描顯微鏡進行分析。參照邱思[20]的方法并稍作修改：分別取黑圈蛋的黑圈部位與非黑圈部位，冷凍干燥，裱涂200? 金鈀合金，用掃描電子顯微鏡進行研究。

1.2.2.6 咸蛋黃各個成分的分離方法

（1）脂肪的提取

將蛋黃與適量的石油醚混合，4℃下浸泡過夜，過濾，蒸發(fā)濃縮，即得脂肪樣品。

（2）蛋黃漿質(zhì)蛋白、高密度脂蛋白和卵黃高磷蛋白的分離提取

將蛋黃與10 倍質(zhì)量的蒸餾水混合，4℃下浸泡過夜，過濾，將濾液凍干，即得蛋黃漿質(zhì)蛋白。高密度脂蛋白和卵黃高磷蛋白的分離提取參照于智慧[21]的方法進行

1.2.2.7 黑圈色度的測定

分離熟制黑圈蛋的黑圈部位，攪拌均勻，立即測其色差值（ΔE* ）。其中，ΔE*=[(ΔL*)2+(Δ a*)2+(Δb*)2]1/2，ΔE*表示樣品的總色差，其值越大表明樣品間的色差越大，ΔL*、Δa*、Δb*的負正分別表示樣品顏色的深淺、綠紅、藍黃[22,23]。每個樣品測量5 次，取其平均值。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標準偏差的表示方式，并用DPS 19.0 進行統(tǒng)計學分析，通過Duncan 多重分析進行組間顯著性檢驗，顯著水平為p<0.05；利用Origin 8.5 軟件進行繪制試驗結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑圈蛋與非黑圈蛋理化特性對比分析

2.1.1 黑圈蛋與非黑圈蛋不同部位理化成分分析

由表1 可知，A、A0、B、B0的水分、鹽分、脂肪及色素雖存在顯著性差異（p<0.05），但其在黑圈蛋與非黑圈蛋各部位中的分布情況相似，均為A(A0)>B(B0)。因此，僅從含量上分析無法判斷水分、鹽分、脂肪及色素是否與黑圈的形成有關(guān)。在非黑圈蛋中，蛋白質(zhì)及硫離子含量無顯著性差異（p>0.05）。然而，在黑圈蛋中，A 部位蛋白質(zhì)含量為18.67%，B部位蛋白質(zhì)含量為24.46%，差異顯著（p<0.05），A部位較B 部位硫離子含量高2.86 mg/100 g。造成以上現(xiàn)象的原因可能是蛋白質(zhì)的水解，部分含硫氨基酸的分解造成的。綜上分析可以推測，黑圈的形成很可能與蛋白質(zhì)及硫離子含量的變化有關(guān)。

表1 咸蛋各部位成分對比分析（不含金屬離子）Table 1 Comparative analysis of various parts of salted eggs (without metal ions)

2.1.2 黑圈蛋與非黑圈蛋不同部位金屬離子含量對比分析

由表2 可知，六種金屬離子中，Pb、Mn 和Se 在黑圈蛋和非黑圈蛋中的各部位分布均勻，無顯著差異（p>0.05），由此初步推斷Pb、Mn 和Se 對黑圈的呈色無貢獻；Fe、Cu、Zn 三種金屬元素在咸蛋黃各部位的分布均存在顯著差異（p<0.05），其中Fe 和Zn在非黑圈蛋中的分布為B0>A0，而在黑圈蛋中的分布與之相反；Cu 在黑圈蛋與非黑圈蛋中分布相同，均為A(A0)>B(B0)，在黑圈蛋中，Cu 的含量差為0.94 μg/g，在非黑圈中，Cu 的含量差為0.26 μg/g。綜上，在黑圈蛋中Fe、Cu、Zn 均有一定的外遷。造成以上現(xiàn)象的原因可能是咸鴨蛋蛋清部位的pH 值達8.0 左右，羧基偏多，蛋清部位則處于負電位，從而導致原本處于咸蛋黃內(nèi)部游離的金屬離子外遷聚集在蛋黃膜處[24,25]。而聚集在蛋黃膜處游離的金屬離子，可能會與含硫氨基酸提供的活性基結(jié)合生成黑青色的物質(zhì)，從而產(chǎn)生了所謂的“黑圈”現(xiàn)象。因此可初步判斷咸蛋黃“黑圈”現(xiàn)象與Fe、Cu、Zn 有關(guān)。有研究表明蛋黃中的卵黃高磷蛋白對金屬陽離子有強大的吸附能力，蛋黃中幾乎所有的金屬離子都結(jié)合在卵黃高磷蛋白上[26,27]。由此可以推測黑圈中游離的金屬離子可能來自于蛋黃中的卵黃高磷蛋白。

表2 黑圈蛋與非黑圈蛋不同部位金屬離子的含量 Table 2 The content of metal ions in different parts of black circle eggs and non-black circle eggs

2.1.3 “黑圈”蛋與非“黑圈”蛋不同部位pH 值對比分析

由圖1 可知，“黑圈”蛋黑圈部位pH 值與未變色部位差異明顯（p<0.05），黑圈部位的pH 值達到7.9左右，呈堿性，而未變色部位蛋黃pH 值呈弱酸性，而同批次非“黑圈”蛋蛋黃卻不存在這一差異性，pH 均為弱酸性（p>0.05），蛋清部位pH 值最大。孫秀秀[28]等研究表明腌制過程，咸蛋黃的pH 值由中性向酸性發(fā)展，此研究結(jié)果與“黑圈”蛋的黑圈部位pH 值結(jié)果相反，由此推測，pH 的異常與黑圈的形成有關(guān)。

圖1 熟制咸鴨蛋各部位pH 值分布情況 Fig.1 The pH value distribution of each part of cooked salted duck eggs

2.1.4 SDS-PAGE 凝膠電泳分析結(jié)果

由圖2 可知，咸蛋黃黑圈部位與未變色部位的小分子蛋白質(zhì)條帶均較淺，大分子蛋白質(zhì)條帶均較深，這可能是由于隨著腌制時間的延長，堿和鹽的作用促進了熱誘導凝膠中蛋白質(zhì)分子的聚合[29]。與未變色蛋黃相比，黑圈部位咸蛋黃蛋白質(zhì)條帶在分子量為36 ku處條帶較淺，說明黑圈部位小分子蛋白質(zhì)發(fā)生溶解，導致蛋白質(zhì)含量降低。以上研究表明咸蛋黃黑圈的形成很大程度上與蛋白質(zhì)的溶解有關(guān)，這與前文的猜測一致。

圖2 黑圈蛋咸蛋黃各部位的SDS-PAGE 電泳圖 Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of salted egg yolk of black circle egg

2.1.5 電子掃描電鏡分析結(jié)果

從圖3 可以明顯看出，黑圈部位咸蛋黃分子的蛋黃顆粒結(jié)構(gòu)混亂、無序，但未變色部位咸蛋黃蛋黃顆粒結(jié)構(gòu)均勻，兩者形成了鮮明的對比。造成這一現(xiàn)象的原因可能是黑圈部位的蛋白質(zhì)之間的作用力如二硫鍵、疏水作用和巰基等被破壞，從而破壞了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[30-33]。研究表明，二價或多價金屬離子對蛋白質(zhì)分子聚合的影響顯著，其可以減少凝膠網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)，導致網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的疏松和不均勻[34,35]。蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)骨架的形成依賴于氫鍵、疏水相互作用和一些靜電相互作用等非共價鍵和二硫鍵等共價鍵[36]，而這些共價鍵的交換反應(yīng)均與金屬離子有很大關(guān)系。因此，黑圈部位的微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不規(guī)則無秩序的網(wǎng)狀，很可能是由于金屬離子在黑圈部位的聚集影響了蛋白質(zhì)之間的相互作用。

圖3 黑圈蛋黃黑圈部位與未變色部位電鏡圖 Fig.3 Electron micrograph of the black circle and the non-discolored part of the egg yolk

2.2 純物質(zhì)模擬驗證試驗結(jié)果分析

2.2.1 蛋黃成分與硫離子的呈色反應(yīng)結(jié)果分析

從表3 可知，咸蛋黃中分離出的色素、脂肪、蛋黃漿質(zhì)蛋白與硫離子均無呈色反應(yīng)，只有含金屬離子的卵黃高磷蛋白與硫離子有呈色反應(yīng)，顏色呈現(xiàn)極深的墨綠色，而向不含金屬離子的卵黃高磷蛋白中加入Na2S 則無顏色變化。這說明黑圈的呈色過程是硫離子與卵黃高磷蛋白組分中的金屬離子結(jié)合的結(jié)果。

表3 蛋黃各部分成分與硫離子的呈色反應(yīng) Table 3 Color reaction of various components of egg yolk with sulfide ion

2.2.2 金屬離子與硫離子的呈色反應(yīng)結(jié)果分析

由表4 可知，Zn2+、Pb2+、Cu2+的濃度低于100 μg/g時與硫離子不呈色，濃度為高于100 μg/g 時為暗橙黃色，與黑圈蛋的黑圈部位的特征色不相符，結(jié)合蛋黃中Zn2+、Pb2+、Cu2+的含量低于50 μg/g，可知Zn2+、Pb2+、Cu2+對黑圈的呈色無貢獻。而Fe2+、Fe3+即使?jié)舛鹊陀?0 μg/g，仍與S2-反應(yīng)呈暗黃綠色。由此可以確定金屬鐵離子參與了黑圈的呈色。

表4 金屬離子與硫離子的呈色反應(yīng) Table 4 Color reaction of metal ions and sulfide ions

2.2.3 不同pH 與色素的呈色反應(yīng)結(jié)果分析

鴨蛋中主要的色素為類胡蘿卜素，其主要由玉米黃質(zhì)及葉黃素組成。由表5 可知，pH 值對色素的呈色有一定的影響，當pH 為中性或者酸性時，兩種色素的顏色均無明顯的變化，而當pH 為8 時，色素由黃色變?yōu)辄S綠色。由此確定色素對黑圈的呈色有一定的貢獻。

表5 不同pH 與色素的呈色反應(yīng) Table 5 Color reaction of different pH and pigment

2.3 黑圈形成原因結(jié)果分析

2.3.1 金屬離子與黑圈程度的相關(guān)性分析結(jié)果

由表6 可知，黑圈的顏色越深，ΔL*、Δa*、Δb*越小，ΔE*越大；不同黑圈程度的蛋黃中的金屬離子含量均存在顯著性差異（p<0.05），且隨著色差（ΔE*）的增大，蛋黃中鐵離子的含量降低，其他金屬離子的變化則無任何規(guī)律。由表7 可知，F(xiàn)e 的含量與咸蛋黃“黑圈”的色度之間有明顯的線性關(guān)系，黑圈顏色越深（ΔE*越大），F(xiàn)e 的含量越高，而其他金屬離子如Cu和Zn 等的分布情況與咸蛋黃“黑圈”的色度之間則無明顯的線性關(guān)系。結(jié)合表2 的結(jié)論，由此可以確定，黑圈的形成與金屬鐵離子有關(guān)。

表6 不同黑圈層次中金屬離子的含量及顏色 Table 6 The distribution of metal ions in different black circle levels

表7 金屬離子含量與黑圈程度相關(guān)性分析 Table 7 Correlation analysis of metal ion content and degree of black circle

2.3.2 硫離子對咸蛋黃顏色變化的影響

由表8 中a、b 的結(jié)果可知，正常顏色的蛋黃由特有的黃色變?yōu)楹谌Φ奶卣魃迭S綠色，這表明硫離子可能參與了黑圈的呈色過程；d、e 的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑圈部位的顏色加深，變?yōu)榛液谏?，進一步表明硫離子對黑圈的呈色有貢獻。處于f 環(huán)境中黑圈部位的蛋黃顏色褪變?yōu)檎５包S顏色，但CdSO4液體表面無黃色沉淀CdS的生成，這表明黑圈的褪色與H2S的逸出無關(guān)。為進一步驗證硫離子對黑圈的呈色有貢獻，向完全褪色的黑圈中滴加少量5% Na2S，蛋黃恢復原有的特征暗黃綠色，綜上可以確定硫離子參與了黑圈的呈色過程。結(jié)合前文的研究可以推斷出黑圈形成的過程是蛋黃內(nèi)的部分蛋白質(zhì)發(fā)生溶解，使得蛋黃pH 由弱酸性向弱堿性發(fā)展，從而導致蛋黃內(nèi)的鐵離子由蛋黃內(nèi)部向蛋黃外部遷移，由于蛋黃膜的阻礙，鐵離子聚集在黑圈部位，其與黑圈部位由于蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)生的硫離子反應(yīng)生成藍綠色的硫化亞鐵，藍綠色的硫化亞鐵與色素的顏色復配為肉眼觀察到的暗黃綠色甚至為灰綠色。因此，在咸蛋腌制過程中，向腌制料中加入一定量的金屬螯合劑如EDTA-2Na，可有效的預防咸蛋黑圈現(xiàn)象的產(chǎn)生。

表8 咸蛋黃在不同氣體環(huán)境中顏色的變化情況 Table 8 The color change of salted egg yolk in different gas environments

3 結(jié)論

通過對黑圈蛋與非黑圈蛋各部理化成分及黑圈蛋各部位蛋白質(zhì)組分和微觀結(jié)構(gòu)的差異，初步判斷與黑圈形成有關(guān)的物質(zhì)為蛋白質(zhì)、硫離子及Fe、Zn、Cu等金屬離子，然后通過對咸蛋黑圈反應(yīng)模型的建立及金屬離子與黑圈程度的相關(guān)性分析，進一步確定硫離子、蛋白質(zhì)以及鐵離子和色素對黑圈的呈色有貢獻。由此得到，真空熟制咸蛋黃黑圈形成的原因是在硫離子、鐵離子以及蛋白質(zhì)的共同作用下形成的。