北冬蟲夏草角鯊烯單氧酶基因的類胡蘿卜素生物合成功能解析

趙逸，陳海盈，李舒麗，許瑋竣，郭麗瓊,2，林俊芳,2，葉志偉,2*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,食品生物技術(shù)研究所,廣東廣州 510642）（2.廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642）

北冬蟲夏草（Cordyceps militaris）是具有珍貴食藥兩用價(jià)值的子囊菌[1]，作為冬蟲夏草的人工栽培替代品，2009 年被我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品[2]。藥理研究表明，北冬蟲夏草含有抗衰老、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生物活性的多種化學(xué)成分[3,4]，如類胡蘿卜素、核苷類化合物、蟲草多糖、多種礦物質(zhì)等[5]。類胡蘿卜素是由異戊二烯單元組成的含脂肪族多烯鏈的萜類化合物，其中異戊二烯單元的數(shù)目和化學(xué)修飾決定了結(jié)構(gòu)多樣性[6,7]。研究表明，光照通過影響新陳代謝進(jìn)程而調(diào)節(jié)北冬蟲夏草類胡蘿卜素的生物合成[8]。此外，微生物在鹽、高溫等非生物因素脅迫下會選擇性地合成類胡蘿卜素等萜類物質(zhì)以抵御不利的環(huán)境條件[9,10]。北冬蟲夏草含有多種類胡蘿卜素[11-13]，但其生物合成途徑尚未被闡明，八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）等類胡蘿卜素合成功能酶亦未在北冬蟲夏草中發(fā)現(xiàn)。因此，探究北冬蟲夏草類胡蘿卜素合成相關(guān)基因在解析其新型類胡蘿卜素合成通路上具有重要的研究意義。

角鯊烯單氧酶（squalene monooxygenase），又稱為角鯊烯環(huán)氧酶（squalene epxidase），是萜類化合物合成的關(guān)鍵限速酶[14,15]。Furubayashi 等[16,17]推測C30類胡蘿卜素合成過程中存在“角鯊烯路線”，即催化法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）生成脫氫角鯊烯用于合成類胡蘿卜素色素。項(xiàng)目組前期研究（北冬蟲夏草CM10 菌株接種在PDA 培養(yǎng)基作為對照組，分別在培養(yǎng)基中添加KMnO4、NaCl 脅迫因子作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序）表明，在KMnO4和NaCl 等因子脅迫下北冬蟲夏草類胡蘿卜素累積量和角鯊烯單氧酶基因erg1的轉(zhuǎn)錄水平均有上升，推測北冬蟲夏草通過萜類化合物的形成以抵御環(huán)境脅迫因子引起活性氧積累而造成生物膜氧化、核酸和蛋白質(zhì)變性等應(yīng)激損傷[18]。

為了進(jìn)一步分析erg1基因與北冬蟲夏草萜類化合物類胡蘿卜素合成的關(guān)系，本研究通過構(gòu)建erg1基因的過表達(dá)載體，用根瘤農(nóng)桿菌侵染的方式將核酸片段插入到北冬蟲夏草基因組中，然后通過3 輪傳代篩選erg1基因過表達(dá)穩(wěn)定遺傳菌株[19]，測定類胡蘿卜素生物合成量并進(jìn)行erg1基因的功能驗(yàn)證，為北冬蟲夏草萜類化合物生物合成機(jī)制及功能基因的分析研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

北冬蟲夏草（Cordyceps militaris）CM10 菌株購于山東省寧陽縣海鑫生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL-1 購于上海唯地生物生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pCambia0390-blpR-Pcmgpd 為所在研究組實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

5804R 高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；FRESCO21 微量臺式冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific 公司；CFX96 Real-Time PCR Detection System、MJ Mini PCR、GelDoCTMXR＋凝膠快速成像系統(tǒng)，BIO-RAD 公司。

1.1.3 引物

本文所用引物如表1 所示。

表1 基因擴(kuò)增的引物序列 Table 1 Primer sequences for gene amplification

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1erg1基因全長克隆

北冬蟲夏草基因組DNA 按照Omega 真菌基因組DNA 提取試劑盒（Omega）說明書進(jìn)行提取。根據(jù)北冬蟲夏草erg1基因（GenBank：NW_006271973.1）的上下游序列，設(shè)計(jì)引物erg1-1F/1R 并對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。以PCR 產(chǎn)物為模板，利用引物erg1-2F/2R，在erg1片段上游下游分別引入限制性酶切位點(diǎn)和同源臂序列。陰性對照以超純水作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（50 μL）：模板1 μL（<200 ng），上下游引物各1.5 μL（0.3 μM），KOD FX 1 μL（1 U），dNTPs 10 μL（0.4 mM），2×PCR buffer 25 μL，加超純水至50 μL。PCR 條件為：94℃ 2 min ，98℃ 10 s ，54℃ 30s，68℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶并使用瓊脂糖凝膠DNA 純化回收試劑盒（MAGEN）回收目的片段和進(jìn)行測序比對。

1.2.2erg1基因過表達(dá)載體的構(gòu)建

利用Bsp1407 Ⅰ和BcuⅠ對純化的目的片段和pCambia0390-blpR-Pcmgpd 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理并純化回收。利用Seamless Assembly Cloning Kit（Taihe）將線性化的pCambia0390-blpR-Pcmgpd 質(zhì)粒和目的基因片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞并于含卡那霉素的LB（10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g 氯化鈉，1 L 超純水，pH 7.0）平板中37℃培養(yǎng)過夜。挑選擬轉(zhuǎn)化子并擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，將正確的重組質(zhì)粒命名為 pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1（圖1）。

圖1 重組載體pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1 質(zhì)粒圖譜 Fig.1 The plasmid profile of recombinant vector pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1

1.2.3 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌

將重組質(zhì)粒與100 μL 根瘤農(nóng)桿菌AGL-1 菌株感受態(tài)細(xì)胞在冰浴中混合，轉(zhuǎn)移至冷凍電擊杯中并置于電轉(zhuǎn)儀。在電壓1.8 kV，1 pulse 條件下進(jìn)行電擊處理，結(jié)束后加入1 mL LB 培養(yǎng)基，30℃震蕩培養(yǎng)2～3 h 并涂布于含有卡那霉素和羧芐青霉素的LB 平板，30℃培養(yǎng)2～3 d 至菌落形成。

1.2.4 根瘤農(nóng)桿菌侵染北冬蟲夏草孢子

將北冬蟲夏草菌株接種到PPDA（200 g 馬鈴薯，20 g 葡萄糖，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4·7H2O，10 g蛋白胨，15 g 瓊脂，10 mg 維生素B1，加超純水至1 L）平板，25℃暗培養(yǎng)14～21 d，光照5～7 d。用0.05%吐溫80 溶液潤洗平板表面菌絲，收集孢子，使孢子濃度為每毫升104～106個(gè)/mL，于無菌離心管中備用。

挑取攜帶重組質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后接種到含乙酰丁香酮的IM 培養(yǎng)基（1.45 g KH2PO4、2.05 g K2HPO4、0.15 g NaCl、0.5 g MgSO4·7H2O、66 mg CaCl2·2H2O、2.48 mg FeSO4·7H2O、0.5 g (NH4)2SO4、1.8 g 葡萄糖、5 mL甘油，用超純水定容至1 L，pH 5.5）中，起始濃度OD600為0.15，震蕩培養(yǎng)12 h 左右至OD600為0.8。與北冬蟲夏草孢子懸浮液按照一定比例混合均勻，涂布在貼有玻璃紙的IMA 培養(yǎng)基平板（含乙酰丁香酮），25℃黑暗培養(yǎng)2～3 d。待玻璃紙有白點(diǎn)冒出時(shí)，將玻璃紙轉(zhuǎn)移至PDA 培養(yǎng)基（含有羧芐青霉素和Basta）上，25℃黑暗培養(yǎng)5～7 d 至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

挑取擬轉(zhuǎn)化子至PDA 培養(yǎng)基，待菌落長至直徑為2 cm 提取基因組并用引物check-F/check-R 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，將正確的北冬蟲夏草轉(zhuǎn)化子命名為Cmerg1。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測基因表達(dá)水平

取北冬蟲夏草菌絲球在液氮中充分研磨，利用真菌RNA 提取試劑盒（Omega）提取總RNA。使用TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisiSuperMix 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 。采用SYBRGreen II 嵌合熒光法，以cDNA 為qRT-PCR 的模板、tef1為內(nèi)參基因[20]，檢測erg1基因在空白組、脅迫因子KMnO4組、脅迫因子NaCl 組中的表達(dá)差異水平。反應(yīng)程序：94℃ 30 s ，94℃ 5 s，55℃ 15 s ，72℃ 10 s ，40 個(gè)循環(huán)。用Excel 統(tǒng)計(jì)內(nèi)參基因與目的基因erg1的Ct 值，計(jì)算2-△△Ct顯示表達(dá)水平[21]。

1.2.6 類胡蘿卜素的測定

接種CM10 菌株、Cmerg1 菌株于PDA 液體培養(yǎng)基，25℃、150 r/min 黑暗培養(yǎng)6 d，后分別加入脅迫因子高錳酸鉀（0.4 g/L）和氯化鈉（2 g/L）再光照培養(yǎng)5 d。菌絲體進(jìn)行冷凍干燥后，用酸加熱法測定菌絲體的類胡蘿卜素含量[22]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品設(shè)置 3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“mean±SD”表示。應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和柱形圖的繪制，當(dāng)p<0.05 時(shí)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1erg1基因克隆及純化

以北冬蟲夏草CM10 菌株基因組DNA 為模板，erg1-1F/1R 為引物進(jìn)行擴(kuò)增，再以erg1-2F/2R 為引物進(jìn)行二次PCR 得到erg1上下游同源臂。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在2000 bp 處都有明顯的單一條帶，與預(yù)計(jì)大小一致（圖2）。目的基因的測序結(jié)果表明，erg1上下游同源臂已經(jīng)成功克隆。

圖2 erg1 的PCR 擴(kuò)增 Fig.2 PCR amplification for erg1 gene

2.2 重組載體pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

對pCambia0390-blpR-Pcmgpd 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，切膠回收9410 bp 的線性載體（圖3a）。將目的基因erg1上下游同源臂與線性載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，接著進(jìn)行菌液PCR 鑒定及質(zhì)粒Bsp1407Ⅰ和BcuⅠ雙酶切鑒定。對重組載體進(jìn)行提取（圖 3b），測序分析進(jìn)一步驗(yàn)證重組載體pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1 被成功構(gòu)建。利用電轉(zhuǎn)化方式將載體轉(zhuǎn)至根瘤農(nóng)桿菌AGL-1 內(nèi)，菌液PCR鑒定擬轉(zhuǎn)化子，結(jié)果表明根瘤農(nóng)桿菌AGL_pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1 被成功構(gòu)建。

圖3 質(zhì)粒的酶切與重組質(zhì)粒的鑒定 Fig.3 Enzymatic digestion and identification of recombinant plasmids

2.3 北冬蟲夏草重組轉(zhuǎn)化子的檢驗(yàn)

用根瘤農(nóng)桿菌AGL_pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1 對北冬蟲夏草CM10（圖4）孢子進(jìn)行侵染，在無抗的平板上培養(yǎng)3 d 后，將玻璃紙轉(zhuǎn)移至含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基平板上繼續(xù)暗培養(yǎng)，待開始萌發(fā)白色菌絲點(diǎn)時(shí)，將擬轉(zhuǎn)化子挑至含有Basta 抗生素的平板上培養(yǎng)。菌落形成后（圖5），刮取擬轉(zhuǎn)化子菌絲進(jìn)行PCR 鑒定。將獲得的抗性轉(zhuǎn)化菌株連續(xù)傳代，并進(jìn)行PCR 鑒定（圖6），在845 bp 大小處有目的條帶的即為穩(wěn)定菌株，選取3 代傳代的穩(wěn)定菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 北冬蟲夏草CM10 的菌落 Fig.4 Colony of C.militaris CM10

圖5 Cmerg1 重組轉(zhuǎn)化子的菌落 Fig.5 Colonies of Cmerg1 recombinant transformation

圖6 Cmerg1 擬轉(zhuǎn)化子菌絲PCR 的鑒定 Fig.6 Colony-PCR verification of Cmerg1 transformation candidates

2.4 qRT-PCR 檢測基因相對表達(dá)量

以北冬蟲夏草cDNA 為模板，分別以tef1-F/R、erg1-F/R 為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢驗(yàn)引物特異性（圖7a）。樣品分為3 組不同處理的北冬蟲夏草菌株，每組樣品3 個(gè)平行，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)，比較各樣品（空白組、脅迫因子KMnO4組、脅迫因子NaCl 組）中erg1基因的相對表達(dá)量的差異（圖7b）。結(jié)果顯示，添加KMnO4環(huán)境因子后log2FC 是0.65（RNA-seq 中l(wèi)og2FC是0.95），添加NaCl 環(huán)境因子后log2FC 是1.54（RNA-seq 中l(wèi)og2FC 是1.56），erg1基因的表達(dá)水平與RNA-seq 的結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確的。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析表明，erg1基因表達(dá)量在添加KMnO4和NaCl 環(huán)境因子后上升，推測erg1基因與類胡蘿卜素的生物合成有關(guān)，其具體的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

圖7 erg1 引物鑒定及qRT-PCR 表達(dá)量驗(yàn)證 Fig.7 Primer identification of erg1 gene and qRT-PCR expression verification

2.5 轉(zhuǎn)化子中類胡蘿卜素含量的測定

對穩(wěn)定遺傳的第四代重組轉(zhuǎn)化株Cmerg1 進(jìn)行類胡蘿卜素含量分析，結(jié)果表明高錳酸鉀、氯化鈉脅迫處理引起重組轉(zhuǎn)化株Cmerg1 的類胡蘿卜素的累積量增加（圖8）。不添加任何脅迫的對照菌株類胡蘿卜素累積量是3139.10 μg/g。高錳酸鉀脅迫下，CM10 菌株、Cmerg1 菌株的類胡蘿卜素累積量分別是5523.92 μg/g、6757.17 μg/g，Cmerg1 菌株是對照菌株CM10的1.22 倍；氯化鈉脅迫使CM10 菌株、Cmerg1 菌株類胡蘿卜素含量分別是5309.74 μg/g、6363.93 μg/g，Cmerg1 菌株是對照菌株CM10 的1.20 倍。先前有研究表明，Erg1（單氧酶）催化FPP 生成脫氫角鯊烯，促進(jìn)C30 類胡蘿卜素的合成[23]，本文與其研究結(jié)果一致。在添加高錳酸鉀、氯化鈉脅迫因子后重組轉(zhuǎn)化株Cmerg1 類胡蘿卜素的含量均發(fā)生了增加，與對照組菌株相比有顯著性的差異變化，表明erg1基因過表達(dá)后北冬蟲夏草Cmerg1菌株產(chǎn)類胡蘿卜素的能力有上升，推測erg1基因促進(jìn)類胡蘿卜素的合成。

圖8 北冬蟲夏草CM10 和重組轉(zhuǎn)化株Cmerg1 類胡蘿卜素含量 Fig.8 Carotenoid production in mycelium of the C.militarisCM10 and Cmerg1

3 結(jié)論

3.1 基于前期轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析，獲得了參與北冬蟲夏草類胡蘿卜素合成的潛在基因erg1。本論文構(gòu)建了erg1基因過表達(dá)載體 pCambia0390-blpR-Pcmgpd -erg1，通過農(nóng)桿菌侵染的方式在北冬蟲夏草中進(jìn)行表達(dá)，然后搖瓶發(fā)酵測定北冬蟲夏草類胡蘿卜素生物合成量進(jìn)行erg1的功能驗(yàn)證。結(jié)果表明，添加高錳酸鉀、氯化鈉脅迫因子后重組轉(zhuǎn)化株Cmerg1 類胡蘿卜素的含量均有顯著增加，推測角鯊烯單氧酶Erg1 催化形成脫氫角鯊烯用于類胡蘿卜素合成，該酶參與了北冬蟲夏草類胡蘿卜素的合成過程。

3.2 本研究構(gòu)建的erg1基因的北冬蟲夏草過表達(dá)載體及其突變株，為北冬蟲夏草的基因過表研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有利于推進(jìn)北冬蟲夏草類胡蘿卜素的生物合成機(jī)制研究和開發(fā)利用。