綠菇多糖的提取工藝優(yōu)化

周理紅，王國梁

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430056）

綠菇（Russula virescens）又名綠菇、青蓋子、青頭菌等，隸屬于傘菌目紅菇科紅菇屬。綠菇的子實體中等至稍大。菌蓋初球形，很快變扁半球形并漸伸展，中部常稍下凹，表皮往往斑狀龜裂，老時邊緣有條紋，呈淺綠色至灰綠色。菌肉和菌褶呈白色。菌柄長中實或內(nèi)部松軟。綠菇主產(chǎn)于云南滇西“三江并流”區(qū)原始森林地帶，生長環(huán)境極其純凈，主要生長在樹林中的草叢里，每年六至九月出菇[1]。

綠菇具有極高的藥用價值和營養(yǎng)價值?！缎氯A本草綱要》記載，綠菇入藥“主治眼目不明，能瀉肝經(jīng)之火，散熱舒氣，服之最良，但不可多食，食時益以姜為配料”?，F(xiàn)代研究表明，綠菇富含植物多糖、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素B2、磷、鈣和鐵等多種營養(yǎng)物質(zhì)，同時還具有抗腫瘤、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等功能[2-5]。

多糖是由許多相同或不同的單糖以α或β糖苷鍵所組成的大分子化合物，廣泛存在于動物細(xì)胞膜和植物細(xì)胞壁中，具有多種生物活性。如菌類多糖具有促進(jìn)胰島素分泌從而降血糖的作用；部分中草藥多糖具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞體積從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能；有些多糖可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化凋亡從而起到抗腫瘤作用[6,7]。

由于植物細(xì)胞壁比較牢固，需進(jìn)行破壁處理，且植物種子常含有較多的脂質(zhì)或蛋白，需去除雜質(zhì)。目前常用的提取方法主要有，熱水浸提法、酶解提取法、堿浸提法、微波輔助法、超聲波輔助法和雙水相提取法等。其中超聲波法相較于其他提取方法具有速度快、對植物材料的細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)破壞較少等優(yōu)點，更適用于多糖的提取。

在綠菇多糖提取工藝的相關(guān)研究中，多采用單因素試驗和正交試驗。因影響多糖提取率的因素較多且復(fù)雜，各個因素之間往往存在不同程度的交互作用，因此，單因素和正交均具有一定的局限性，無法直觀反映出各因素之間影響程度。

響應(yīng)面分析法是將體系的響應(yīng)作為一個或多個因素的函數(shù)，運用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，從而選擇試驗設(shè)計中的最佳優(yōu)化條件[8]。響應(yīng)面分析法具有試驗次數(shù)少，因素水平分析全面的優(yōu)勢，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類條件優(yōu)化試驗。本文研究了綠菇多糖超聲波輔助提取方法的最佳工藝，在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Benhnken 響應(yīng)面法設(shè)計試驗，優(yōu)化得到綠菇多糖的最佳提取條件，為綠菇多糖的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 原料

綠菇在當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場采購。選擇成熟適當(dāng)，菇形飽滿圓整，新鮮無異味，無蟲蛀，無病變和無雜質(zhì)的菇體。用流動的自來水沖洗干凈，在70～80℃的烘箱中干燥3 d，用磨機(jī)研磨并過60 目篩，裝入密封袋中，儲存在干燥和避光處，備用。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

FW-80 型研磨機(jī)，北京興時利和科技發(fā)展有限公司；DHG-9053A 型臺式鼓風(fēng)干燥箱，無錫瑪瑞特科技有限公司；PSB200 型實驗室離心機(jī)，蘇州優(yōu)格曼機(jī)械有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；SP-752 型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 多糖的提取及測定

取適量干燥的綠菇粉末，用蒸餾水浸泡1 h，采用實驗設(shè)定的不同超聲功率、溫度，時間，和水料比進(jìn)行多糖提取。提取液過濾除去碎屑，離心處理15 min，轉(zhuǎn)速為4500 r/min，將得到的上清液進(jìn)行真空濃縮至原體積的1/5 左右，然后在濃縮液中加入3 倍濃縮液體積的95%乙醇，4℃冷藏放置10 h，再次離心處理15 min，轉(zhuǎn)速為4500 r/min，得到的沉淀即為粗多糖。然后，使用Sevage 法[9]去除粗多糖中的蛋白質(zhì)，得到綠菇多糖。

采用苯酚-硫酸法[10]進(jìn)行多糖得率的測定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定綠菇多糖含量，并按照以下公式計算：

1.2.2 單因素實驗設(shè)計

1.2.2.1 超聲功率對綠菇多糖得率的影響

稱取適量綠菇多糖干粉，按水料比30 mL/g 加入蒸餾水，攪拌均勻，在溫度75℃條件下超聲處理40 min，超聲功率分別為400 W、450 W、500 W、550 W和600 W，實驗結(jié)束后測定綠菇多糖得率。

1.2.2.2 溫度對綠菇多糖得率的影響

稱取適量綠菇多糖干粉，按水料比30 mL/g 加入蒸餾水，攪拌均勻，在超聲功率400 W 條件下超聲處理40 min，溫度分別為65℃、70℃、75℃、80℃和85℃，實驗結(jié)束后測定綠菇多糖得率。

1.2.2.3 超聲時間對綠菇多糖得率的影響

稱取適量綠菇多糖干粉，按水料比30 mL/g 加入蒸餾水，攪拌均勻，在溫度75℃、超聲功率400 W條件下分別超聲處理20 min、30 min、40 min、50 min和60 min，實驗結(jié)束后測定綠菇多糖得率。

1.2.2.4 水料比對綠菇多糖得率的影響

稱取適量綠菇多糖干粉，分別按水料比10 mL/g、20 mL/g、30 mL/g、40 mL/g 和50 mL/g 加入蒸餾水，攪拌均勻，在溫度75℃、超聲功率400 W 條件下分別處理40 min，實驗結(jié)束后測定綠菇多糖得率。

1.2.3 響應(yīng)面法實驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以超聲功率（W）、溫度（℃）、超聲時間（min）和水料比（mL/g）4 個因素為研究對象，以多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計Box-Benhnken 響應(yīng)面試驗，設(shè)計方案見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計方案 Table 1 Response surface design

1.2.4 回歸模型驗證

根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果對最優(yōu)方案進(jìn)行驗證，并重復(fù)3 次，計算試驗值與理論值得差異性。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及分析

采用軟件Design Expert 7.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲功率對綠菇多糖得率的影響

超聲波功率有助于植物細(xì)胞壁破碎，有助于多糖溶出，提高多糖的提取率。但是，當(dāng)超聲功率過大時，會引起部分多糖的降解，從而降低多糖的提取率[11]。由圖1 可知，綠菇多糖得率隨超聲功率變化而變化，當(dāng)超聲功率為500 W 時，多糖得率最高為5.04%。當(dāng)超聲功率小于500 W 時，超聲功率對綠菇多糖得率的影響呈正向顯著性（p<0.05）；當(dāng)超聲功率大于500 W時，超聲功率對綠菇多糖得率的影響不顯著。因此選擇超聲功率500 W 作為響應(yīng)面實驗設(shè)計的中心點。

圖1 超聲功率對綠菇多糖得率的影響 Fig.1 Effects of ultrasonic extraction power on the yield rate of Russula virescens polysaccharides

2.1.2 溫度對綠菇多糖得率的影響

提取溫度對多糖提取率具有較大影響。隨著溫度的升高，多糖溶解性和擴(kuò)散性增強(qiáng)，有利于多糖的溶出，但溫度過高會使多糖降低部分活性，從而降低多糖提取率[11]。由圖2 可知，綠菇多糖得率隨溫度變化而變化。在溫度為75℃時，多糖得率最高為5.62%。當(dāng)溫度小于75℃時，綠菇多糖得率隨溫度升高而增加，具有顯著差異（p<0.05）；當(dāng)溫度大于75℃時，綠菇多糖得率隨溫度升高而降低，具有顯著差異（p<0.05）?？紤]到溫度過高可能引起多糖水解，得率反而下降，因此選取75℃作為響應(yīng)面實驗設(shè)計的中心點。

圖2 溫度對綠菇多糖得率的影響 Fig.2 Effects of temperature on the yield of Russula virescens polysaccharides

2.1.3 超聲時間對綠菇多糖得率的影響

在相同的超聲功率下，超聲時間延長有助于植物細(xì)胞破碎，亦有助于植物多糖溶出。同時，超聲波的剪切作用使多糖鏈斷裂，降低多糖含量，所以超聲時間不宜太長[12,13]。由圖3 可知，綠菇多糖得率隨超聲時間的變化而變化。當(dāng)超聲時間為40 min 時，多糖得率最高為4.27%。當(dāng)超聲時間小于40 min 時，超聲時間對綠菇多糖得率的影響呈正向顯著性（p<0.05）；當(dāng)超聲時間大于40 min 時，超聲時間對綠菇多糖得率的影響不顯著性。因此選取40 min 作為響應(yīng)面實驗設(shè)計的中心點。

圖3 超聲時間對綠菇多糖得率的影響 Fig.3 Effects of ultrasonic time on the extraction rate of Russula virescens polysaccharides

2.1.4 水料比對綠菇多糖得率的影響

水料比是提取過程中的一個重要影響因素。當(dāng)溶質(zhì)與溶劑的濃度差越大，則傳輸動力越大，擴(kuò)散到溶劑中的溶質(zhì)越多，但水料比過大后對多糖得率無顯著影響[14,15]。由圖4 可知，綠菇多糖得率隨水料比的變化而變化。當(dāng)水料比為30 mL/g 時，多糖得率最高，為5.42%。當(dāng)水料比小于30 mL/g 時，綠菇多糖得率隨著水料比的增加而增高，具有顯著差異（p<0.05）；當(dāng)水料比大于30 mL/g 時，綠菇多糖得率隨著水料比的增加而降低，無顯著性差異（p>0.05）。若加水過多則使?jié)饪s步驟耗時，因此選取30 mL/g 作為響應(yīng)面實驗設(shè)計的中心點。

圖4 水料比對綠菇多糖得率的影響 Fig.4 Effect of water to feed ratio on the extraction rate of Russula virescens polysaccharides

2.2 響應(yīng)面實驗

2.2.1 實驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理，以超聲功率（W）、溫度（℃）、超聲時間（min）和水料比（mL/g）4 個因素為研究對象，以多糖得率為響應(yīng)值設(shè)計Box-Benhnken 四因素三水平試驗，進(jìn)行共29 個實驗的響應(yīng)面分析，結(jié)果見表2。綠菇多糖的得率從4.27%～6.74%。其中多糖得率最高點6.74%的實驗條件為超聲功率500 W、溫度75℃、超聲時間40 min 和水料比30 mL/g。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 Table 2 Design and results in response surface

回歸模型方差分析結(jié)果見表3，模型P<0.0001，表明該模型具有高度顯著性。失擬項P=0.9980，表明模型失擬不顯著，能夠擬合真實的實驗結(jié)果。模型的調(diào)整確定系數(shù)R2=0.9539，表明該模型的實驗值與預(yù)測值具有較高的相關(guān)度，擬合程度較好[16]。因此，可以用此模型對超聲波輔助提取綠菇多糖的工藝條件進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析表 Table 3 Response surface regression model analysis of variance table

回歸模型系數(shù)的顯著性P 值可用于檢查每個自變量之間的相互作用強(qiáng)度[17]。由表3 可知，模型一次項B-溫度和D-料液比極顯著；交互項AB 極顯著，BD和CD 顯著；二次項均極顯著，表明這些因素均會顯著影響綠菇多糖的得率。因素的F 值越大，對響應(yīng)值的影響越大，由表3 可知，4 個因素對多糖得率的影響大小依次為溫度>料液比>功率>時間。

對實驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析后得到回歸方程：

式中：y 為多糖得率%，A 為超聲功率（W）、B 為溫度（℃）、C 為超聲時間（min）、D 為水料比（mL/g）。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面及其等高線共同反映了各因素對響應(yīng)值的影響，且可以預(yù)測響應(yīng)的最優(yōu)值和最優(yōu)條件。響應(yīng)曲面直觀地反映出兩因素對響應(yīng)值的影響。由圖5 可知，各兩因素的變化在不同程度上影響著綠菇多糖的得率。等高線是響應(yīng)曲面在底面的投影，考察兩因素對響應(yīng)值的影響。等高線為橢圓形時，表示兩因素交互作用顯著，等高線為圓形時則兩因素交互作用較弱[18]。由圖6 可知，功率和溫度、料液比和溫度、料液比和時間的等高線呈橢圓形，說明各兩因素之間交互作用明顯。

圖5 不同因素對綠菇多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖 Fig.5 Response surface plot of the influence of different factors on the extraction rate of Russula virescenspolysaccharides

圖6 不同因素對綠菇多糖得率影響的等高線圖 Fig.6 Contour showing the influence of different factors on the extraction rate of Russula virescenspolysaccharides

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化驗證

使用Design-Expert 軟件對模型進(jìn)行優(yōu)化，獲得的最優(yōu)條件為超聲功率492.59 W、溫度76.73℃、超聲時間39.75 min 和水料比31.06 mL/g，模型預(yù)測多糖得率為6.48%。根據(jù)修正后的模型優(yōu)化的最佳提取條件進(jìn)行綠菇多糖的驗證實驗，提取條件為超聲功率500 W、溫度76℃、超聲時間40 min 和水料比31 mL/g，重復(fù)測定3 次，實際測得多糖的得率為6.50%，與預(yù)測值誤差較小。因此，此響應(yīng)模型及相關(guān)參數(shù)準(zhǔn)確可靠，能夠預(yù)測實驗的最佳條件，可用于綠菇多糖的提取條件研究中。

王靜等[19]通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化微波輔助提取綠菇多糖的工藝參數(shù)，得到最優(yōu)工藝為提取溫度93℃、提取時間27 min、液料比20 mL/g，多糖得率為5.69%，與預(yù)測值相對誤差為0.35%。魏曉梅[20]等通過正交試驗研究了云南地區(qū)青頭菌、雞油菌和雞樅菌粗多糖水提法的最佳工藝參數(shù)，結(jié)果顯示，青頭菌的最佳工藝參數(shù)為提取溫度75℃、提取時間3 h、液料比40 mL/g，多糖得率為6.18%，高于雞油菌的得率6.08%和雞樅菌的得率4.08%。

羅志峰等[21]利用超高壓輔助復(fù)合酶法對枸杞多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的最優(yōu)工藝為提取壓力200 MPa、提取溫度25℃、保壓時間5.6 min 和復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.3%，在此條件下枸杞多糖得率為6.58%。吳也等[22]探討了響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取血紅柳釘菇多糖的條件，得到最優(yōu)工藝為微波強(qiáng)度621.49 W，微波溫度88.94℃，微波處理時間15.33 min，料液比1:53.22（g/mL），多糖得率為15.01%。吳疆等[23]應(yīng)用新技術(shù)雙水相提取法提取了雙孢蘑菇多糖，得到最優(yōu)提取條件為PEG6000 濃度為16.5%，硫酸銨濃度為21.4%，多糖的分配系數(shù)K 為2～2.35，收率Y 為51%～59.7%。

超聲波輔助提取法是植物多糖工業(yè)比較理想的一種提取新工藝，與傳統(tǒng)的提取方法比具有提取得率高、耗時短和耗能低等優(yōu)點。本文通過對綠菇多糖提取工藝相關(guān)參數(shù)進(jìn)行單因素和響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化實驗，證明超聲波輔助法有助于提高綠菇多糖的得率，響應(yīng)面法建立的回歸模型及相關(guān)參數(shù)的實際值與預(yù)測值之間的相關(guān)度較好，可以用于對超聲波提取綠菇多糖進(jìn)行分析和預(yù)測。

3 結(jié)論

采用單因素實驗和響應(yīng)面實驗，考察了超聲波輔助法中4 個影響因素，如超聲功率、溫度、超聲時間和水料比對綠菇多糖得率的影響，得到了綠菇多糖超聲波輔助法的最佳提取條件為超聲功率500 W、溫度76℃、超聲時間40 min 和水料比31 mL/g，多糖的得率為6.50%。結(jié)果表明，超聲波輔助法有助于提高綠菇多糖的得率，響應(yīng)面法建立的回歸模型及相關(guān)參數(shù)的實際值與預(yù)測值之間的相關(guān)度較好，可以用于對超聲波提取綠菇多糖進(jìn)行分析和預(yù)測，進(jìn)而為相關(guān)研究提供參考。