基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測大黃酸治療新生兒急性呼吸窘迫綜合征的抗炎作用機制

馮俊芳，王一彪，陳歐，高雁翎

1.德州市人民醫(yī)院新生兒科，山東 德州 253000；2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院第二醫(yī)院兒科，山東 濟南 250033；3. 山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院，山東 濟南 250012

新生兒急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是不同病因引起的肺部急性炎癥疾病，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫、低氧血癥、肺順應(yīng)性下降等癥狀，是新生兒常見的臨床危重癥。新生兒ARDS的病因是肺內(nèi)外多種炎癥導(dǎo)致的肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)繼發(fā)性缺乏，發(fā)病具有炎癥性特點[1-2]。大黃酸是大黃等中藥的主要活性成分之一，屬單蒽醌類1,8-二羥基蒽醌衍生物，有抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化等藥理活性[3-5]。目前，大黃酸通過抗炎作用治療急性呼吸窘迫綜合征報道較少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)是一門藥理學(xué)分支學(xué)科，它采用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)分析和實驗驗證等方法，構(gòu)建藥物、疾病和生物分子相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)模型，為辨識藥物的靶標、藥物開發(fā)指導(dǎo)奠定基礎(chǔ)[6]，它被認為是“下一代藥物研究新模式”?！八幬?靶點-通路及疾病-基因-靶點-藥物”等生物分子網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建則是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)[7-8]，它既可以從成分-靶點-通路探討藥物療效，也可以通過已知療效的藥物反向探索疾病發(fā)病機制[9-10]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測大黃酸治療新生兒急性呼吸窘迫綜合征的抗炎作用機制，并通過細胞水平的實驗加以驗證，為治療新生兒ARDS提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 使用的工具和數(shù)據(jù)來源采用TCMSP、PubChem、STITCH 查找藥物的化學(xué)成分及其作用的靶標；通過Genebank、TTD、Drugbank、String查找與疾病相關(guān)的基因，基因之間的相互作用及蛋白-蛋白相互作用信息；應(yīng)用Enrichr、KEGG 查找生物分子參與的信號通路；用Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)；用Systemsdock進行分子對接。

1.2 大黃酸靶點的預(yù)測通過查詢TCMSP 及PubChem數(shù)據(jù)庫，得到并導(dǎo)出大黃酸的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Swiss prediction target數(shù)據(jù)庫中進行反向分子對接，靶點集選擇“homo sapiens”，得到預(yù)測靶點，用于后續(xù)研究。

1.3 大黃酸-靶蛋白分子對接通過查詢PDB數(shù)據(jù)庫，得到靶點蛋白的PDB-ID，并將其導(dǎo)入Systemsdock進行分子對接，根據(jù)Docking Score值來判斷大黃酸與靶點的匹配度。Score 取值范圍在0～10 之間，值越大，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定[11]。

1.4 大黃酸-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建應(yīng)用Cytoscape軟件，將大黃酸及其潛在靶點導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“藥物-靶蛋白”互作信息網(wǎng)絡(luò)。

1.5 大黃酸-靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建蛋白質(zhì)之間的相互作用是人類生命活動的基礎(chǔ)，也是探索人體分子機制的重要內(nèi)容。為了明確藥物靶點之間的相互作用，本研究應(yīng)用STRING 平臺篩選靶點之間的相互作用，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)的角度研究疾病分類，確定機制，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點。應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫平臺，構(gòu)建大黃酸靶蛋白-靶蛋白之間的相互作用信息網(wǎng)絡(luò)(PPI network)，蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，閾值設(shè)為“medium confidence”，其余參數(shù)均保持默認值。

1.6 抗炎相關(guān)靶點蛋白信息篩選在Therapeutic Target Database (TTD)數(shù)據(jù)庫中，將關(guān)鍵詞設(shè)置為“anti-inflammation”，搜索抗炎靶點蛋白相關(guān)信息。將選取的抗炎靶點蛋白輸入Cytoscape軟件中，構(gòu)建抗炎靶點蛋白-蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.7 大黃酸抗炎靶點的篩選及抗炎靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將大黃酸靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)與選取的抗炎靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)合并，取其交集，交集中的靶點蛋白即為大黃酸的抗炎靶點蛋白，并將上述靶點蛋白輸入String 數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建篩選后的PPI網(wǎng)絡(luò)，并設(shè)置蛋白相互作用的高置信度依據(jù)：打分值＞0.7。

1.8 檢索新生兒呼吸窘迫綜合征相關(guān)基因在NCBIGene 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nim.nih.gov)中，新生兒呼吸窘迫綜合征相關(guān)基因以“Neonatal respiratory distress syndrome”和“homo sapiens”為關(guān)鍵詞進行檢索，得到新生兒呼吸窘迫綜合征相關(guān)的基因。

1.9 大黃酸抗炎靶點對抗新生兒呼吸窘迫綜合征的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)在String數(shù)據(jù)庫中輸入大黃酸抗炎靶點基因與新生兒呼吸窘迫綜合征相關(guān)基因，構(gòu)建大黃酸抗炎靶點對抗新生兒呼吸窘迫綜合征的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，進一步篩選與新生兒呼吸窘迫綜合征發(fā)病相關(guān)的抗炎靶點。

1.10 KEGG 通路富集分析在Enrichr 數(shù)據(jù)庫中，對大黃酸干預(yù)新生兒呼吸窘迫綜合征的關(guān)鍵作用靶標進行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)生物通路富集分析。

1.11 體外實驗驗證大黃酸抗新生兒ARDS作用的分子機制

1.11.1 細胞培養(yǎng)和藥物處理HBE細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自Sigma公司。LPS購自Sigma公司。p-P38、P38抗體購自ABclonal 公司。本實驗在山東大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室完成。將HBE 細胞置于含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分數(shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞增殖到約80%時傳代繼續(xù)培養(yǎng)。細胞分為5 組：HBE 對照組、LPS 聯(lián)合OVA組、大黃酸低劑量組(0.1 μmol/L)、大黃酸中劑量組(0.5 μmol/L)、大黃酸高劑量組(1.0 μmol/L)。

1.11.2 Western blot 檢測p-P38 及P38表達收集待測HBE 細胞，用PBS 洗3 次，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，提取細胞總蛋白。等量的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 凝膠(10%)電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%的牛奶(MILK)進行封閉，然后依次孵育一抗(抗p-P38、抗P38抗體)和二抗，最后進行顯色。蛋白的相對表達量為目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值的比值。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism 7 進行統(tǒng)計學(xué)分析，ImagJ 計算目的蛋白灰度值，ONE-WAY ANOVA檢驗進行方差分析，檢測數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，柱狀圖采用GraphPad Prism 7軟件繪制；檢驗水準α=0.05，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃酸與預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)通過查詢TCMSP、PubChem、Swiss prediction target 數(shù)據(jù)庫篩選出10 個大黃酸的靶點蛋白，并運用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建大黃酸-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

圖1 大黃酸-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2 大黃酸靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)選取大黃酸的10 個靶點蛋白，在String 數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖2)，組成15條相互作用關(guān)系，見圖2。

圖2 大黃酸靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 大黃酸與相關(guān)靶點的反向?qū)拥梅譃檫M一步驗證預(yù)測靶點的準確性，選取大黃酸與12個度數(shù)最高的靶蛋白進行分子對接分析。其結(jié)果顯示，大黃酸與靶蛋白對接的score值均大于5，表明大黃酸與預(yù)測靶點具有良好的相互作用，證實了預(yù)測靶點的可靠性，見表1。

表1 大黃酸與其靶點的對接得分

2.4 大黃酸-抗炎靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)分析在TTD中檢測到70 個與抗炎相關(guān)的蛋白，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，在PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖3)中，共有63 個相互作用靶點，組成383條相互作用關(guān)系。使用Cytoscape 3.7.1 中的Merge 功能將大黃酸預(yù)測靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)與抗炎靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)融合，取其交集部分(圖4)，取＞0.7的高置信度區(qū)間，得到大黃酸發(fā)揮抗炎作用靶點，包括腫瘤壞死因子受體超家族成員1A (TNFRSF1A)、表皮生長因子受體(EGFR)、受體酪氨酸激酶Erb-B2 (Erb-B2)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK14)。

圖4 大黃酸預(yù)測靶點-抗炎靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 大黃酸抗炎靶點對抗新生兒急性呼吸窘迫綜合征的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果得到4個與新生兒急性呼吸窘迫綜合征相關(guān)的大黃酸抗炎靶點：TNFRSF1A 、EGFR、Erb-B2、及MAPK14，見圖5。

圖5 大黃酸抗炎靶點對抗新生兒急性呼吸窘迫綜合征的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)

2.6 大黃酸治療新生兒ARDS 的KEGG 通路富集分析通路富集分析結(jié)果得出大黃酸治療新生兒急性呼吸窘迫綜合征主要涉及128條信號通路。將Enrichr分析結(jié)果按P 排序排名前十的KEGG通路：免疫信號通路MAPK 信號通路、Human cytomaglovirus infection、Proteoglycans in cancer、Bladder cancer、Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)、Endometrial cancer、Central carbon metabolism in cancer、Non-small cell lung cancer、Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection 及Adherence junction，見圖6。

2.7 大黃酸對LPS 聯(lián)合OVA 誘導(dǎo)的HBE 細胞p38MAPK通路表達和炎癥反應(yīng)的影響圖7顯示，與對照組相比較，LPS聯(lián)合OVA組HBE細胞中p-P38相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與LPS聯(lián)合OVA組相比較，大黃酸0.1 μmol/L組、大黃酸0.5 μmol/L 及大黃酸1.0 μmol/L 組中p-P38 相對表達量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

ARDS 是一種肺部急性炎癥性疾病[1]，其主要病理改變?yōu)榉尾垦仔约毎櫋⒎闻萆掀て琳掀茐募胺闻菅軆?nèi)皮滲透性增加等，臨床表現(xiàn)為嚴重低氧血癥、呼吸窘迫、肺順應(yīng)性下降等癥狀。近年來，足月兒ARDS發(fā)病率逐漸增加，且其具有病情重、進展快和病死率高等特點[12]。目前，新生兒ARDS的治療原則仍以糾正缺氧、降低肺動脈高壓、治療原發(fā)病等綜合治療為主，但尚無特效的治療手段。因此，尋找新的治療呼吸窘迫綜合征的藥物及靶點顯得尤為重要。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)方法，建立中藥成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，從整體的觀點深入探究大黃酸治療新生兒ARDS的相關(guān)作用機制，并通過體外實驗進行驗證。

文獻報道大黃酸具有抗炎作用活性[13-15]，徐佑?xùn)|等[16]從分子機制方面證實了大黃酸的抗炎作用。本研究結(jié)果顯示了大黃酸的抗炎作用，與上述結(jié)論一致。一方面，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測得出TNFRSF1A、EGFR、Erb-B2、MAPK14 是大黃酸藥物的抗炎靶點；另一方面，TNFRSF1A、EGFR、Erb-B2、MAPK14 與疾病新生兒呼吸窘迫綜合征相關(guān)。由此推測，這4 個靶點可能是大黃酸治療新生兒呼吸窘迫綜合征的重要抗炎靶點。大黃酸既可以直接作用于這些靶點發(fā)揮抗炎作用，也可以間接作用于其他靶點而發(fā)揮抗炎作用[17]。

TNFRSF1A 是1 型TNF 受體，屬腫瘤壞死因子受體超家族成員，在機體內(nèi)分布廣泛。TNFRSF1A主要通過活化NF-κB、JAK-STAT、MAPK等信號通路[18]，誘導(dǎo)細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α等的合成及細胞凋亡而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[19-21]。TNFRSF1A也可與MAPK14共同參與腫瘤壞死因子等信號通路發(fā)揮作用。

EGFR是表皮生長因子受體，廣泛分布于機體上皮組織中，在炎癥發(fā)生過程中起重要調(diào)節(jié)作用[22]。體外實驗證實，EGFR抑制劑可通過調(diào)控NF-κB信號通路，抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS表達，抑制細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[23]。小鼠支氣管上皮EGFR磷酸化水平與臭氧誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥病理學(xué)變化總分呈正相關(guān)[24]。補肺益腎方可通過調(diào)控EGFR/PI3K/mTOR 通 路，降 低 促 炎 因 子IL-1 β 、IL-6、TNF-α等的水平，減輕COPD氣道炎癥[25]。在KEGG通路富集前十位信號通路中，其中的9 種信號通路均有EGFR參與，也進一步說明了大黃酸可通過與EGFR及其相關(guān)信號通路構(gòu)建成作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮其抗炎作用。

Erb-B2 又名HER2、NEU、CD340，是原癌基因erb-B2編碼的185 kDa的細胞膜受體，為EGFR家族成員之一[26]。小鼠細胞因子IL-1、腫瘤壞死因子、IFN-γ等的激活促進了乳腺癌的發(fā)生及進展[27]。抑制或敲除Erb-B2 可以通過調(diào)控NF-κB 信號通路影響IL-1β、Cyclooxygenase-2 和多種趨化因子的表達，進而減輕紫外線誘導(dǎo)的皮膚炎癥反應(yīng)[28]。由此推測大黃酸通過與Erb-B2 相互作用可能通過調(diào)節(jié)IL-1β、TNF、IFN-γ的分泌發(fā)揮抗炎作用。

MAPK14 是P38MAPKs 之一，p38 MAPK 亞群包括4種亞型，分別為p38α、p38β、p38γ、p38δ，其中p38α和p38β主要參與炎性紊亂[29]。促炎細胞因子或細胞外刺激可引發(fā)細胞級聯(lián)反應(yīng)，P38MAPKs 在上述所引發(fā)的細胞級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用，在重癥胰腺炎、激素抵抗型哮喘等疾病中的表達量明顯升高[30-31]，并且P38MAPKs 是由肺炎鏈球菌所引發(fā)的肺組織炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子[32]，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子可以通過激活p38MAPK 信號通路，與ERK 及核因子-κB (NF-κB)等信號通路發(fā)生正反饋，級聯(lián)放大炎癥反應(yīng)[33]。由P38MAPKs調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)會導(dǎo)致TNF-α、IL-1β等促炎因子的產(chǎn)生，進而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)相關(guān)酶的激活[34]，在LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠中Dapk1 可通過調(diào)控p38MAPK/NF-κB 通路降低IL-6、TNF-α、MPO等細胞因子的水平，減輕炎癥反應(yīng)[35]。由此推測，大黃酸可通過減低TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的表達，抑制MAPK通路，發(fā)揮其抗炎作用。本研究結(jié)果顯示，在OVA 聯(lián)合LPS 誘導(dǎo)的HBE 細胞中MAPKP38的磷酸化水平升高，給予大黃酸治療后可以降低MAPKP38的磷酸化水平，并且與大黃酸濃度成正相關(guān)。這說明，大黃酸的抗炎作用可能與調(diào)控MAPK通路有關(guān)，與上述結(jié)論一致。本實驗采用基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理的綜合數(shù)據(jù)分析方法，預(yù)測了大黃酸抗炎作用的主要靶點及相關(guān)的信號通路，發(fā)現(xiàn)大黃酸可通過多靶點、多途徑干預(yù)新生兒急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生、發(fā)展，并且運用體外實驗驗證了大黃酸抗炎作用的相關(guān)分子機制。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究以網(wǎng)絡(luò)建模、數(shù)據(jù)庫資源開發(fā)以及軟件應(yīng)用為基礎(chǔ)，網(wǎng)絡(luò)模型及細胞實驗與機體內(nèi)環(huán)境存在一定差異，故大黃酸抗炎作用的研究結(jié)果還需通過進一步的體內(nèi)實驗加以證實。