單核巨噬細胞在心肌炎中的作用

路陽 趙寧 杜以梅

430022 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科

心肌炎是一種以心臟炎癥為特征的心臟病，是擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)的主要病因之一。心肌炎最常由柯薩奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)、腺病毒和細菌等感染性因素引起，毒素、酒精、藥物和自身免疫病也會誘發(fā)心肌炎[1-2]。以往研究表明，T細胞是心肌炎中發(fā)揮主導作用的免疫細胞，然而，單核巨噬細胞在心臟浸潤的免疫細胞中占比最高[3]，并發(fā)揮多種效應(yīng)功能。在本綜述中，我們總結(jié)了關(guān)于心臟單核細胞和巨噬細胞起源的最新研究，重點闡述了它們在心肌炎時數(shù)量和表型的動態(tài)變化，以及它們在抗病毒、炎癥損傷、適應(yīng)性免疫及組織修復中所起的作用，強調(diào)了以單核巨噬細胞為治療靶點的臨床應(yīng)用價值。

1 心臟單核細胞和巨噬細胞的來源、表型和功能

單核細胞起源于骨髓中的單核細胞前體，成熟后進入血管和組織中，接受抗原后轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)或在組織中分化為巨噬細胞。小鼠單核細胞由Ly6C從高到低的表達分為：Ly6Chigh、Ly6Cint和Ly6Clow3種單核細胞[4](表1)。Ly6Chigh單核細胞高表達Ly6C和CCR2，有較強的吞噬和促炎能力，被稱為“炎性單核細胞”。Ly6Clow單核細胞低表達Ly6C，高表達CX3CR1，由Ly6Chigh單核細胞分化而來，參與巡邏、免疫監(jiān)視和組織修復，被稱為“巡邏單核細胞”。Ly6Cint單核細胞是Ly6Chigh單核細胞向Ly6Clow單核細胞轉(zhuǎn)化的過渡階段，具有一定的抗原提呈和促進血管生成能力。人類單核細胞根據(jù)CD14和CD16的表達也分為3個亞群[4](表1)，CD14++CD16-經(jīng)典型單核細胞功能類似于小鼠Ly6Chigh單核細胞，CD14+CD16++非經(jīng)典型單核細胞類似于小鼠Ly6Clow單核細胞，而CD14++CD16+中間型單核細胞類似于小鼠Ly6Cint單核細胞。

過去，巨噬細胞通過其表面分子被分為M1型和M2型，M1型巨噬細胞促進炎癥反應(yīng)而M2型巨噬細胞參與抗炎和組織修復。然而，由于巨噬細胞功能的復雜性，這種M1/M2分類方法不夠完善，因此近來有學者提出通過起源和表面標記來綜合定義巨噬細胞亞群。心臟巨噬細胞有3種起源：原始的卵黃囊、胎兒肝臟單核細胞、骨髓單核細胞[5](表1)。前兩者統(tǒng)稱為胚胎來源的巨噬細胞，它們高表達CX3CR1，低表達CCR2，被稱為CCR2-常駐巨噬細胞，是穩(wěn)態(tài)時心臟巨噬細胞的主要成分，并通過原位增殖維持數(shù)量平衡。CCR2-巨噬細胞吞噬凋亡細胞，促進組織修復、血管生成和心臟電傳導，抑制炎癥細胞募集。而骨髓單核細胞來源的巨噬細胞高表達CCR2，在穩(wěn)態(tài)心臟內(nèi)含量較少，但在炎癥時大量募集到心臟。CCR2+巨噬細胞高表達炎癥基因，并通過NLPR3途徑分泌白細胞介素(interleukin，IL)1β，分泌趨化因子促進炎癥細胞的募集，造成炎癥損傷和不良重構(gòu)。

表1 心臟單核細胞和巨噬細胞的分類、起源和功能

2 單核巨噬細胞在心肌炎中的動態(tài)變化

大多數(shù)心肌炎研究集中在病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)和實驗性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis，EAM)動物模型，因此我們主要總結(jié)這些模型中單核細胞和巨噬細胞的動態(tài)變化。在VMC和EAM的急性期，骨髓和脾臟中的Ly6Chigh單核細胞通過CCR2/CCL2等趨化因子軸浸潤至心臟，在心臟增殖并分化為CCR2+MHC Ⅱ+巨噬細胞，其數(shù)量可達穩(wěn)態(tài)時的8倍，占所有心臟浸潤免疫細胞的60%以上，并發(fā)揮多種效應(yīng)功能[3-6]。與之相反，在VMC小鼠急性期觀察到胚胎來源的常駐巨噬細胞的減少，其數(shù)量在第7天約為穩(wěn)態(tài)時的1/2[6]，表明常駐巨噬細胞可能在VMC過程中發(fā)生凋亡，而它們在EAM模型中的變化尚無研究。在VMC和EAM慢性期，Ly6Chigh單核細胞凋亡或轉(zhuǎn)變?yōu)長y6Clow單核細胞，Ly6Clow單核細胞通過CX3CR1/CX3CL1軸募集到心臟，心臟CCR2+巨噬細胞數(shù)量和比例均下降，CCR2-巨噬細胞數(shù)量比例相對上升，在心臟中占主要地位，促進組織修復[6-7]。綜上所述，單核巨噬細胞的動態(tài)變化大致為從急性期的以促炎性單核巨噬細胞為主過渡到慢性期的以修復性單核巨噬細胞為主的過程。然而，由于病毒基因組的持續(xù)存在和自身免疫的激活，導致巨噬細胞過度積累和轉(zhuǎn)化障礙，造成心肌炎癥損傷和纖維化加重，引起DCM。

3 單核巨噬細胞在心肌炎中的功能

3.1 清除病毒和壞死心肌

單核巨噬細胞在病毒和壞死心肌的清除中發(fā)揮重要作用(圖1)。巨噬細胞表面Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)3是調(diào)控病毒感染的主要分子。研究表明，敲除心肌細胞上的TLR3并不影響它們對CVB3的易感性以及IFN-α/β基因的表達，因此心肌細胞上的TLR3可能不參與抗病毒反應(yīng)[8]。相反，過繼轉(zhuǎn)輸TLR3敲除的巨噬細胞的VMC小鼠相比轉(zhuǎn)輸正常巨噬細胞的小鼠，其心肌病變程度和血清肌鈣蛋白I水平明顯升高，表明巨噬細胞上TLR3參與了VMC抗病毒免疫[9]。因此，調(diào)控巨噬細胞TLR3的表達可有效改善病毒清除。

血液中的單核細胞進入心臟后分化為巨噬細胞，巨噬細胞發(fā)揮清除病毒、吞噬壞死心肌、分泌細胞因子和趨化因子、調(diào)控T細胞反應(yīng)及調(diào)節(jié)纖維化和重構(gòu)作用圖1 單核巨噬細胞在心肌炎中的功能

除了清除病毒，巨噬細胞還通過其表面吞噬受體MerTK識別和清除壞死心肌，同時減少炎癥因子分泌，這一過程稱為胞葬作用。研究發(fā)現(xiàn)，心臟常駐CCR2-MHClow巨噬細胞表達更高水平的MerTK，它們在心肌損傷后識別和吞噬凋亡細胞，并分泌轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-10抑制炎癥反應(yīng)，促進心臟修復，而骨髓來源的CCR2+單核巨噬細胞促進MerTK裂解，阻礙巨噬細胞的胞葬作用[10]。人體試驗表明，與缺血性心肌病患者相比，心肌炎患者血液CD11b+髓系細胞中MerTK的表達明顯降低，提示心肌炎時可能存在單核巨噬細胞吞噬功能障礙；小鼠實驗證實，EAM小鼠心臟浸潤的淋巴細胞分泌的IL-17刺激成纖維細胞分泌粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)，使巨噬細胞表面MerTK脫落，造成凋亡細胞清除和組織修復受阻[7]。因此，提高巨噬細胞表面MerTK的水平可作為促進壞死心肌清楚和組織修復的有效手段。

3.2 調(diào)節(jié)炎癥和心肌損傷

單核巨噬細胞通過分泌細胞因子和趨化因子介導心臟炎癥反應(yīng)(圖1)。在接受TLR配體或IFN-γ刺激后，巨噬細胞會分化為M1型，M1型巨噬細胞合成誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)及活性氧介導氧化應(yīng)激，形成炎癥小體并分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和IL-18等細胞因子促進炎癥反應(yīng)；而M2型巨噬細胞被IL-4誘導分化，通過分泌IL-10和TGF-β等減輕炎癥。同時，單核巨噬細胞還分泌多種集落刺激因子如M-CSF、GM-CSF，及趨化因子如CCL2、CCL5、CCL7、CXCL12、CX3CL1，促進自身或其他免疫細胞的增殖和浸潤，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，造成心臟損傷[11]。

TLR可作為調(diào)控巨噬細胞功能的主要靶點。研究表明，人類心臟肌球蛋白及其肽段可直接激活外周血單核細胞上的TLR2，誘導細胞因子的分泌，引起炎癥細胞的募集和激活[12]。小鼠實驗顯示，CVB3的衣殼蛋白可能通過激活TLR4使巨噬細胞形成炎癥小體，促進IL-1β、IL-18的釋放[13]，而抑制TLR4可阻止上述因子的分泌，減輕病毒復制和心肌炎癥[14]。

另一方面，調(diào)控M1/M2巨噬細胞平衡可作為治療心肌炎的有效手段。研究發(fā)現(xiàn)，M1/M2巨噬細胞比例的不同是造成心肌炎損傷的性別差異的主要原因，雄性小鼠心肌炎嚴重程度高于雌性小鼠，雄性小鼠心臟浸潤的巨噬細胞高表達M1型標志物iNOS、TNF-β、IL-12，而雌性小鼠巨噬細胞高表達M2型標志物Arg-1、IL-10、MMR[15]。研究者通過體外沉默巨噬細胞高遷移率族蛋白1(high mobility group protein box 1，HMGB1)的表達，抑制NF-κB、p38和Erk1/2通路的激活，減少巨噬細胞炎癥因子的分泌，在EAM小鼠中沉默HMGB1后，心臟浸潤的M1樣巨噬細胞數(shù)量減少，并保護了心臟功能[16]。大量動物研究證實，通過調(diào)控各種不同的分子靶點或非編碼RNA如AngⅡ、lncRNA AK085865，均可通過誘導M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化，抑制VMC或EAM的炎癥損傷[17-18]。

靶向單核巨噬細胞增殖和浸潤也可調(diào)控心臟炎癥。通過使用氯膦酸鹽脂質(zhì)體誘導單核巨噬細胞凋亡，可減少VMC及EAM小鼠心臟單核巨噬細胞浸潤，減輕心臟炎癥和纖維化程度，然而，單核巨噬細胞的凋亡使VMC小鼠急性期心臟病毒滴度增加，死亡率上升[19-20]，這表明清除所有單核巨噬細胞在減輕心臟炎癥的同時，可能損害了它們的抗病毒能力。因此，研究者在EAM小鼠體內(nèi)使用靶向CCR2的siRNA，抑制CCR2-CCL2通路介導的炎癥單核細胞運輸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCR2 siRNA的使用阻止了單核細胞前體從骨髓中的釋放以及脾臟單核細胞向心臟中的募集，減少了心臟巨噬細胞的浸潤，并減輕了炎癥和纖維化程度[21]。同樣，研究者通過在VMC小鼠體內(nèi)使用CSF-1 siRNA使骨髓來源的單核細胞的發(fā)育和增殖被抑制，發(fā)現(xiàn)心臟單核巨噬細胞的浸潤降低，心臟損傷減輕，同時病毒的清除不受影響[22]。而相反，敲除小鼠體內(nèi)趨化因子受體CX3CR1，可抑制Ly6Clow單核細胞的募集，阻礙CCR2-巨噬細胞的發(fā)育和補充，導致CVB3感染的小鼠炎癥細胞浸潤增多，心肌損傷和纖維化加重[23]。因此，特異性靶向炎性單核細胞向心臟的浸潤是減輕心臟炎癥的有效手段。

3.3 抗原提呈和適應(yīng)性免疫

單核巨噬細胞可調(diào)控自身反應(yīng)性T細胞的活化和分化，參與適應(yīng)性免疫(圖1)。自身反應(yīng)性T細胞的啟動是VMC免疫損傷和進展成為DCM的關(guān)鍵原因。研究表明，Ly6Chigh單核細胞可以進入心臟并獲得抗原，并隨后遷移至脾臟或淋巴結(jié)，誘導T細胞的成熟和增殖[24]。同時，在心臟的單核細胞分化為巨噬細胞，吞噬壞死心肌并將其分解為多肽與MHC Ⅱ分子結(jié)合，呈遞給T細胞，部分高表達CD11c的巨噬細胞被稱為“單核來源的樹突狀細胞”，有更強的處理和呈遞抗原的能力，顯著誘導T細胞激活[3， 25]。巨噬細胞表面的共刺激分子CD40、CD80和CD86提供第二信號，增強T細胞的活化和增殖[25]。單核巨噬細胞分泌的細胞因子調(diào)控T細胞的分化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)門h1、Th17或Treg表型。單核巨噬細胞是IL-12的主要來源之一，IL-12通過STAT4信號誘導Th1細胞分化，促進EAM的發(fā)展[26]。用抗體阻斷人類單核細胞上的TLR2或多肽結(jié)合表位，可降低其Th17相關(guān)細胞因子IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-23的分泌，從而抑制體外Th17的活化[12]。氯沙坦作為一種AngⅡ受體拮抗劑，可通過抑制AngⅡ激活的Erk1/2或p38-Stat3通路，降低M1型巨噬細胞和Ly6Chigh細胞的比例，并阻止M1型巨噬細胞誘導的Th17細胞的分化，從而有效改善EAM的進展[17]。而過繼轉(zhuǎn)輸M2型巨噬細胞至心肌炎小鼠體內(nèi)，可通過IL-10和TGF-b的分泌提高小鼠脾臟Treg細胞的比例，減輕自身免疫反應(yīng)[15]。因此，通過改變單核巨噬細胞的表型和功能，可調(diào)控T細胞介導的心臟自身免疫反應(yīng)。

3.4 組織修復和纖維化

單核巨噬細胞調(diào)控心肌炎后期的組織重構(gòu)和纖維化(圖1)。在心肌炎的慢性期，心臟浸潤的Ly6Chigh單核細胞會轉(zhuǎn)變?yōu)長y6Clow巨噬細胞，同時Ly6Clow單核細胞浸潤至心臟并分化為巨噬細胞[27]，這些巨噬細胞以M2表型為主，分泌多種細胞因子介導損傷修復：精氨酸酶1、TGF-β和IL-10誘導肌成纖維細胞產(chǎn)生膠原蛋白，血管內(nèi)皮生長因子誘導血管生成，基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。而M1型巨噬細胞分泌的TNF-α和IL-1會刺激成纖維細胞分泌過量的細胞外基質(zhì)，導致基質(zhì)沉積和纖維化不良[28]。淋巴細胞分泌的IL-17誘導成纖維細胞分泌GM-CSF，阻礙了Ly6Clow單核細胞向修復型巨噬細胞的分化和增殖，造成了炎癥的持續(xù)和纖維化加重[7]。同樣，敲除N4a1基因使Ly6Chigh單核細胞轉(zhuǎn)變?yōu)長y6Clow表型受阻，引起心臟愈合不良，纖維化增加和心力衰竭[27]。相反，肌成纖維細胞誘導M1型巨噬細胞的凋亡，并使巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)變，促進炎癥的消退[29]。同樣，在EAM急性期體內(nèi)使用脂質(zhì)體，可促進小鼠Ly6Chigh單核巨噬細胞轉(zhuǎn)化為Ly6Clow表型，減輕疾病后期心臟纖維化，恢復心臟功能[20]。因此，調(diào)控單核巨噬細胞的表型可影響心臟的修復和纖維化，改變晚期DCM和心力衰竭的進程。

4 小結(jié)與展望

以上研究說明，單核細胞和巨噬細胞在心肌炎最初的病毒清除，到中期的自身免疫和炎癥損傷，再到后期的組織修復和纖維化中發(fā)揮了多種效應(yīng)功能。然而，單核巨噬細胞的起源、表型和功能似乎比以往認為的更復雜，還有幾個方面有待闡明：心臟浸潤的單核巨噬細胞是否包含更加復雜的功能群體？哪種單核巨噬細胞亞群對心肌炎發(fā)展最為重要？單核巨噬細胞如何與心臟其他細胞對話？明確以上問題，都將進一步提高我們對心肌炎的了解，幫助我們找到更加有針對性的治療方法。

利益沖突：無