COL2在絕經(jīng)后女性中的表達(dá)與骨質(zhì)疏松相關(guān)性的研究

韓衍龍 米爾阿里木·木爾提扎 它依爾江·舉來提 趙巍 哈巴西·卡肯 王利

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關(guān)節(jié)老年病區(qū)，新疆 烏魯木齊 830000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨骼疾病，其特點(diǎn)是骨質(zhì)密度降低、骨質(zhì)脆性增大、骨組織結(jié)構(gòu)退化致骨量減少和容易骨折[1-2]。引起骨質(zhì)疏松癥的因素有多種，例如雌激素缺乏、年齡及遺傳因素等[3]。世界衛(wèi)生組織(WHO)公布有關(guān)骨質(zhì)疏松癥的數(shù)據(jù)顯示，OP影響了美國(guó)、歐洲、日本和中國(guó)約7500萬人[4]。絕經(jīng)后女性是易患骨質(zhì)疏松癥的高危人群，其重要原因就是雌激素缺乏[5]。骨質(zhì)疏松又大大增加髖部骨折的發(fā)生率，進(jìn)而降低患者的生活質(zhì)量，增加致殘率，甚至增加死亡率。

膠原蛋白是人體細(xì)胞外間質(zhì)的主要成分之一，是人體蛋白質(zhì)大家族成員，目前一共有14種類型，共兩大類：纖維性膠原和非纖維性膠原，分布特點(diǎn)及功能各不相同。目前研究表明，Ⅱ型膠原蛋白(Collagen Ⅱ，COL2)主要是軟骨細(xì)胞分泌合成，大多數(shù)見于骨骼、關(guān)節(jié)、肌腱等組織，Ⅱ型膠原蛋白是正常軟骨細(xì)胞分泌的主要膠原蛋白，Ⅰ型膠原蛋白非常罕見[6]，骨性關(guān)節(jié)炎病程中的重要環(huán)節(jié)是Ⅱ型膠原蛋白形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞[7-8]，進(jìn)而引起軟骨生物力學(xué)、生物化學(xué)等一系列變化[9-11]。相關(guān)研究[12]表明，肌肉減少癥的主要特征就是 II 型肌纖維和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量減少，嚴(yán)重影響了肌肉強(qiáng)度及身體平衡能力。因此，肌肉減少癥患者具有較高的跌倒風(fēng)險(xiǎn)性，特別是骨量減少及骨質(zhì)疏松的患者，這是發(fā)生髖部骨折的重要原因。但至今有關(guān)Ⅱ型膠原蛋白與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性未見報(bào)道，本研究通過骨量正常、骨量減少、骨質(zhì)疏松和嚴(yán)重骨質(zhì)疏松4組患者骨骼肌中Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)的差異性，探討Ⅱ型膠原蛋白與骨質(zhì)疏松之間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 入選對(duì)象

選取自2017年1月至2019年12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關(guān)節(jié)老年病區(qū)就診的絕經(jīng)后女性髖部骨折患者共60例，平均年齡(64.5±11.4)(48～89)歲，按照雙能X線骨密度(DXA)檢測(cè)分為骨量正常、骨量減少、骨質(zhì)疏松和嚴(yán)重骨質(zhì)疏松4組，每組各15例。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①絕經(jīng)后女性；②髖部骨折；③行手術(shù)治療(人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)或內(nèi)固定術(shù)“動(dòng)力髖鋼板內(nèi)固定術(shù)”(DHS)或閉合復(fù)位髓內(nèi)釘固定術(shù)(PFNA)；④患者自愿參加、知情同意，并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①吸煙、飲酒者；②近3個(gè)月服用影響骨代謝的藥物(如糖皮質(zhì)激素)者；③患有影響骨骼肌肉代謝的疾病(如糖尿病、腫瘤、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)者；④合并有嚴(yán)重疾病(如冠心病、慢性阻塞性肺疾病、肺心病、肝腎功能不全、血液病)者；⑤患有其他骨骼肌肉疾病者。

1.3 方法設(shè)計(jì)

術(shù)前行雙能量X線骨密度(DXA)檢測(cè)，分為骨量正常、骨量減少、骨質(zhì)疏松和嚴(yán)重骨質(zhì)疏松4組，術(shù)中取患者相同部位的股外側(cè)肌肉組織，放入-80 ℃存放待測(cè)，然后行RT-PCR及免疫組化檢測(cè)COL2的mRNA及蛋白的表達(dá)水平，并對(duì)結(jié)果行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)本制作：術(shù)中取患者相同部位的無損傷的股外側(cè)肌肉組織兩份，一份肌肉組織切成3 mm ×3 mm ×3 mm，置于-80 ℃存放，用于RT-PCR檢測(cè)；另一份肌肉組織切成5 mm ×5 mm ×5 mm，多聚甲醛固定，石蠟包藏，用于免疫組化檢測(cè)。

RT-PCR檢測(cè)mRNA：①Trizol法提取RNA，取微量分光光度計(jì)對(duì)溶解后的RNA 2 μL進(jìn)行測(cè)定OD260、OD280和OD260/OD280值，并且根據(jù)結(jié)果計(jì)算出RNA的純度和濃度。

②反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照表1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。③RT-PCR檢測(cè)，按照表2、3進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系Table 1 The reverse transcription system

表2 RT-PCR檢測(cè)引物信息Table 2 The primers for RT-PCR

表3 RT-PCR反應(yīng)體系(μL)Table 3 The RT-PCR system(μL)

免疫組化(IHC)檢測(cè)：用65 ℃恒溫箱對(duì)組織切片進(jìn)行烘烤1.5～2 h；取新鮮組織切片，分兩次放入二甲苯中各浸泡10 min；放入無水酒精靜止5 min，再置于95 %、90 %、80 %、70 %乙醇、蒸餾水各靜放5 min；把 0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)放入高壓鍋中煮沸，然后把切片放入修復(fù)液中，一直加熱到排氣，斷火，在緩沖液中浸泡10 min，然后冷卻；去除內(nèi)源性過氧化物酶；用PBS浸泡不銹鋼提籃；按照合適比例對(duì)一抗進(jìn)行稀釋(表4)，然后在每張片子里加入稀釋后的一抗50 μL，放在4 ℃環(huán)境中過夜(第二天需室溫復(fù)溫20 min)；將辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗50 μL放入，在室溫中靜放20 min；再把不銹鋼提籃放在PBS里浸泡；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液50 μL，放在室溫中孵育20 min；再次把不銹鋼提籃放在PBS里浸泡；用DAB進(jìn)行顯色3～10 min，利用顯微鏡觀察染色程度(DAB顯色為棕色顆粒狀沉淀)，并記錄；放在自來水里將顯色終止3 min；蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化數(shù)秒(1～2 s)；自來水中反藍(lán)5 min；分別在蒸餾水、70 %、80 %、90 %、95 %乙醇中浸泡3 min，再在無水乙醇Ⅰ、Ⅱ，分別浸泡5 min；在二甲苯Ⅰ、Ⅱ，分別浸泡5 min；中性樹膠封片；37 ℃烤片過夜。

表4 抗體稀釋比例Table 4 The ratio of antibody dilution

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)COL2 mRNA結(jié)果

RT-PCR檢測(cè)COL2 mRNA結(jié)果顯示，由圖1可知COL2 mRNA在骨量正常組、骨量減少組、骨質(zhì)疏松組和嚴(yán)重骨質(zhì)疏松組4組中的表達(dá)量呈逐漸減少趨勢(shì)，骨量正常組中COL2 mRNA的表達(dá)水平與骨量減少組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；COL2 mRNA在骨量減少組的表達(dá)水平明顯高于骨質(zhì)疏松組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；骨質(zhì)疏松組中的COL2 mRNA的表達(dá)水平明顯高于嚴(yán)重骨質(zhì)疏松組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 COL2 mRNA表達(dá)水平與骨量分組之間的關(guān)系Fig.1 The correlation between COL2 mRNA expression level and bone mass grouping

2.2 免疫組化(IHC)檢測(cè)COL2蛋白表達(dá)

免疫組化檢測(cè)COL2蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，COL2蛋白表達(dá)情況被染為棕褐色，由圖2可知，棕褐色顆粒數(shù)目在骨量正常組、骨量減少組、骨質(zhì)疏松組和嚴(yán)重骨質(zhì)疏松組4組中的表達(dá)量呈逐漸減少趨勢(shì)，在骨量正常組和骨量減少組的表達(dá)情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；COL2蛋白在骨量減少組的表達(dá)明顯強(qiáng)于骨質(zhì)疏松組，而在骨質(zhì)疏松組的表達(dá)明顯強(qiáng)于嚴(yán)重骨質(zhì)疏松組。

圖2 免疫組化檢測(cè)COL2蛋白的表達(dá)結(jié)果Fig.2 The results of protein level of COL2 detected with immunohistochemistry

3 討論

骨質(zhì)疏松癥( osteoporosis，OP) 是一種全身性骨骼疾病，使骨質(zhì)密度降低、骨強(qiáng)度下降、骨質(zhì)脆弱，從而容易發(fā)生骨折[13]。在解剖位置上，肌肉與骨骼相互毗鄰，它們的旁分泌和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)擁有著共同通路，分子信號(hào)調(diào)節(jié)通路相似，并且有著相似的治療靶點(diǎn)及藥物[14]。肌肉纖維減少和骨質(zhì)疏松共同作用影響患者身體的平衡，使患者容易發(fā)生跌倒，增加脆性骨折的概率，大大降低患者的生活質(zhì)量，尤其是絕經(jīng)后女性。眾所周知，絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質(zhì)疏松的概率會(huì)明顯上升，進(jìn)而絕經(jīng)后女性是發(fā)生髖部骨折的高危人群。隨著人口老齡化逐年發(fā)展，有專家預(yù)計(jì)骨質(zhì)疏松性髖部骨折的發(fā)生會(huì)在2050年呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)[15]。相關(guān)研究預(yù)測(cè)，到2050年，髖部骨折的數(shù)量將從2018年的1 124 060例增加到2 563 488例[16]。肌肉與骨骼不同之處在于，人的年齡在25歲前機(jī)體的肌肉量就已達(dá)到頂峰時(shí)期，隨著年齡增長(zhǎng)，肌纖維數(shù)量也在逐年減少，其中肌肉質(zhì)量的下降程度明顯低于肌肉強(qiáng)度和肌肉力量的下降程度[17]。肌肉減少癥很早以前就被人提出過，所謂肌肉減少癥也稱為肌少癥(Sarcopenia)，是指與年齡相關(guān)的全身肌量減少和/或肌肉強(qiáng)度下降或肌肉生理功能減退，導(dǎo)致身體平衡能力及活動(dòng)程度明顯下降的一種退行性疾病[18]。肌肉減少癥與骨質(zhì)疏松癥是導(dǎo)致絕經(jīng)后女性患者發(fā)生髖部骨折的兩大重要因素，大大降低了絕經(jīng)后女性的生活質(zhì)量，增加了死亡率。

髖部骨折對(duì)患者身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重有害影響，在經(jīng)濟(jì)和精神方面，對(duì)患者家庭帶來巨大負(fù)擔(dān)，對(duì)患者本人造成重大心理創(chuàng)傷，對(duì)社會(huì)產(chǎn)生較大的負(fù)面影響。肌肉減少癥主要是Ⅱ型肌肉纖維的減少，并伴有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量減少，導(dǎo)致肌肉含量及功能受到嚴(yán)重的有害影響，進(jìn)而引起步速減慢、身體搖擺性增加，最終造成人體平衡能力大大減弱，增加了跌倒的風(fēng)險(xiǎn)，而跌倒往往又是髖部骨折的直接誘因[19-20]。為預(yù)防髖部骨折的發(fā)生，降低其發(fā)生率，必須找到干預(yù)的靶點(diǎn)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，Ⅱ型膠原蛋白生成主要由軟骨細(xì)胞分泌，而軟骨細(xì)胞普遍存在于肌腱、關(guān)節(jié)、骨骼等組織，至今未見文獻(xiàn)報(bào)道Ⅱ型膠原蛋白在骨骼肌中表達(dá)水平與骨質(zhì)疏松之間的相關(guān)性。

本研究選取絕經(jīng)后發(fā)生髖部骨折的女性患者60例，并且都行手術(shù)治療，術(shù)中同一個(gè)術(shù)者取相同部位的無損傷的股外側(cè)肌肉組織，RT-PCR結(jié)果顯示在骨量正常和骨量減少兩組中COL2 mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；然而在骨量減少組中COL2 mRNA的表達(dá)水平明顯高于骨質(zhì)疏松組(P<0.05)；嚴(yán)重骨質(zhì)疏松組中的COL2 mRNA的表達(dá)水平明顯低于骨質(zhì)疏松組(P<0.05)。免疫組化(IHC)檢測(cè)結(jié)果顯示，COL2蛋白的表達(dá)在骨量正常和骨量減少兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，COL2蛋白在骨質(zhì)疏松組中的表達(dá)明顯弱于骨量減少組(P<0.05)，而在嚴(yán)重骨質(zhì)疏松組中的表達(dá)明顯弱于骨質(zhì)疏松組(P<0.05)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出，COL2是與骨質(zhì)疏松呈負(fù)相關(guān)性的，COL2又是肌肉減少癥的主要影響因素，COL2是與骨質(zhì)疏松及肌肉減少癥相關(guān)的因素，然而骨質(zhì)疏松和肌肉減少癥共同影響著絕經(jīng)后女性的身體的平衡能力，導(dǎo)致患者易跌倒，進(jìn)而增加髖部骨折的發(fā)生機(jī)率，大大降低患者的生活質(zhì)量[21-22]。

Binkley 等[23]根據(jù)對(duì)肌肉和骨骼的研究，以及結(jié)合對(duì)肌少癥和骨質(zhì)疏松癥的了解，提出了 “肌少-骨質(zhì)疏松癥”的概念，主要是指臨床確診為骨質(zhì)疏松癥的患者同時(shí)伴有肌肉質(zhì)量和/或功能的下降。結(jié)合我國(guó)的國(guó)情[24-25]，建議相關(guān)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)如下：①DXA評(píng)估骨量和肌肉量；② 測(cè)試步速，以0.8 m/s為臨界值；③在靜息情況下評(píng)估優(yōu)勢(shì)手握力( AWGS 推薦的標(biāo)準(zhǔn))。依據(jù)DXA結(jié)果，若肌肉量<-2 SD(參照青年健康人峰值)可診斷為肌量減少，骨量<-2.5 SD(健康人峰值)可診斷為骨質(zhì)疏松癥，同時(shí)滿足“肌少癥”和“骨質(zhì)疏松癥”的患者，診斷可以考慮為“肌少-骨質(zhì)疏松癥”。此病的最大危害就是增加了骨質(zhì)疏松性髖部骨折相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，但至今對(duì)“肌少-骨質(zhì)疏松癥”的認(rèn)識(shí)不夠充分，還需更多的臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，目前也沒有有效的治療藥物，還不能夠采取有效的干預(yù)措施來預(yù)防及治療此病，這就需要更多的學(xué)者及研究人員去尋找有效的治療或干預(yù)靶點(diǎn)，此研究從Ⅱ型肌肉纖維的減少是肌肉減少癥的主要特征著手，來探討Ⅱ型膠原蛋白與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性，從而尋找更有力的預(yù)防或治療肌肉減少癥和骨質(zhì)疏松的有效靶點(diǎn)，本研究的結(jié)果顯示，COL2與骨質(zhì)疏松呈間接負(fù)相關(guān)性，而COL2與肌肉減少癥呈直接正相關(guān)性。

綜上所述，Ⅱ型膠原蛋白代謝指標(biāo)可以有效地預(yù)測(cè)肌肉纖維和骨質(zhì)疏松的情況，可反映骨代謝水平，可評(píng)估肌肉減少和骨質(zhì)疏松的程度，預(yù)測(cè)骨折發(fā)生的危險(xiǎn)性，從而采取有效的預(yù)防措施，減少絕經(jīng)后女性患者的髖部骨折發(fā)生率，甚至降低致殘率和死亡率。另外，Ⅱ型膠原蛋白可能是研究絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松患者髖部骨折的治療靶點(diǎn)，但還需更多的臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步的驗(yàn)證。

本研究的不足之處，此研究的樣本量有點(diǎn)少，不能夠充分地證明Ⅱ型膠原蛋白與骨質(zhì)疏松之間的相關(guān)性，還需更大的實(shí)驗(yàn)樣本量，更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證此研究結(jié)果。