芥子酸改善高脂飲食模式下敘利亞倉鼠脂代謝與氧化應(yīng)激水平

梁嬋華，王可盈，曹文瀞，羅高，何雯，曾榛,3*，宋家樂,4*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541101）（2.桂林醫(yī)學(xué)院學(xué)生工作(部)處，廣西桂林 541101）（3.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南長沙 410000）（4.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，廣西桂林 541109）

肥胖是由于機(jī)體長期處于能量攝入與消耗失衡狀態(tài)而引起的一種慢性代謝性疾病[1]，主要以體內(nèi)脂肪積聚過多所致脂肪層過厚和脂肪積蓄過剩為特征[2]。隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和居民生活水平的不斷提高，西方飲食文化（高脂肪、高熱量飲食模式）對(duì)中國傳統(tǒng)飲食文化沖擊所造成的飲食行為改變和結(jié)構(gòu)不均衡，以及不良生活習(xí)慣、環(huán)境和遺傳等因素[3]，使得肥胖成為中國乃至全球日益矚目的公共健康問題之一。高脂飲食（High fat diet，HFD）誘導(dǎo)的肥胖不僅會(huì)引起機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥和腸道菌群失調(diào)[4]，從而導(dǎo)致代謝綜合征的發(fā)生，增加心血管疾病、胰島素抵抗、糖尿病、非酒精性脂肪肝病、癌癥，甚至哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5-7]，而且還影響著社會(huì)與經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前，全球的成人肥胖發(fā)生率約為13%[8]。此外，兒童超重與肥胖的發(fā)生率也迅速增加，2016 年全球5～19 歲超重或肥胖的兒童已超過3.4 億人[9]。因此，尋找有效預(yù)防和治療肥胖的方法迫在眉睫。

芥子酸（Sinapic acid，SA）是廣泛分布于水果、蔬菜、油料作物和谷物中的一類具有較強(qiáng)生物活性的天然酚酸類化合物，屬于羥基肉桂酸的一種[10]。研究發(fā)現(xiàn)，其在菜籽、紫山藥、檸檬、柑橘類等蔬果植物中含量很高[11,12]。近年來的研究結(jié)果也提示，芥子酸具有抗結(jié)腸炎[13,14]、抗氧化[15]、抗癌[16]、促進(jìn)脂肪分解[17]以及調(diào)控游離脂肪酸、磷脂、三酰甘油和氧磷脂等脂類間的轉(zhuǎn)化代謝[14]等生理作用。

敘利亞黃金倉鼠具有與人類相似的脂類代謝通路，是目前較為公認(rèn)的用于代謝綜合征研究的動(dòng)物模型之一[18]。目前，芥子酸對(duì)高脂肪膳食模式下倉鼠脂類代謝影響及其作用機(jī)制的報(bào)道較少。因此，本研究以膳食高脂肪飼料（60%脂肪供能）誘導(dǎo)的敘利亞黃金倉鼠建立肥胖模型，同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)飼料（高脂飼料中添加0.03%芥子酸）對(duì)高脂膳食模式下倉鼠體重改善、脂質(zhì)代謝及氧化應(yīng)激發(fā)生的影響效果，從而探討芥子酸抗肥胖的作用機(jī)制，為進(jìn)一步將芥子酸開發(fā)成為更安全、更有效的抗肥胖膳食補(bǔ)充劑提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芥子酸（純度大于98%，S106903），購自上海阿拉丁生物科技有限公司；AIN-93G 普通飼料、對(duì)照組高脂飼料（60%脂肪供能）、實(shí)驗(yàn)組高脂飼料（含60%脂肪，0.03%芥子酸），購于常州鼠一鼠二生物科技有限公司；總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸（Nonesterified free fatty acid，NEFA）、丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）、總抗氧化能力（Total antioxidation capability，T-AOC）試劑盒，南京建成生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度試劑盒，肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT-1）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）、膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）、羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMGCR）、乙酰輔酶A 羧化酶1（ACC1）抗體，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；脂肪酸合成酶（FAS），武漢塞維爾生物科技有限公司；膽固醇合成轉(zhuǎn)錄因子SREBP2，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf 5424R 型冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；ELx808 酶標(biāo)儀，美國BioTek 公司；FluorChem M 超靈敏全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，美國Protein Simple 公司；KZ-II 高速組織研磨儀，武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性敘利亞黃金倉鼠（共21 只，體重110～140 g）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院SPF 級(jí)動(dòng)物房（許可證號(hào)：SYXK(桂)2020-0005）。飼養(yǎng)環(huán)境為標(biāo)準(zhǔn)光照/黑暗（12 h/12 h）循環(huán)飼養(yǎng)，自由攝食及清潔飲水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 高脂模型建立及實(shí)驗(yàn)分組方法

所有倉鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，依照完全隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組（7 只/組）進(jìn)行后續(xù)研究。倉鼠高脂肥胖模型以Dan 等[19]的文獻(xiàn)進(jìn)行操作。其中，正常組飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料、模型組飼喂高脂飼料、芥子酸組飼喂實(shí)驗(yàn)高脂飼料（含0.03%芥子酸）?？倢?shí)驗(yàn)周期為12 周，每3 d 進(jìn)行體質(zhì)量監(jiān)測，每日進(jìn)行飲水量和攝食量的監(jiān)測。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已通過桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（GLMC-201806003）。

1.4.2 組織取材

實(shí)驗(yàn)第12 周干預(yù)結(jié)束后，各組倉鼠禁食不禁水12 h，予腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.1 mL/10 g）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，常溫下分離血清后存放與-80℃冰箱。倉鼠置于冰上開腹后，快速分離倉鼠附睪、腎周、腹股溝等出脂肪組織及肝臟組織并迅速放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

或疑月中有兔形，……予以為月無光，而溯日為明，世所知也。天有十二辰，列于東方者。有神司其位。日出在東，其對(duì)在酉，酉為雞，日光含景，則雞在日中。及運(yùn)而西。則對(duì)在卯，卯為兔，月光含景，則兔在月中。月有兔形，何足異哉？人知日中為烏，而不知為雞。知月中有兔，不知兔自日以傳形也。或曰段成式言月中有桂，仙人吳剛斫其根。曰：不然，日行于西，與扶桑對(duì)，則陊景日中，月望之明，景亦隨之。[注](明)周嬰：《巵林》，新文豐出版社，1984年，第98-99頁。

1.4.3 血清生化指標(biāo)檢測

按照各試劑盒檢測操作要求，分別檢測血清中TG、TC、LDL-c、HDL-c、NEFA 的濃度。

1.4.4 肝臟內(nèi)TC 與TG 水平分析

稱取一定質(zhì)量的肝臟組織，冰生理鹽水去除血污后，加入2 mL 的無水乙醇與丙酮（V/V，1:1）混合液，冰上制備10%的肝組織勻漿。經(jīng)3000 r/min 離心15 min 后，取上清液用試劑盒檢測TC、TG 的濃度。

1.4.5 血清和肝臟組織中T-AOC和MDA水平檢測

取凍存的血清和肝臟組織勻漿液，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，分別檢測血清中及肝臟中MDA 和T-AOC 的含量水平。

1.4.6 糞便中TC 的檢測

1.4.7 Western Bolt 法檢測肝臟組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

稱取一定質(zhì)量肝臟組織（20～35 mg），冰生理鹽水清洗血污，按比例加入蛋白裂解液（含PMSF）提取組織總蛋白，12000 r/min，4℃條件下離心10 min，收集上清采用BCA 法測定蛋白濃度。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠，加樣后調(diào)整電壓，濃縮膠80 V，分離膠120 V，電泳120 min。濕法轉(zhuǎn)膜，條件為恒定電流240 mA。轉(zhuǎn)膜1 h 后，將NC 膜放于5%的脫脂奶粉中封閉4 h。孵育一抗過夜，TBST 洗膜后，孵育二抗1 h，TBST 洗膜3 次后，加入特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以均值（means）±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析與統(tǒng)計(jì)處理，p<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 芥子酸對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的倉鼠體質(zhì)量和器官質(zhì)量的影響

由表1 可知，正常組、高脂肪組及芥子酸組的初始體重均無顯著性差異（p>0.05）。喂養(yǎng)12 周后，與正常組相比，高脂肪組倉鼠最終體重增加1.77 倍（p<0.05）。芥子酸處理組倉鼠最終體重和體重增加量均顯著低于高脂肪組（p<0.05），分別減少了11.15%和23.86%。結(jié)果表明，芥子酸有顯著下調(diào)倉鼠體重的作用。但Chen 等[3]的研究結(jié)果也提示，給予芥子酸干預(yù)并不能夠改善高脂飼料（45%脂肪供能）喂養(yǎng)后大鼠體重的增加。

表1 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠體重的影響 Table 1 Effects of sinapic aicdon body weight in high fat diet fed hamsters

如圖1 所示，相比正常組，高脂肪組倉鼠的肝臟、附睪脂肪和腹股溝脂肪組織的重量極顯著增加（p<0.01）。而飼喂高脂肪飼料雖較正常組能夠促進(jìn)倉鼠腎周脂肪的堆積（即腎周脂肪臟器指數(shù)增加趨勢(shì)），但兩者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。與高脂肪組相比，芥子酸干預(yù)對(duì)倉鼠肝臟、附睪脂肪、腎周脂肪和腹股溝脂肪的臟器指數(shù)分別減少13.05%、20.38%、27.91%和12.24%。這一結(jié)果提示，芥子酸可能通過緩解脂肪組織堆積抑制高脂飲食誘導(dǎo)的倉鼠體重的增加。另外，芥子酸組對(duì)正常組附睪脂肪和腎周脂肪組織的重量均無顯著性影響（p>0.05）。

圖1 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟與各脂肪的臟器指數(shù)的影響 Fig.1 Effects of sinapic aicdon liver and obesity tissue index in high fat diet fed hamsters

2.2 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠血清脂代謝水平的影響

從圖2 可知，與正常組相比，高脂肪組倉鼠血清中TG、TC、LDL-c 和NEFA 水平顯著增加（p<0.05），而HDL-c 水平降低，但無統(tǒng)計(jì)顯著差異（p>0.05）。與高脂模型組相比，芥子酸干預(yù)能夠顯著降低高脂肪膳食所引發(fā)的倉鼠血清中TC、TG、NEFA 和LDL-c的水平（p<0.05），分別減少了36.54%、26.54%、44.13%和72.40%，而HDL-c 水平則升高了1.25 倍。Chen 等[3]研究提示，芥子酸干預(yù)能夠有效降低肥胖大鼠血清TG 水平，同時(shí)提升HDL-c 水平。同時(shí)，Wu 等[13]的研究也提示芥子酸干預(yù)能夠減少高脂飲食下C57BL/6J 背景的ApoE?/?小鼠血清游離脂肪酸和總TG 水平。而相比正常組，芥子酸干預(yù)能夠顯著降低倉鼠血清LDL-c 的水平至48.74%（p<0.01），HDL-c增加1.17 倍（p<0.01），而對(duì)TG 和TC 的水平無明顯改變。

圖2 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠血清脂代謝水平的影響 Fig.2 Effects of sinapic aicdon serum lipid level in high fat diet fed hamsters

2.3 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟脂代謝水平的影響

如圖3 所示，高脂膳食能夠顯著誘發(fā)倉鼠肝臟TG和TC 水平升高。與正常組相比，高脂膳食組倉鼠肝臟中TG 和TC 水平分別升高了約1.90 和1.47 倍。而芥子酸干預(yù)卻能降低肝臟中TG 和TC 的水平。與高脂膳食組相比，芥子酸組的肝臟TC 水平降低了34.58%（p<0.05），TG 水平降低了28.19%，但無顯著性差異（p>0.05）。然而，肝臟TC 與TG 水平在正常組和芥子酸組之間沒有顯著差異。

圖3 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟中TG、TC 水平的影響 Fig.3 Effects of sinapic aicdon hepatic TG and TC level in high fat diet fed hamsters

2.4 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠糞便中TC水平的影響

糞便排出的膽固醇含量與血脂水平有密切關(guān)系，當(dāng)機(jī)體脂代謝紊亂時(shí)其會(huì)大幅度下調(diào)[19]。由圖4 可知，芥子酸干預(yù)組糞便中TC 含量（1650.00 μmol/L）顯著高于正常組（1177.50 μmol/L）和高脂膳食組（920.00 μmol/L）（p<0.05），這可能是由于芥子酸干預(yù)后，降低機(jī)體對(duì)膽固醇的吸收，并加速膽固醇的代謝，從而促使膽固醇排出體外，該結(jié)果與芥子酸干預(yù)后的倉鼠外周血脂水平變化相一致。

圖4 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠糞便中TC 水平的影響 Fig.4 Effects of sinapic aicdon fecal TC level in high fat diet fed hamsters

2.5 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠血清和肝臟氧化應(yīng)激水平的影響

在脂肪堆積的同時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)的升高是肥胖等相關(guān)代謝綜合征的重要致病機(jī)制[21]。MDA 是生物膜多不飽和脂肪酸過氧化過程中產(chǎn)生的一種主要反應(yīng)醛類物質(zhì)，其水平的高低通常可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的強(qiáng)弱[22,23]。由表2 可知，12 周的高脂飲食導(dǎo)致血清和肝臟中氧化應(yīng)激的發(fā)展，高脂膳食組倉鼠的MDA 水平顯著高于正常組（p<0.05）。芥子酸干預(yù)后，血清和肝臟組織中MDA 水平分別降低10.18%和16.23%，但均無顯著差異（p>0.05）。芥子酸對(duì)血清T-AOC 水平有改善作用，但對(duì)肝臟組織內(nèi)T-AOC 水平無明顯影響，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Chen 等[3]的研究結(jié)果較為接近。上述結(jié)果提示芥子酸可能具有緩解脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用，從而糾正脂代謝紊亂。

表2 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠血清和肝臟氧化應(yīng)激水平的影響 Table 2 Effects of sinapic aicdon serum and liver oxidative stress level in high fat diet fed hamsters

2.5 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟脂肪酸合成的影響

FAS 和ACC1 是合成脂肪酸的關(guān)鍵酶，其蛋白水平的高低可間接反映肝臟組織脂肪的合成情況[24,25]。異?；罨腇AS 和ACC1 可破壞脂代謝平衡，使得體內(nèi)脂肪合成速度快于脂肪分解，從而誘導(dǎo)脂肪的過度堆積，加速肥胖發(fā)生的進(jìn)程[26,27]。高脂飲食喂養(yǎng)能夠顯著上調(diào)倉鼠肝臟組織中FAS和ACC1的蛋白表達(dá)水平（圖5）。與正常組相比，高脂膳食組倉鼠肝臟中FAS 表達(dá)水平上升約6.17 倍，ACC1 表達(dá)水平升高2.35 倍。而經(jīng)芥子酸干預(yù)后，相比高脂肪膳食組，倉鼠肝臟中FAS 和ACC1 的蛋白表達(dá)水平分別下降34.38%和52.72%（p<0.05）。

圖5 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟中FAS 和ACC1 的蛋白表達(dá)影響 Fig.5 Effects of sinapic aicd on hepatic protein expression of FAS and ACC1 in high fat diet fed hamsters

2.6 芥子酸對(duì)喂高脂飲食后倉鼠肝臟脂肪酸β氧化的影響

PPAR-γ是核受體超家族成員，主要參與肝臟脂類代謝和脂肪細(xì)胞的合成、分化過程[28]。PPAR-γ和CPT-1 是控制脂肪酸β氧化的關(guān)鍵蛋白，其中CPT-1是脂肪酸β氧化的限速酶[29,30]。在本研究中，12 周高脂膳食導(dǎo)致倉鼠肝臟組織中PPAR-γ和CPT-1 蛋白水平均顯著低于正常組倉鼠，且兩種蛋白的表達(dá)水平分別較正常組降低了41.60%和31.87%（圖6）。與高脂組相比，芥子酸干預(yù)能上調(diào)倉鼠肝臟組織中PPAR-γ和CPT-1 的蛋白表達(dá)水平，分別增加了2.00 倍和2.61倍。而文獻(xiàn)報(bào)道指出，激活PPAR-γ和CPT-1 能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，減少脂肪細(xì)胞數(shù)量，控制脂質(zhì)過氧化水平，并利于調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[31,32]。

圖6 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟中PPAR-γ 和CPT-1 的蛋白表達(dá)影響 Fig.6 Effects of sinapic aicdon hepatic protein expression of PPAR-γ and CPT-1 in high fat diet fed hamsters.

2.7 芥子酸對(duì)喂高脂飲食后倉鼠肝臟膽固醇代謝的影響

SREBP2 主要參與機(jī)體內(nèi)膽固醇代謝過程，通過激活膽固醇合成途徑中多個(gè)因子的表達(dá)（如HMGCR）來調(diào)節(jié)膽固醇的生成、吸收、排泄等生理進(jìn)程，過度活化的SREBP2 和HMGCR 在代謝綜合征病理生理過程中發(fā)揮著重要作用[33]。如圖7 所示，芥子酸處理顯著抑制高脂膳食所造成倉鼠肝臟中SREBP2（53.49%）和HMGCR（32.68%）的表達(dá)（p<0.05）。而與正常組相比，芥子酸干預(yù)后的肥胖倉鼠肝臟內(nèi)SREBP2 和HMGCR 蛋白表達(dá)的水平降低64.69%和45.46%（p<0.05）。CYP7A1 是膽固醇從體內(nèi)排出的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，促進(jìn)肝臟內(nèi)膽固醇代謝正常運(yùn)行[34]。與高脂膳食組倉鼠相比，芥子酸干預(yù)對(duì)肥胖倉鼠肝臟中CYP7A1 的蛋白水平顯著升高1.65 倍（p<0.05）。以上結(jié)果提示芥子酸能夠抑制膽固醇的合成，并通過促進(jìn)膽固醇從體內(nèi)排出達(dá)到改善膽固醇代謝異常的作用。

圖7 芥子酸對(duì)飼喂高脂飲食后倉鼠肝臟中SREBP2、HMGCR 和CYP7A1 的蛋白表達(dá)影響 Fig.7 Effects of sinapic aicdon hepatic protein expression of SREBP2,HMGCR and CYP7A1 in high fat diet fed hamsters

3 結(jié)論

連續(xù)12 周的芥子酸干預(yù)能有效抑制高脂飲食所造成的倉鼠體重增加，減少其體內(nèi)脂肪組織的質(zhì)量；下調(diào)TG、TC、NEFA 和LDL-c 水平，同時(shí)升高HDL-c水平和糞便中TC 含量。芥子酸還能同時(shí)增強(qiáng)肝臟組織中PPAR-γ、CPT-1 和CYP7A1 的蛋白表達(dá)，并通過下調(diào)ACC1、FAS、HMGCR 及SREBP2 等脂質(zhì)代謝相關(guān)因子來控制脂肪合成與膽固醇代謝來調(diào)控肥胖發(fā)生進(jìn)程中的脂類代謝異常。此外，芥子酸還能增強(qiáng)血清和肝臟組織中T-AOC 水平，降低血清與肝臟組織中MDA 水平，從而減緩脂質(zhì)氧化應(yīng)激的發(fā)生。綜上所述，芥子酸對(duì)高脂飲食引起的倉鼠肥胖和脂代謝異常有明顯的改善作用，該作用可能與抑制脂質(zhì)過氧化、減少脂肪合成和促進(jìn)膽固醇代謝有關(guān)。