益生元對益生菌的增殖效應(yīng)實驗在本科教學(xué)中的應(yīng)用

劉麗艷，馮 坤，婁文勇，蘇健裕，吳 虹

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，輕工與食品國家級實驗教學(xué)示范中心，廣東 廣州510640)

0 引言

食品微生物學(xué)是食品科學(xué)與工程專業(yè)的主干課程，食品微生物學(xué)實驗是實踐教學(xué)中的重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)有實驗教學(xué)通過對學(xué)生基礎(chǔ)實驗技能的培養(yǎng)，較好地完成了理論課知識的驗證，但由于實驗內(nèi)容簡單且欠缺關(guān)聯(lián)性等因素，使得課程結(jié)束后學(xué)生理論聯(lián)系實際尚不足，對科學(xué)研究的認知度仍欠缺。目前，基于“新工科”建設(shè)背景下，食品微生物實驗課的教學(xué)改革仍處于起步階段，為了提高食品微生物課程的教學(xué)水平，以工程素質(zhì)人才培養(yǎng)為導(dǎo)向，結(jié)合學(xué)科發(fā)展前沿技術(shù)及與生活緊密相關(guān)的科學(xué)問題，對微生物實驗課進行教學(xué)內(nèi)容和實踐模式的雙重優(yōu)化，開展綜合型探索性實驗具有重要意義[1-2]。

隨著人類腸道菌群的發(fā)現(xiàn)及其對健康重要作用的逐步明確，益生菌成為微生物領(lǐng)域關(guān)注的熱點[3]。益生菌是指對人體健康有益且與人共生的細菌或微生物。益生元是益生菌的食物，是指一些不被宿主消化吸收卻能夠選擇性地促進體內(nèi)有益菌的代謝和增殖，從而改善宿主健康的有機物質(zhì)[4]。目前，常用的益生元有低聚糖類，包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖和菊粉等。此外，多糖如云芝多糖、胡蘿含氮多糖，以及有些微藻類和天然植物中的蔬菜、中草藥等也能作為益生元使用[5]。益生元在促進結(jié)腸菌群的生長，改善腸道微生態(tài)，促進脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與礦物類代謝方面具有重要意義，愈來愈廣泛地被應(yīng)用于食品、飼料等領(lǐng)域中。

本實驗以低聚果糖(FOS)、低聚異麥芽糖(IMO)作為培養(yǎng)基碳源，以無糖培養(yǎng)基和普通MRS培養(yǎng)基為陰性和陽性對照，考察低聚糖益生元對干酪乳桿菌(L.casei)增殖作用的影響。從實驗教學(xué)案例建設(shè)、實驗項目的組織及實施過程、實驗結(jié)果交流展示等方面總結(jié)了探索性實驗項目“益生元對益生菌的增殖效應(yīng)實驗”在本科實驗教學(xué)中的實施過程，為食品微生物學(xué)實驗教學(xué)體系更新提供教學(xué)案例，供同類課程交流、探討。

1 益生元對干酪乳桿菌的體外生長調(diào)節(jié)作用實驗

1.1實驗?zāi)康?/h3>

掌握滅菌、梯度稀釋、微生物的接種、培養(yǎng)及菌落計數(shù)等操作。完成兩種低聚糖對干酪乳桿菌的增殖效應(yīng)檢測，了解益生元對益生菌體外增殖效應(yīng)評價的方法。

1.2材料及儀器

(1)菌種。干酪乳桿菌ATCC393。

(2)無糖MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備。蛋白胨，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，10.0 g；酵母提取物，南京全隆生物技術(shù)有限公司，5.0 g；乙酸鈉，西隴科學(xué)股份有限公司，5.0 g；二水合檸檬酸三銨，阿拉丁試劑(上海)有限公司，2.0 g；三水合磷酸氫二鉀，廣州化學(xué)試劑廠，2.0 g；七水合硫酸鎂，阿拉丁試劑(上海)有限公司，0.2 g；四水合硫酸錳，合肥巴斯夫生物科技有限公司，0.05 g；吐溫-80，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，1 mL[6]。pH值調(diào)為6.2，滅菌條件為115 ℃，20 min。

(3)其他試劑。低聚果糖(FOS，純度>99%)、低聚異麥芽糖(IMO，純度>99%)購自上海伯奧生物科技有限公司。

(4)儀器及器皿。滅菌鍋、厭氧培養(yǎng)箱、天平、移液槍及槍頭、接種環(huán)、pH計、紫外分光光度計、超凈工作臺、具塞錐形瓶、培養(yǎng)皿和具塞試管等。

1.3實驗步驟及內(nèi)容設(shè)計

1.3.1菌株活化

取一定量受試干酪乳桿菌冷凍甘油管接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，涂片并革蘭氏染色，經(jīng)顯微鏡檢符合干酪乳桿菌顯微形態(tài)學(xué)特征后，即可以進一步實驗。

1.3.2實驗分組

(1)實驗條件1：不同益生元對干酪乳桿菌的增殖效應(yīng)。

無糖MRS培養(yǎng)基中分別添加2%(w/v)葡萄糖、2%(w/v)FOS、2%(w/v)IMO，以無糖MRS培養(yǎng)基為對照。將活化后的菌液以1%(v/v)比例接種到對應(yīng)的試管中，并于接種后2、4、6、8、10、12和16 h定時取樣，于600 nm波長條件下測定培養(yǎng)物的OD值，同時測定發(fā)酵液pH值，比較益生菌在不同培養(yǎng)基中的生長情況。

(2)實驗條件2：不同濃度FOS對干酪乳桿菌的增值效應(yīng)。

無糖MRS培養(yǎng)基中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%(w/v)FOS，以無糖MRS培養(yǎng)基為對照。將活化后的菌液以1%(v/v)比例接種到對應(yīng)的試管中，并于接種12 h后取樣，于600 nm波長條件下測定培養(yǎng)物的OD值，同時測定發(fā)酵液pH值，比較干酪乳桿菌在不同濃度FOS中的生長情況。

以上數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次，取平均值。

1.3.3生長指數(shù)的計算

通過生長指數(shù)法來測定細胞生長情況，以Growth Index(GI)值為指標，比較益生菌在不同低聚糖和葡萄糖上的生長情況[7]。

式中AP16——含有樣品益生元的干酪乳桿菌發(fā)酵液在培養(yǎng)16 h后于600 nm波長條件下的吸光度

AG16——含有樣品葡萄糖的干酪乳桿菌發(fā)酵液在培養(yǎng)16 h后于600 nm波長條件下的吸光度

AC16——含有無糖MRS培養(yǎng)基的干酪乳桿菌發(fā)酵液在培養(yǎng)16 h后于600 nm波長條件下的吸光度

AP0——含有樣品益生元的干酪乳桿菌發(fā)酵液0 h的吸光度讀數(shù)

AG0——含有樣品葡萄糖的干酪乳桿菌發(fā)酵液0 h的吸光度讀數(shù)

AC0——含有無糖MRS培養(yǎng)基的干酪乳桿菌發(fā)酵液0 h的吸光度讀數(shù)

1.4實驗結(jié)果與討論

1.4.1不同益生元對益生菌的增殖效應(yīng)

分別以2%FOS、2%IMO作為碳源，在無糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下，相較于2%葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基，生長曲線直接體現(xiàn)出不同益生元對益生菌的增殖效應(yīng)。隨著干酪乳桿菌的增殖，其代謝產(chǎn)生的有機酸使得培養(yǎng)基pH值降低，因此，培養(yǎng)液的pH值可以反映出不同碳源對益生菌的增殖效果[8-9]。干酪乳桿菌以葡萄糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基及基礎(chǔ)對照培養(yǎng)基中的生長曲線和pH值變化曲線如圖1所示。

圖1 干酪乳桿菌的生長曲線和pH值曲線Fig.1 Growth curves and pH curves of L.casei

由于益生菌增殖過程中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，培養(yǎng)液OD600增加的同時pH值降低，反映了益生菌在各培養(yǎng)液中生長的能力。由圖1可知，培養(yǎng)2～10 h，干酪乳桿菌在Glc、FOS、IMO為碳源的培養(yǎng)液中的生長曲線呈現(xiàn)顯著增長，pH值曲線同步下降。10 h之后進入生長穩(wěn)定期，隨后生長曲線及pH值曲線均趨于平穩(wěn)。而無糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，干酪乳桿菌培養(yǎng)液的OD600水平較低，pH值變化不顯著。干酪乳桿菌在以FOS、IMO為碳源發(fā)酵時表現(xiàn)出相似的生長活性，說明兩種低聚糖對干酪乳桿菌均有益生效果。發(fā)酵16 h后，各發(fā)酵液的OD600均達到了最高水平，以FOS為碳源的培養(yǎng)液的OD600值為2.63，略低于Glc組的2.80，高于IMO組的2.31。此時，生長在以FOS為碳源的培養(yǎng)液中，干酪乳桿菌的GI為92.93，大于以IMO為碳源的培養(yǎng)液中干酪乳桿菌的GI，且以FOS為碳源的培養(yǎng)液的pH值高于Glc組，低于IMO組。生長指數(shù)較高的低聚糖碳源被認為對益生菌的益生元效果更好，因此2%FOS對干酪乳桿菌的益生效應(yīng)優(yōu)于2%IMO。

1.4.2不同濃度FOS對干酪乳桿菌的增值效應(yīng)

無糖MRS培養(yǎng)基中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%(w/v)FOS作為碳源，干酪乳桿菌經(jīng)12 h發(fā)酵后培養(yǎng)液的OD600和pH值如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)FOS濃度<2%時，隨著FOS濃度的增加，培養(yǎng)液發(fā)酵12 h的OD600逐漸增大，pH值逐漸降低；FOS濃度達到2%時，OD600達最大值2.69，pH值為4.02；繼續(xù)增加FOS濃度到4%，培養(yǎng)液發(fā)酵12 h的OD600及pH值均無明顯變化。因此，F(xiàn)OS作為碳源促進干酪乳桿菌的增殖效果較好濃度為2%。

2 實驗項目的組織與實施

本實驗內(nèi)容屬于研究性實驗項目，在教學(xué)方法上支持學(xué)生研究性學(xué)習(xí)、主動探索和實踐、分析并解決問題，其目的是讓學(xué)生獨立思考、自主學(xué)習(xí)，啟發(fā)學(xué)生的科研思維并培養(yǎng)其綜合能力。研究性教學(xué)的指導(dǎo)思想就是把科研的過程轉(zhuǎn)化為本科教學(xué)的實踐，目的是為本科教學(xué)體系打下科學(xué)研究的基礎(chǔ)[10]。本實驗的實施過程分為3個階段。

注：小寫字母表示實驗結(jié)果的顯著性差異(P<0.05)圖2 干酪乳桿菌以不同濃度FOS為碳源發(fā)酵12 h的生長曲線和pH值曲線Fig.2 Growth curve and pH curve of L.casei fermented for 12 hours with different concentrations of FOS

2.1課前開展分組討論并確定實驗方案

以24人教學(xué)班為例，學(xué)生2人一組，共分為12組，按實驗條件設(shè)置2個項目任務(wù)，每6組同學(xué)對應(yīng)相同實驗任務(wù)開展實驗。在實施的過程中，學(xué)生在教師的指導(dǎo)下，圍繞具體的項目任務(wù)，以團隊的形式分工合作來開展實驗項目。教師在開課前兩周布置項目任務(wù)及主要內(nèi)容，強調(diào)注意事項。要求每位學(xué)生參與查閱文獻資料，先在小組內(nèi)開展分析、討論，結(jié)合所查文獻和已掌握的實驗操作技能初步設(shè)計實驗方案。

教師在開課前一周統(tǒng)一組織課堂討論，按照實驗的可行性、準確性等要求對各組實驗方案進行審查，指出實驗方案的優(yōu)缺點。學(xué)生利用接下來的一周時間修訂實驗方案，教師課前再次檢查并確定實驗最終方案[11]。

2.2在課堂實施過程帶入研究理念

本項目采取研究性的項目教學(xué)法，學(xué)生同時兼任實驗項目的管理者和執(zhí)行者，學(xué)生由被動學(xué)習(xí)變?yōu)橹鲃訉W(xué)習(xí)，教師由課堂教學(xué)的講授者、主導(dǎo)者變?yōu)橐龑?dǎo)者。各小組按照經(jīng)確定的實驗方案開展實驗，在實驗過程中，隨堂巡視的教師不少于3位，每位教師負責(zé)8位左右學(xué)生，小組成員分工合作，合理安排任務(wù)，實驗過程中遇到的困難，先在小組內(nèi)討論解決辦法，再尋求隨堂教師幫助。教師對學(xué)生實驗的各個環(huán)節(jié)進行跟蹤點評，提醒學(xué)生關(guān)注每個實驗單元的實驗原理和規(guī)范實驗操作手法，引導(dǎo)學(xué)生觀察益生菌生長指標的變化規(guī)律，比較添加的益生元種類及添加量對益生菌生長曲線及pH值曲線的影響，提示學(xué)生注意不同檢測指標之間的聯(lián)系，分析實驗過程中數(shù)據(jù)的變化規(guī)律和蘊含的生物學(xué)機理，以此方式將科學(xué)研究的理念帶入課堂，把研究性的項目教學(xué)法在本科實驗課堂上落實并拓展[12]。

2.3綜合分析實驗結(jié)果并以研究論文的形式呈現(xiàn)

實驗完成后，學(xué)生對實驗結(jié)果進行比較與討論，分析實驗結(jié)果是否達到課程要求的研究目標，總結(jié)整個實驗過程，找出實驗成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及實驗操作關(guān)鍵點，實驗報告以可正式發(fā)表的研究論文形式呈現(xiàn)，以此訓(xùn)練學(xué)生的科技論文寫作能力。教師對學(xué)生的操作技能、結(jié)果分析能力、論文寫作能力等方面進行綜合評定[13]。以自愿或推薦的方式選出4組進行總結(jié)交流，這4組同學(xué)分別制作PPT向全體學(xué)生和教師展示實驗過程、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果的推理論斷，報告會上鼓勵交流、隨時提問，以此積累口頭表達和學(xué)術(shù)交流經(jīng)驗[14]。

3 結(jié)束語

探索性實驗項目在本科教學(xué)中引發(fā)了學(xué)生對學(xué)科研究的興趣，每個實驗環(huán)節(jié)相對獨立，但數(shù)據(jù)間又有聯(lián)系，前一環(huán)節(jié)的實驗數(shù)據(jù)與后續(xù)的實驗數(shù)據(jù)互相印證，這種數(shù)據(jù)對比性較強的實驗項目，使得學(xué)生對實驗數(shù)據(jù)精確性的重視程度增強，從而提高了實驗結(jié)果的準確性。

課程教學(xué)采取科學(xué)研究的方法，教師為學(xué)生搭建交流探討的平臺，營造互幫互助的教學(xué)氛圍，從提出問題到解決問題的全過程模擬科研過程，把傳統(tǒng)的“以課程為中心”的實驗教學(xué)切換為“以問題為中心”，學(xué)生通過探索性實驗將實驗操作單元與理論知識融會貫通，知識把握更加系統(tǒng)，更重要的是培養(yǎng)學(xué)生利用科研思維進行自主研究的能力及團隊合作精神，使其順利開啟職業(yè)生涯并盡快適應(yīng)社會。