lncRNA ANCR調節(jié)骨質疏松大鼠脂肪源性干細胞分化成骨細胞及對Wnt信號通路的作用機制

史正亮 張華 范志勇 宋永周 李身泰 李秋童 馬維

河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是中老年群體常見的疾病。對于老年性骨質疏松癥，主要是由于老年群體隨著年齡的增長，骨骼中單位體積的骨量減少，質量改變，使得骨密度下降[1-2]。脂肪源性干細胞(ADSCs)是一種間充質干細胞，能夠從脂肪組織中分離得到。近代研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，ADSCs與骨髓間充質干細胞(BMSCs)的形態(tài)、作用均較為相近，且ADSCs的提取較為簡單。因此，臨床研究人員欲將ADSCs作為治療疾病的細胞來源，用作分化成骨細胞、脂肪細胞等多種細胞，從而應用于臨床治療。LncRNA可以調節(jié)染色體結構、基因表達，并在人類疾病的發(fā)展過程中占有關鍵地位，目前它們被定位為多種疾病的潛在生物標志物[4]。分化拮抗非蛋白質編碼RNA(ANCR)是一種與眾多疾病相關的lncRNA[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，ANCR在多種疾病中異常表達，且發(fā)現(xiàn)ANCR在人骨髓間充質干細胞成骨分化過程中發(fā)揮著核心調節(jié)作用，但有關LncRNA ANCR對ADSCs向成骨分化的影響作用研究較少。Wnt信號通路在動物間存在遺傳學上的高度保守性，不同的物種間很相似，但又不相同[7]，Wnt通路是Wnt基因調控的重要信號之一，Wnt基因在多種疾病及細胞中均有明顯表達，但Wnt信號通路在LncRNA ANCR調控ADSCs成骨分化的作用效果還未可知[8]。因此，本研究將對lncRNA ANCR調節(jié)骨質疏松大鼠脂肪源性干細胞分化成骨細胞及對Wnt信號通路的作用機制展開探討。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取河北省動物實驗中心的雄性SD大鼠，常規(guī)飼養(yǎng)，每日給予大鼠70 mg/kg維甲酸灌胃處理，連續(xù)灌胃2周，采用X射線骨密度儀檢測大鼠前股骨骨密度，根據(jù)骨密度值以確定大鼠模型建立成功[9]，剔除造模失敗的大鼠。維甲酸購自廣州阿達拉生物科技公司；蘇木精購自寶雞市辰光生物公司；胎牛血清購自上海傳秋；兔抗人BMP-2抗體購自上海北諾。

1.2 方法

1.2.1脂肪源性干細胞原代培養(yǎng)：無菌條件下切取OP大鼠雙側腹股溝的脂肪墊，剪碎至糊狀，常規(guī)培養(yǎng)。接種在細胞培養(yǎng)瓶中，將原代干細胞在DMEM培育液中培養(yǎng)，保存于-80 ℃環(huán)境中。

1.2.2細胞轉染及分組：將lncRNA ANCR siRNA 慢病毒載體及空載體慢病毒各30 pmol制備成復合物，按說明書操作與濃度為2×105/mL的細胞轉染24 h，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。共分為三組，siRNA組、空載體組和干細胞組。采用RT-PCR法檢測LncRNA ANCR是否轉染成功。

1.2.3RT-PCR法：把保存在- 80 ℃環(huán)境中脂肪源性干細胞取出，研磨細胞，提取總RNA，進行逆轉錄。所有反應嚴格按照反應的條件進行擴增，內參采用GAPDH，95 ℃預變性3 min ，95 ℃變性5 s，60 ℃退火1 min，共進行40次。取得平均值后得到Ct值，計算方法用2-△△Ct法進行分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4堿性磷酸酶染色法：將細胞平鋪至6孔板中誘導培養(yǎng)至第7天，制備堿性磷酸酶染色液進行染色。去除多余培養(yǎng)基，PBS液沖洗3次，每次1 min。加入1 mL堿性磷酸酶染色工作液，搖勻并確保充分覆蓋。常溫下避光孵育60 min。除去染色液，PBS液沖洗2次，最后置于顯微鏡下觀察成骨染色效果，并拍攝記錄。

1.2.5茜素紅染色實驗：將細胞誘導培養(yǎng)至第21天，制備茜素紅進行染色。步驟與1.2.4相同，每孔加入2 mL 4 %多聚甲醛溶液，固定30 min。沖洗后加入2 mL茜素紅染液染5 min。除去染液，PBS沖洗3次，顯微鏡下觀察成骨染色效果，并拍攝記錄。

1.2.6免疫組化法：細胞常規(guī)脫蠟、水化，加阻斷過氧化物酶，PBS 漂洗。加一抗Wnt(1∶400)、β-catenin(1∶600)，孵育，漂洗，加二抗，重復以上步驟。甩干后滴加 DBA顯色劑、蘇木精，脫水、透明、封片，5 min內測量OD值；繪制標準曲線，計算陽性的表達量。

1.2.7Western blot法：將脂肪源性干細胞進行裂解并提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在- 20 ℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按照4∶1的比例進行混均，然后將蛋白溶液全部進行煮沸處置，使其變性。蛋白加脫脂奶粉放PVDF膜上，加入1抗(Wnt，1∶400；β-catenin，1∶600；內參為GAPDH)，TTBS漂洗3次，加2抗，封閉1 h。TTBS漂洗，DAB顯色，拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 原代培養(yǎng)細胞

原代培養(yǎng)的脂肪干細胞24 h即可見細胞貼壁，多數(shù)貼壁細胞呈小圓形，其中散在少量的梭形細胞或多角細胞。見圖1。

圖1 原代細胞觀察(三代，400×，20 μm)Fig.1 Observation of primary cells

2.2 RT-PCR法檢測LncRNA ANCR表達量

結果顯示，siRNA組、空載體組、干細胞組細胞LncRNA ANCR表達量分別為0.38±0.07、0.79±0.10、0.80±0.11，siRNA組細胞內的LncRNA ANCR表達量最低。與空載體組、干細胞組相比較，siRNA組細胞LncRNA ANCR表達量顯著下降(P均<0.05)；空載體組、干細胞組相比較，兩組細胞中LncRNA ANCR表達量相近，無顯著差異(P>0.05)，說明LncRNA ANCR轉染成功。見圖2。

注：與siRNA組比較，aP<0.05。圖2 各組細胞中LncRNA ANCR表達量Fig.2 LncRNA ANCR expression in each group of cells

2.3 堿性磷酸酶染色觀察ALP 染色效果

由圖3可知，siRNA組細胞中ALP 染色最深，siRNA組與空載體組、干細胞組相比較，siRNA組細胞中ALP 染色顯著加深(P均<0.05)；空載體組、干細胞組相比較，兩組細胞中ALP 表達水平相近(P>0.05)。

圖3 各組細胞ALP 染色情況(400×，20 μm)Fig.3 ALP staining of cells in each group

2.4 茜素紅染色實驗檢測成骨染色效果

siRNA組細胞中深紅色最重，siRNA組與空載體組、干細胞組相比較，siRNA組細胞中深紅色顯著加深(P均<0.05)；空載體組、干細胞組相比較，兩組細胞中顏色相近(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組細胞骨染色效果(400×，20 μm)Fig.4 Bone staining effect of each group of cells

2.5 Western blot法檢測Wnt/β-catenin及其磷酸化蛋白水平

檢測結果顯示，siRNA組、空載體組、干細胞組細胞中Wnt蛋白水平分別為0.88±0.12、0.47±0.09、0.48±0.10，p-β-catenin蛋白水平分別為0.75±0.11、0.35±0.08、0.34±0.09，siRNA組細胞中Wnt/β-catenin及其磷酸化蛋白表達最高。與空載體組、干細胞組相比較，siRNA組細胞Wnt/β-catenin及其磷酸化蛋白表達顯著上升(P均<0.05)；空載體組、干細胞組相比較，細胞中蛋白水平相近(P>0.05)。見圖5。

注：A：各組細胞中Wnt/β-catenin蛋白水平；B：各組細胞中Wnt/β-catenin蛋白表達比值；C：各組細胞中phospho-β-catenin蛋白表達比值；與siRNA組比較，aP<0.05。圖5 各組細胞中Wnt/β-catenin蛋白水平Fig.5 Wnt/β-catenin protein levels in cells of each group

2.6 免疫組化法檢測Wnt/β-catenin信號陽性表達

siRNA組細胞中Wnt/β-catenin陽性數(shù)最高，與空載體組、干細胞組相比較，siRNA組細胞Wnt/β-catenin陽性數(shù)顯著升高(P均<0.05)；空載體組、干細胞組相比較，兩組細胞中Wnt/β-catenin陽性數(shù)相近，無顯著差異(P>0.05)。見圖6、圖7。

圖6 Wnt/β-catenin蛋白陽性表達(400×)Fig.6 Positive expression of Wnt/β-catenin protein (400×)

注：與siRNA組比較，aP<0.05。圖7 Wnt/β-catenin蛋白陽性數(shù)量Fig.7 Number of Wnt/β-catenin protein positive

3 討論

ADSCs在細胞的形態(tài)、表型及其多向分化潛能等方面與BMMSCs功能十分相似，但是ADSCs有其更為顯著的優(yōu)點，具體為取材相對方便、給患者帶來的創(chuàng)傷小、來源相對充足等，因此ADSCs成為了現(xiàn)在一個非常重要的研究熱點[10-11]。對細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，傳數(shù)代后衰老和死亡的細胞占有相對較小的比例。ADSCs可以被用來修復或者是重建很多種組織細胞，例如軟骨組織、肺、腦及肝臟[12]。分化拮抗非蛋白質編碼RNA(ANCR)在人體多種疾病中異常表達，但在一些終末分化細胞中的表達水平卻顯著降低，例如角質、成骨、脂肪等細胞。這一現(xiàn)象表明，lncRNA ANCR在終末分化細胞的分化、形成過程中占有重要地位[13]。研究顯示，lncRNA ANCR在BMSCs、hFOBl19等細胞中的表達升高也證明了lncRNA ANCR高表達對終末分化細胞具有拮抗作用，但在滑膜組織干細胞的生成過程中l(wèi)ncRNA ANCR卻產生促進作用，說明lncRNA ANCR在干細胞的分化中發(fā)揮不同的調控作用[14-15]。但lncRNA ANCR在ADSC向成骨細胞分化中的作用還未見報道。因此，本研究采用ANCR干預骨質疏松大鼠的脂肪源性干細胞向成骨分化，開展進一步的探討。

已有研究報道，lncRNA ANCR在不同組織來源的干細胞分化過程中發(fā)揮重要的作用。lncRNA ANCR的敲減可以同時促進DPSCs、aSCAPs、PDLSCs等細胞的定向分化[16]。Xie等[17]發(fā)現(xiàn)，lncRNA ANCR在人hBMSC成骨分化過程中發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示，siRNA組與空載體組、干細胞組相比較，siRNA組細胞中ALP 染色顯著加深、深紅色顯著加深；空載體組、干細胞組相比較，ALP 表達水平無顯著差異。表明lncRNA ANCR的表達水平能夠對ADSCs的分化起明顯干預作用，lncRNA ANCR表達升高會顯著抑制ADSCs向成骨分化的速度，其具體作用原理可能與細胞中Wnt/β-catenin的水平有關。研究顯示[18]，在lncRNA ANCR參與ADSCs成骨分化過程中，lncRNA ANCR可根據(jù)其細胞核內外不同的定位發(fā)揮不同的功能，主要包括海綿作用(lncRNA ANCR作用于miRNA后，減弱miRNA對靶基因mRNA表達的抑制作用)、靶向銜接作用(lncRNA ANCR可使相關轉錄信號因子的表達減少)，進而發(fā)揮不同或者相反的生物學作用。張傳志等[19]指出lncRNA ANCR過表達能夠抑制骨髓間充質干細胞的成骨分化。前期臨床研究表明[20]，ADSCs可以逐步分化為成骨細胞，預防卵巢切除誘導的骨流失與骨質疏松疾病。ADSCs成骨分化條件及外在影響方面主要影響了成骨細胞活性和骨形成，并且還與骨吸收有關。lncRNA ANCR空載體內不含有siRNA，當空載體轉染至其他細胞中時，siRNA不進行復制繁殖，因此，lncRNA ANCR空載體對細胞分裂及分化無任何影響。研究表明[21]，脂肪源干細胞向成骨細胞分化的過程共分為三個階段，其中，基質成熟期和礦化形成期是較為重要的階段。在基質成熟期細胞中能夠提升BMP2和ALP的表達，對ALP進行染色檢測后表明，ALP表達水平與成骨細胞分化的速率存在正相關關系，即ALP表達水平越高，成骨細胞分化率越高。在成骨誘導過程中，敲減lncRNA ANCR后，ADSCs成骨分化會發(fā)生明顯的鈣化，其中鈣結節(jié)的沉積顯著增加，間接促進成骨細胞的生成[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空載體組、干細胞組相比較，siRNA組細胞Wnt/β-catenin陽性數(shù)及其蛋白表達顯著升高，空載體組、干細胞組相比較無顯著差異，說明抑制lncRNA ANCR的表達可提高Wnt/β-catenin的活性。Wnt信號最早發(fā)現(xiàn)于乳腺癌小鼠細胞內，是一種起始糖蛋白。作為一條高度保守的信號通路，其異常激活能夠調節(jié)多種細胞的生物活性，對成骨細胞的分化有正向促進作用。Wnt信號作用的發(fā)揮主要通過其下游的調節(jié)蛋白β-catenin累積游離至細胞核中，與轉錄因子結合，對核內mRNA表達進行調節(jié)、啟動實現(xiàn)。研究表明[23]，lncRNA影響干細胞分化的作用方式有很多，可以通過轉錄因子激活或抑制靶基因的表達，例如：lncRNA-MEG3可以通過與Wnt/β-catenin的相互作用來促進BMP-2的轉錄，從而促進脂肪源性干細胞的成骨分化。Li等[24]的研究顯示，ADSCs成骨分化后，其細胞中Wnt/β-catenin的水平出現(xiàn)顯著變化，表明Wnt/β-catenin信號在ADSCs成骨分化過程中占有關鍵地位。王維等[25]的試驗結果表明，lncRNA ANCR可以調控經典的Wnt/β-catenin通路，從而調節(jié)與成骨分化相關的轉錄調控因子，最終影響脂肪間充質干細胞成骨分化[22]。

綜上所述，lncRNA ANCR的表達水平與骨質疏松大鼠體內脂肪源性干細胞的分化存在顯著相關性，lncRNA ANCR能夠促進脂肪源性干細胞向成骨細胞分化，lncRNA ANCR作用于脂肪源性干細胞向成骨細胞分化可能與調控Wnt/β-catenin的表達有關。