干旱脅迫對黃薇光合特性和若干生理生化指標的影響

鄭 鋼，顧翠花，王 杰，林 琳，*

(浙江農(nóng)林大學(xué) a. 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院；b. 浙江省園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室；c. 南方園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，浙江 杭州 311300)

近年來，全球變暖問題日益嚴重，極端天氣頻發(fā)，干旱問題受到全社會的密切關(guān)注[1]。據(jù)統(tǒng)計，世界干旱與半干旱地區(qū)約占地球陸地面積的1/3，我國干旱和半干旱地區(qū)約占全國國土面積的1/2[2]。隨著全球氣候變化的加劇，水資源短缺問題凸顯，干旱已成為制約生產(chǎn)力進步的世界性問題[3]。受副熱帶高壓影響，我國南方地區(qū)夏季常出現(xiàn)持續(xù)高溫天氣，個別地區(qū)的最高溫度超過42 ℃，嚴重制約園林植物的生長發(fā)育和栽培應(yīng)用[4]。黃薇(HeimiamyrtifoliaCham. et Schlechtend.)為千屈菜科黃薇屬落葉叢生灌木，原產(chǎn)自南回歸線附近的熱帶亞熱帶地區(qū)，是少有的夏、秋兩季開花，兼具觀賞和藥用經(jīng)濟價值的灌木[5]。我國目前引種的黃薇屬植物僅黃薇一種，引自巴西，在杭州、上海、昆明、廣州等地皆有栽培[6]。引種地之一的杭州屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，與黃薇原產(chǎn)地氣候相似[7]。梅雨過后，杭州市進入盛夏，太陽輻射強，氣溫高、降水少，植物將面臨長時間的季節(jié)性干旱[8-10]。黃薇在生長過程中一旦受到持續(xù)干旱影響，葉片將會萎蔫，甚至枯黃落葉，嚴重影響植株生長；因此，研究黃薇在杭州亞熱帶氣候下的干旱適應(yīng)能力，對于黃薇在浙江地區(qū)的引種栽培和園林應(yīng)用推廣來說都具有積極意義。

干旱是影響植物生長發(fā)育的關(guān)鍵非生物脅迫因子，通常會引起細胞脫水、質(zhì)壁分離和細胞膜、酶系統(tǒng)受損，導(dǎo)致代謝失衡，最終改變植物的生長方向[11]。研究人員已在多種植物上開展抗旱研究：不同抗旱能力的苜蓿品種可通過改變根系生長并啟動抗氧化系統(tǒng)來抵御干旱，其中，強抗旱苜蓿品種主要通過增加根長和抗壞血酸含量來適應(yīng)干旱[12]。沙棘在長期輕中度干旱脅迫下，其脯氨酸和可溶性糖含量在中后期顯著增加，使沙棘表現(xiàn)出低水勢的耐旱特性[13-14]。棉花經(jīng)PEG(聚乙二醇)-6000誘發(fā)干旱后，可通過降低氣孔開度和增大氣孔密度等方式降低氣孔導(dǎo)度和凈光合速率[15]。不同植物的抗旱能力存在差異，研究植物對干旱脅迫的響應(yīng)機理，對于抗旱種質(zhì)培育來說具有重要意義[16]。目前，國內(nèi)外關(guān)于黃薇的研究主要集中在黃薇分類、葉內(nèi)酚類化合物和黃薇遷移、葉綠體基因組等方面[17-19]。作者課題組前期探究了高溫干旱復(fù)合脅迫對黃薇抗氧化防御系統(tǒng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃薇對干旱敏感[20]，但關(guān)于其在干旱脅迫下的生理適應(yīng)問題在本研究檢索范圍內(nèi)尚未見報道。為此，特開展自然干旱盆栽試驗，研究不同水分情況下黃薇的光合特性和部分生理生化指標變化，探究黃薇的需水規(guī)律及其生理耐旱機制，以期為黃薇的栽培應(yīng)用和抗旱性育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

試驗材料為生長健壯、長勢一致的黃薇一年生扦插苗(平均株高55.6 cm，平均地徑14.3 cm)。盆栽容器系上口徑25 cm、下口徑20 cm、高30 cm的塑料花盆。每盆裝土4 kg，單株定植。培養(yǎng)土按泥炭土、蛭石、珍珠巖、河沙3∶1∶1∶1的體積比配比，保持土壤田間持水量為23.5%。

試驗地位于浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景與園林建筑學(xué)院人工氣候室內(nèi)(30°15′N，119°43′E)。試驗材料于2020年5月15日放入人工氣候室進行處理。處理前適應(yīng)性培養(yǎng)7 d后開始試驗，環(huán)境條件為14 h光/10 h暗的光周期，28 ℃的光下溫度，25 ℃的暗中溫度，68%～75%的相對濕度。

1.2 試驗設(shè)計

根據(jù)試驗期間的土壤相對含水量，試驗設(shè)5個處理(含1個對照)：對照(CK)，土壤相對含水量為65%～75%；輕度干旱(T1)處理，土壤相對含水量為45%～60%；中度干旱(T2)處理，土壤相對含水量為30%～45%；重度干旱(T3)處理，土壤相對含水量為15%～30%；極度干旱(T4)處理，土壤相對含水量為5%～15%。每天下午18:00用TDR100便攜式土壤水分測定儀(美國Spectrum 公司)測定土壤相對含水量，并對盆栽進行稱重，根據(jù)測定結(jié)果和土壤質(zhì)量變化，計算需補充水量，使土壤含水量保持在控制范圍內(nèi)。處理20 d后，選擇各處理植株同一高度同一朝向的成熟葉片，一部分用于光合參數(shù)和氣孔特性測定，一部分經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于丙二醛含量、抗氧化酶活性等生理生化指標的測定。各處理均設(shè)置5個重復(fù)，每個重復(fù)3株。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 光合參數(shù)測定

利用Li-6400 XT便攜式光合儀(美國LI-COR)進行光合參數(shù)測定，測定時間為上午8:00—11:00，測定光強為1 200 μmol·m-2·s-1，CO2濃度設(shè)定為380 μmol·mol-1。測量葉片的凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)[21]。

1.3.2 葉綠素含量測定

參照李得孝等[22]的方法，采用乙醇浸泡法提取黃薇葉片中的光合色素，用UV-2550型紫外分光光度計(日本島津)測定葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量。

1.3.3 抗氧化酶活性和丙二醛、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測定

參照李合生[23]的方法：丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑法，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外吸收法，脯氨酸(Pro)含量測定采用磺基水楊酸提取-茚三酮顯色法，可溶性糖(SS)含量測定采用蒽酮法。

1.3.4 氣孔形態(tài)特征觀察

參照喬濱杰等[24]的方法，采用指甲油印跡法觀察氣孔形態(tài)，在100倍鏡視野下統(tǒng)計氣孔數(shù)目，除以視野面積，得出氣孔密度(SD)；在400倍鏡視野下隨機選取完整清晰的氣孔，利用Image J軟件測量氣孔長(SL)、氣孔寬(SW)和氣孔面積(SA)。每個處理觀察10個葉片，每個葉片觀測3個視野。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，對有顯著(P<0.05)差異的，采用Duncan’s新復(fù)極差法進行多重比較。試驗結(jié)果用Microsoft Excel 2019軟件制作表格，用Sigma plot 14.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對黃薇抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

正常情況下，植物體內(nèi)的活性氧產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡，維持相對穩(wěn)態(tài)。當(dāng)植物受到干旱脅迫時，植物體內(nèi)的氧化代謝平衡會遭到不同程度的破壞[25]。隨著干旱程度加深(從CK到T4處理)，黃薇的SOD、POD、CAT活性整體呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(圖1)，而MDA含量持續(xù)增長，且各處理間差異顯著(P<0.05)。T4處理下黃薇的MDA含量較CK增加257.04%。T1～T4處理下，CAT活性變化相對較小，在T2處理下達到峰值(187.537 U·mg-1)，較CK顯著(P<0.05)增加20.26%；SOD活性在T1～T2處理下維持較高活性，變化幅度較小，始終顯著(P<0.05)高于CK，但T3處理的SOD活性已降至CK水平，T4處理下SOD活性較CK顯著(P<0.05)下降37.18%；POD活性在T2處理下達到峰值，較CK顯著(P<0.05)增加68.34%，隨后活性下降，且T4處理的POD活性已顯著(P<0.05)低于CK。以上結(jié)果表明，隨著土壤水分的減少，黃薇的膜脂過氧化程度加重，導(dǎo)致丙二醛積累，細胞受到持續(xù)的氧化傷害。與此同時，植物通過產(chǎn)生抗氧化酶來抵御細胞膜透性損傷，輕中度干旱時，POD起主要保護作用，CAT和SOD活性變化相對較小，但在黃薇抗氧化中也具有積極作用[26]。

柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0. 05)。下同。

2.2 干旱脅迫對黃薇滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

植物體內(nèi)存在大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。遭遇水分脅迫時，這些物質(zhì)在維持植物細胞正常形態(tài)、調(diào)節(jié)水分平衡等方面發(fā)揮重要作用[27]。隨著干旱程度加深，黃薇的Pro含量先下降再上升，與CK相比，T1處理的Pro含量顯著(P<0.05)下降21.65%(圖2)，T3處理的Pro含量已達對照水平，T4處理的Pro含量最高，達99.18 mg·g-1。隨著干旱程度加深，SS含量依次顯著(P<0.05)增加，T4處理的SS含量較CK增加57.53%。結(jié)果表明，黃薇主要通過提高可溶性糖含量來緩解干旱脅迫帶來的傷害，具有較強的滲透調(diào)節(jié)能力。

SS， Soluble sugar.

2.3 干旱脅迫對黃薇光合作用的影響

隨著脅迫程度的加深，T1～T4處理的Pn、Gs、Tr依次顯著(P<0.05)下降，相較于CK，Pn分別下降13.85%、36.32%、61.35%、82.07%，Gs分別下降33.61%、52.27%、79.29%、91.31%，Tr分別下降52.78%、63.21%、75.15%、89.37%(圖3)。T1～T4處理下，黃薇葉片的Ci表現(xiàn)出先降后升的趨勢，在T2處理下最低，較CK顯著(P<0.05)下降了10.91%(圖3)。以上結(jié)果表明，黃薇主要通過調(diào)節(jié)Gs和Tr來降低Pn，關(guān)閉氣孔以減少CO2的攝入，從而減緩水分脅迫對植株光合系統(tǒng)的傷害。

Pn，凈光合速率；Tr，蒸騰速率；Ci，胞間CO2深度；Gs，氣孔導(dǎo)度。

2.4 干旱脅迫對黃薇光合色素的影響

隨著干旱脅迫程度加深，T1～T3處理的類胡蘿卜素、葉綠素(Chl)，及葉綠素a、b含量相應(yīng)增加，但T3、T4處理的類胡蘿卜素、葉綠素，及葉綠素a、b含量不再有顯著變化。葉綠素a和類胡蘿卜素含量在T3處理達到峰值，分別較CK顯著(P<0.05)增加43.03%和89.79%；葉綠素、葉綠素b含量在T4處理下最高，分別為6.23 mg·g-1和2.44 mg·g-1(圖4)。結(jié)果表明，隨干旱脅迫程度加深，黃薇的葉綠素含量上升，植株通過產(chǎn)生光合色素以減少干旱脅迫對光合器官帶來的損害。

2.5 干旱脅迫對黃薇氣孔形態(tài)和數(shù)量的影響

干旱脅迫下，氣孔開度減小，氣孔阻力增大，細胞吸收和傳遞CO2的效率降低，光合作用減弱[28]。觀察發(fā)現(xiàn)，黃薇葉片的上表面均未發(fā)現(xiàn)氣孔，僅下表面出現(xiàn)氣孔。隨土壤含水量減少，黃薇葉片的氣孔長、氣孔寬、氣孔面積減小，且T2處理與T1處理相比的降幅最大(表1)。氣孔密度同樣隨干旱脅迫程度的加深而逐漸降低，以T3處理與T2處理相比的降幅最大(表1)。由此可見，干旱脅迫下，黃薇主要通過關(guān)閉葉片下表皮氣孔來減少水分散失，氣孔形態(tài)結(jié)構(gòu)也發(fā)生適應(yīng)性的變化。

表1 不同處理下黃薇葉片的氣孔長、寬、面積、密度變化

2.6 干旱脅迫下黃薇葉片各生理指標的相關(guān)性

由表2可知，各生理指標中，MDA與Pro、SS、Chl呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，與POD、SOD、Pn、Gs、Tr、SA和SD呈極顯著(P<0.01)負相關(guān)。POD與CAT、SOD呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，POD、CAT分別與Pro、Ci呈極顯著(P<0.01)負相關(guān)。這些結(jié)果表明，隨著干旱脅迫程度加深，細胞膜脂過氧化加重，抗氧化酶被大量消耗，光合系統(tǒng)遭到破壞，黃薇主要通過提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和葉綠素含量來維持穩(wěn)態(tài)。也就是說，黃薇的干旱應(yīng)答是多種生理生化持續(xù)變化、協(xié)調(diào)互作的過程。

表2 不同處理下黃薇葉片各生理生化指標的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

植物在遭遇水分脅迫時，常通過形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和生長發(fā)育、生理生化響應(yīng)，及分子水平上的一系列變化等來適應(yīng)脅迫[29]。作為植物進行光合作用的重要器官，葉片通過改變氣孔分布和開閉調(diào)節(jié)氣體交換來適應(yīng)干旱脅迫。同時，葉片結(jié)構(gòu)也會進行適應(yīng)性的變化，如形成較厚的機械組織和密集氣孔等，以有效減緩葉片水分的流失[30]。研究表明，植物通過改變氣孔密度和形態(tài)來適應(yīng)干旱，并通過胞間CO2濃度的變化影響光合作用[24]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，黃薇葉片的氣孔長、氣孔寬、氣孔面積均隨脅迫程度加深而降低，在T2處理下氣孔密度較CK顯著降低，且胞間CO2濃度下降10.91%，大量下表皮氣孔閉合，導(dǎo)致Gs和Tr顯著降低。此時，Pn的下降主要由氣孔關(guān)閉導(dǎo)致。在T3、T4處理下，胞間CO2濃度出現(xiàn)回升趨勢，此時光合速率主要受非氣孔因素限制。井大煒等[31]研究也發(fā)現(xiàn)，楊樹在中重度脅迫下光系統(tǒng)Ⅱ和抗氧化酶系統(tǒng)受到損傷，Pn降低主要受非氣孔因素限制。出現(xiàn)這種情況的原因可能是，重度干旱脅迫下，光合作用受損的根本原因在于光合器官的葉綠素降解、膜脂過氧化加劇、光系統(tǒng)Ⅱ遭到破壞等非氣孔因素[32]。葉綠素含量是反映植物光合作用的一項重要指標。程宇飛等[33]發(fā)現(xiàn)，植物葉綠素含量隨干旱加深呈先升后降趨勢，葉綠素合成受阻。然而在本研究中，隨干旱脅迫程度加深，葉綠素等光合色素含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，在T3、T4處理下葉綠素含量達到峰值，這與馬富舉等[34]的結(jié)果相似。葉綠素含量增加，可能是因為葉片相對含水量減少。這是幼苗維持正常光合速率的生理適應(yīng)[35]。

干旱脅迫使細胞內(nèi)溶質(zhì)積累，滲透勢降低，以維持細胞膨壓的相對穩(wěn)定[36]?？扇苄蕴鞘窃S多植物的主要滲透調(diào)節(jié)劑，也是合成有機溶質(zhì)的碳架和能量來源之一，對細胞膜和原生質(zhì)體起穩(wěn)定作用[37]。研究發(fā)現(xiàn)，長期的輕中度干旱脅迫下，沙棘中的游離氨基酸和可溶性糖在干旱中后期顯著積累，使其具備較強的滲透調(diào)節(jié)能力，并表現(xiàn)出低水勢耐旱性[38]。本研究中，隨干旱脅迫程度加深，黃薇葉片中的脯氨酸含量先下降后上升，而可溶性糖含量隨脅迫加深逐漸增加，說明可溶性糖對黃薇抗旱具有積極作用。這與Gomes等[39]的研究結(jié)果相似。一般來說，抗旱性強的植物，其體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量積累，滲透吸水能力較強。安玉艷等[40]發(fā)現(xiàn)，較強的滲透調(diào)節(jié)能力使得杠柳具有較強的抗旱性，從而能夠適應(yīng)黃土高原氣候。

在長期的環(huán)境適應(yīng)下，植物已形成了較完善的活性氧清除系統(tǒng)，使得植物體內(nèi)的活性氧含量得以維持在一個較低的水平[41]。遭遇干旱脅迫時，植物體內(nèi)積累的活性氧生成速度加快，膜脂過氧化加重，導(dǎo)致丙二醛積累，細胞組織受到氧化傷害，影響植株正常的生理發(fā)育功能[26]。裴斌等[42]對沙棘的研究表明，抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性隨脅迫時間推進呈先升高后降低的趨勢，這與本研究結(jié)果一致。本研究中，隨土壤含水量減少，黃薇葉片中的丙二醛大量積累，抗氧化酶活性先升后降，其中POD活性在T2處理下達到峰值，SOD和CAT在T1～T3處理下均保持較高活性。由此推測，黃薇在遭遇輕中度干旱時，抗氧化酶系統(tǒng)中主要是POD在起主要作用，而隨脅迫程度加重，SOD和CAT主要負責(zé)活性氧的清除，以增強抗旱性。謝志玉等[43]研究發(fā)現(xiàn)，文冠果幼苗的SOD活性在對照和輕度干旱下相對穩(wěn)定，在重度干旱下逐漸升高，而POD活性逐漸升高，CAT活性逐漸下降。王寧等[44]研究發(fā)現(xiàn)，節(jié)節(jié)麥在輕中度干旱脅迫下，SOD活性持續(xù)增加，而在重度干旱脅迫下則呈先升后降的變化趨勢，說明短期干旱誘導(dǎo)了節(jié)節(jié)麥SOD活性的增強。面對干旱脅迫時，植物體內(nèi)不同的抗氧化酶呈現(xiàn)不同的變化和應(yīng)答反應(yīng)，推測植物的抗旱性與其體內(nèi)保護酶系統(tǒng)和活性氧的清除直接相關(guān)[45-46]。

綜上，干旱脅迫下黃薇的Pn顯著下降，通過關(guān)閉氣孔和提高葉綠素含量來保護光合系統(tǒng)，并產(chǎn)生抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持細胞相對穩(wěn)態(tài)，以適應(yīng)土壤水分變化。黃薇對輕中度干旱有較好的適應(yīng)性，在日常養(yǎng)護中應(yīng)注意及時補充水分，避免長時間的重度干旱。對黃薇干旱脅迫下各生理指標的相關(guān)性進行分析，發(fā)現(xiàn)抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和光合參數(shù)等生理指標密切相關(guān)，可為后續(xù)選種培育提供參考。本研究結(jié)果有助于進一步建立完善的黃薇抗旱體系，對黃薇在江浙地區(qū)的生產(chǎn)和栽培應(yīng)用具有積極意義，但分子水平上的調(diào)控機理還有待進一步探究。