人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46與異種移植

容勛精 綜述 王毅 審校

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院器官移植科，海南 ?？?570100

同種異體移植是治療終末期器官功能衰竭疾病的較好醫(yī)療手段之一。同種異體腎移植的優(yōu)點(diǎn)在臨床上已經(jīng)得到了充分的證實(shí)，相對(duì)于血液透析或者腹膜透析等治療方式，同種異體腎移植不僅延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間，而且明顯改善患者的生活質(zhì)量。然而，人體器官的供需不平衡使器官移植在臨床應(yīng)用上遇到瓶頸。在中國(guó)，每年需接受腎移植的患者大約30萬(wàn)，而實(shí)際接受腎移植的患者小于2 萬(wàn)，這使器官來(lái)源短缺的問(wèn)題更加突出。異種移植以轉(zhuǎn)基因豬器官移植的形式提供了克服已故和活著的人類(lèi)捐贈(zèng)者長(zhǎng)期短缺的可能性，成為解決器官來(lái)源短缺這一世界性難題的根本途徑之一。然而豬-非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的異種移植同樣面臨著許多障礙，其主要障礙除組織相容性差及異種排斥反應(yīng)外，還有凝血功能障礙、炎癥過(guò)程及人畜共患傳染病等，這些最終會(huì)造成異種移植物的失功。面對(duì)這些障礙研究者們不僅可以敲除異種抗原，還可以轉(zhuǎn)入人體補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(CRP)等進(jìn)行調(diào)節(jié)，這使異種移植物的存活時(shí)間有所延長(zhǎng)。人體CRP 主要包括人衰變加速因子、攻膜復(fù)合物抑制因子和膜輔助蛋白(CD46)等。本文將著重闡述人膜輔助蛋白(hCD46)在異種器官移植中的作用。

1 hCD46 的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 hCD46 的結(jié)構(gòu)1985 年，hCD46 首次在人外周白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是能與C3b結(jié)合的膜蛋白，它被命名為gp45.70[1]。之后，有人首次提純并明確gp45.70為C3b 及C4b 裂解的輔助因子，同時(shí)改其名為膜輔蛋白，并依據(jù)人白細(xì)胞分化抗原劃分為CD46，因此CD46 又稱(chēng)膜輔助蛋白[2]。hCD46 其染色體定位于人類(lèi)1 號(hào)染色體短臂的32 號(hào)區(qū)，其分子量大小約48～56 KU，含有4 個(gè)同源的的短序列(scr)，屬于補(bǔ)體活化調(diào)節(jié)蛋白基因家族[3-4]。CD46 的N 端由4 個(gè)補(bǔ)體控制蛋白(CCPs)和一個(gè)通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生的高度O-糖基化區(qū)域組成，包括B 和/或C 亞型。B 和C 結(jié)構(gòu)域富含蘇氨酸、絲氨酸和脯氨酸(STP)，隨后是12個(gè)功能未知的氨基酸、一個(gè)跨膜區(qū)域，然后是兩個(gè)可能的選擇性剪接細(xì)胞質(zhì)尾部(CYT-1或CYT-2)中的一個(gè)。這兩個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域都含有信號(hào)傳遞基序，并被證明介導(dǎo)不同的細(xì)胞功能[5-7]。CD46 為單鏈蛋白，通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定于細(xì)胞膜上，廣泛表達(dá)于造血細(xì)胞、白細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血小板和成纖維細(xì)胞等表面，但不表達(dá)于紅細(xì)胞。

1.2 hCD46 的功能

1.2.1 CD46 與免疫調(diào)節(jié)CD46 是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，最初被鑒定為補(bǔ)體抑制劑。它是先天免疫系統(tǒng)的一部分，但也在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮作用。在先天免疫系統(tǒng)中，CD46是因子Ⅰ介導(dǎo)的C3b和C4b裂解的唯一普遍表達(dá)的輔助因子，在保護(hù)宿主細(xì)胞免受有害補(bǔ)體激活損傷中起到關(guān)鍵作用[8]。CD46 能夠同時(shí)在經(jīng)典和旁路途徑兩條途徑中發(fā)揮調(diào)控補(bǔ)體激活的功能[9-10]。目前，關(guān)于CD46 在先天性免疫細(xì)胞中的作用了解甚少。有項(xiàng)研究表明CD46激活后可降低自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性[11]。有關(guān)CD46 在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的研究相對(duì)較多，ASTIER 等[12]、ZAFFRAN 等[13]觀察到CD46 可作為人類(lèi)CD4+T 細(xì)胞的共刺激分子，在抗原提呈過(guò)程中激活CD46 可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。CD46 的兩個(gè)主要細(xì)胞內(nèi)尾(Cyt1 和Cyt2)通常在人細(xì)胞中共同表達(dá)。CD46的Cyt1和Cyt2對(duì)細(xì)胞增殖和白細(xì)胞介素2 (IL-2)和白細(xì)胞介素10 (IL-10)分泌量的控制不同，Cyt1可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖，降低CD8+細(xì)胞毒性和IL-2 的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)，而Cyt2 增加CD8+細(xì)胞毒性并降低IL-10 的產(chǎn)生，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，Cyt1 的分裂促進(jìn)T 細(xì)胞的活化，而Cyt2 的分裂抑制T 細(xì)胞的活化[14-15]。之后的一系列研究最終證明在T 細(xì)胞活化過(guò)程中CD46 的參與可誘導(dǎo)IL-10 分泌及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Tregs)的激活或生成[16-18]。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)于維持外周免疫耐受和免疫反應(yīng)的控制起到非常重要，可抑制和控制效應(yīng)物輔助型T 細(xì)胞1(Th1)、輔助型T細(xì)胞2 (Th2)和輔助型T細(xì)胞17 (Th17)的激活，IL-10則是一種有效的免疫抑制細(xì)胞因子，其在自身免疫性腦脊髓炎(EAE)和小鼠多發(fā)性硬化(MS)模型中的重要性已得到充分證明[19-21]。總之，CD46在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中起到促進(jìn)T 細(xì)胞活化[12]、調(diào)節(jié)炎癥[15]和1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tr1)分化[17]，以及影響T細(xì)胞形態(tài)[13]和極性[11]的作用。雖然目前沒(méi)有跡象表明CD46介導(dǎo)的信號(hào)直接影響B(tài)細(xì)胞增殖、存活或抗體產(chǎn)生[22]，但已有研究表明CD46激活的T細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞的影響，CD46可通過(guò)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞接觸及IL-10的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體[22]。

1.2.2 病原體磁鐵CD46 是某些病原體的受體。CD46廣泛表達(dá)于各類(lèi)細(xì)胞及相對(duì)較高水平的表達(dá)模式很好的解釋了某些病原體可利用CD46作為受體的原因。這些病原體可能利用CD46作為一個(gè)或多個(gè)補(bǔ)體調(diào)節(jié)活動(dòng)、信號(hào)傳遞能力或內(nèi)在化機(jī)制[23]。目前發(fā)現(xiàn)9種人類(lèi)特異性病原體以CD46為受體，分別包括4種病毒(麻疹病毒、B、D組腺病毒和6型皰疹病毒)和5 種細(xì)菌(淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、化膿性鏈球菌、大腸埃希菌和核梭桿菌)。其中研究最廣泛的是麻疹病毒和CD46之間的相互作用[6，24]。麻疹病毒血凝素附著在CD46結(jié)構(gòu)中的ccps1和ccps2上，引起細(xì)胞內(nèi)部化，改變細(xì)胞內(nèi)處理和抗原呈遞[25-26]。麻疹病毒與CD46結(jié)合增加了小鼠巨噬細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生[27]，降低了人巨噬細(xì)胞中IL-12的產(chǎn)生[28]，以及改變了非淋巴細(xì)胞細(xì)胞系中CD46的內(nèi)化途徑[29]。此外，麻疹病毒的附著可誘導(dǎo)CD46轉(zhuǎn)換，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解的敏感性[30-31]。腺病毒纖維結(jié)蛋白同樣附著在CD46結(jié)構(gòu)中的ccps1和ccps2上，而皰疹病毒6型的包膜糖蛋白復(fù)合物結(jié)合ccps 2和ccps 3[32]。奈瑟菌屬的Ⅳ型菌毛主要針對(duì)CD46 結(jié)構(gòu)的ccps3 和ccps4 以及STP 片段。奈瑟菌與CD46相互作用產(chǎn)生鈣通量和CYT-2的酪氨酸磷酸化[33-34]。研究表明，這種磷酸化對(duì)奈瑟菌附著和細(xì)胞骨架重排至關(guān)重要，并且奈瑟菌在感染期間也刺激CD46尾部的蛋白水解裂解[9，35]。總的來(lái)說(shuō)病原體與CD46的結(jié)合可通過(guò)誘導(dǎo)CD46下調(diào)和補(bǔ)體攻擊敏感性來(lái)觸發(fā)炎癥反應(yīng)，從而幫助宿主防御[31]、炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[36]、抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換[37]和自噬[38]。

1.2.3 CD46 與人類(lèi)自身免疫性疾病補(bǔ)體的激活對(duì)病原體具有毀滅性，但同時(shí)也可以對(duì)自身組織造成類(lèi)似的損害。補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46特性研究揭示了補(bǔ)體和適應(yīng)性免疫之間的新的和意想不到的聯(lián)系，及補(bǔ)體在感染和自身免疫疾病中的作用。CD46變異與炎癥性疾病的關(guān)系日益密切，尤其是以小血管血栓形成為特征的炎癥性疾病，特別是非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)[39-43]。CD46基因突變，內(nèi)皮細(xì)胞特異性補(bǔ)體調(diào)節(jié)缺陷，造成aHUS，表現(xiàn)為溶血性貧血、血小板減少癥和急性腎功能衰竭等癥狀[44-45]。多發(fā)性硬化是由于腦和脊髓軸突脫髓鞘導(dǎo)致認(rèn)知障礙的慢性自身免疫性疾病，而T細(xì)胞是誘導(dǎo)慢性炎癥、脫髓鞘和軸突損傷的中心角色[46]。1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tr1)是Treg的一個(gè)亞群，其特征是分泌IL-10，這是一種有效的抗炎分子。事實(shí)上，CD46有能力根據(jù)細(xì)胞因子環(huán)境將T細(xì)胞表型從Th1 轉(zhuǎn)換為T(mén)r1[18]。多發(fā)性硬化癥(MS)患者的Tr1分化途徑存在缺陷，因?yàn)榧s50%的患者在CD46激活后產(chǎn)生IL-10[47-48]。另一項(xiàng)有趣的研究表明，與健康獻(xiàn)血者相比，多發(fā)性硬化癥患者的樹(shù)突狀細(xì)胞在CD46激活后產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子IL-23p19的數(shù)量也可能增加。這增加了IL-23 的產(chǎn)生，然后反過(guò)來(lái)又誘導(dǎo)T 細(xì)胞增加IL-17 的產(chǎn)生[49]。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)強(qiáng)直的慢性全身性疾病，自動(dòng)反應(yīng)效應(yīng)T細(xì)胞調(diào)節(jié)缺陷，使T細(xì)胞在CD46激活后不會(huì)“關(guān)閉”伽馬干擾素(IFN-g)，因此缺乏IL-10+細(xì)胞亞群，產(chǎn)生的IFN-g 比健康人的T 細(xì)胞多20 倍。此外，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的IFN-g+/IL-10+T細(xì)胞群是非抑制性的，而來(lái)自健康獻(xiàn)血者的IFN-g+/IL-10+T細(xì)胞群抑制旁觀者T細(xì)胞激活[18]。CD46介導(dǎo)的Tr1分化缺陷不僅存在于MS和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[18]中，在哮喘[50]的患者中也存在。哮喘以氣道阻塞和支氣管痙攣為特征的氣道慢性炎癥性疾病，缺陷效應(yīng)T 細(xì)胞調(diào)節(jié)：IL-10生成減少[50]。有趣的是，聯(lián)合使用地塞米松和CD46共同刺激哮喘患者的T 細(xì)胞，可使IL-10 的產(chǎn)生恢復(fù)到正常水平，這表明CD46 和糖皮質(zhì)激素受體通路之間存在功能性串?dāng)_[50]。原發(fā)性C3 缺乏癥為由于重要免疫細(xì)胞功能受損而導(dǎo)致的反復(fù)和嚴(yán)重感染，C3 基因突變?nèi)鄙俚男?yīng)T 細(xì)胞誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)，CD46 激活后不產(chǎn)生IL-10和減少I(mǎi)FN-g的產(chǎn)生[51]。除上述疾病外，CD46也與免疫調(diào)節(jié)性多內(nèi)分泌疾病腸病X連鎖綜合征相關(guān)[52]。

2 hCD46與異種移植物

2.1 hCD46 與心臟移植DIAMOND 等[53]將表達(dá)hCD46的豬心臟異位移植到狒狒體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)避免了超急性排斥反應(yīng)(HAR)，心臟存活了23 d。這是首次證明hCD46 在轉(zhuǎn)基因豬器官中的表達(dá)可以保護(hù)豬器官免受異種環(huán)境中補(bǔ)體激活介導(dǎo)的損傷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因豬器官上表達(dá)hCD46 可阻止補(bǔ)體的激活。轉(zhuǎn)基因豬心臟病理沒(méi)有檢測(cè)到C5b 沉積，也沒(méi)有檢測(cè)到的膜攻擊復(fù)合物(MAC)沉積。ADAMS 等[54]在豬-狒狒心臟異種移植中發(fā)現(xiàn)與野生型心臟相比，表達(dá)hCD46 的心臟具有更長(zhǎng)的存活時(shí)間和更少的補(bǔ)體沉積。而且與超急性排斥的野生型心臟相比，表達(dá)hCD46 的心臟的組織學(xué)顯示MAC 沉積減少。表明hCD46蛋白在豬-靈長(zhǎng)類(lèi)異位心臟移植模型中對(duì)超急性排斥具有保護(hù)作用。在兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白(ATG)和利妥昔單抗誘導(dǎo)，移植前脾切除及術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑的基礎(chǔ)上表達(dá)hCD46 的異種心臟移植最高存活了137 d[55]。然而，以抗胸腺細(xì)胞球蛋白和aCD20 抗體誘導(dǎo)，用霉酚酸酯和密集劑量的aCD40(2C10R4)抗體維持的GGTA1KO.hCD46.hTBM 豬-靈長(zhǎng)類(lèi)異種心臟移植存活達(dá)到945 d[56]。

2.2 hCD46 與肺移植通過(guò)基因修飾，異種心臟、腎臟和肝臟的超急性排斥反應(yīng)和早期移植失敗的發(fā)生率顯著降低[57-58]。相比之下，表達(dá)人源C 反應(yīng)蛋白(hCRP)或GGTA1基因敲除(GGTA1KO)的豬肺異種移植在人血或豬-狒模型的體外灌注中仍然容易發(fā)生超急性肺排斥反應(yīng)(HALR)[59-60]。體外實(shí)驗(yàn)證明，hCRP 的額外表達(dá)通過(guò)抑制補(bǔ)體級(jí)聯(lián)激活，進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)異種細(xì)胞損傷的保護(hù)[61]。WESTALLG 等[62]的研究表明，表達(dá)多種基因修飾(hCD55、hCD59) 的GalTKO肺在異種灌注模型中表現(xiàn)出改善和持續(xù)的肺功能。Burdorf和Pierson使用hCD46/ GGTA1KO豬肺移植對(duì)狒狒進(jìn)行了維持生命的肺移植。hCD46 的加入對(duì)延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間幾乎沒(méi)有影響，平均存活時(shí)間的中位數(shù)為240 min，范圍為0～240 min。然而，BURDORF 等[63]發(fā)現(xiàn)與GGTA1KO 肺相比，hCD46/GGTA1KO 肺中位生存時(shí)間更長(zhǎng)(hCD46/GGTA1KO為171 min，GGTA1KO 為120 min)。而且除了補(bǔ)體激活的顯著下調(diào)外，在GGTA1KO 肺中hCD46 的表達(dá)降低了血小板和凝血級(jí)聯(lián)激活、中性粒細(xì)胞隔離和組胺釋放[63]。對(duì)于hCD46 在異種移植肺的作用，仍需進(jìn)一步研究。

2.3 hCD46 與肝移植與異種心臟或腎臟移植相比，豬肝異種移植似乎更令人困惑，盡管已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。關(guān)于異種移植肝的研究較少，而對(duì)于hCD46 在異種肝移植的研究更少。在異種肝移植研究中反復(fù)出現(xiàn)的障礙是因?yàn)檠“鍦p少癥的迅速發(fā)展，并伴有出血并發(fā)癥和凝血障礙。然而由于主要的問(wèn)題未解決，特別是凝血失調(diào)，豬肝異種移植存活率僅限于一個(gè)月[64-65]，尤其是血小板大量丟失會(huì)導(dǎo)致致命出血[66-67]。目前GGTA1KO 肝異種移植存活時(shí)間最長(zhǎng)為29 d[67]，而在GGTA1KO 的基礎(chǔ)上表達(dá)的hCD46存活了4～7 d[68]。

2.4 hCD46 與胰島移植通過(guò)移植替代受損的器官或組織是改善危及生命的疾病的理想方法。對(duì)于Ⅰ型糖尿病患者來(lái)說(shuō)，進(jìn)行胰島移植是較好的醫(yī)學(xué)治療之一，但同樣面臨著器官資源短缺的困難，而異種胰島移植是解決胰島器官來(lái)源短缺的一種潛在方法。事實(shí)上，臨床前的模型已經(jīng)證明豬胰島可以在糖尿病非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中移植、存活并實(shí)現(xiàn)葡萄糖穩(wěn)態(tài)[69-72]。在豬-非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的胰腺移植中最大的障礙是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物對(duì)豬胰島的免疫及炎癥反應(yīng)，可能表現(xiàn)為快速早期移植物排斥反應(yīng)(即血液介導(dǎo)的即時(shí)炎癥反應(yīng))或T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。豬胰島移植成功地逆轉(zhuǎn)了非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的糖尿病至少100 d[73-74]。然而，通過(guò)在豬胰島上表達(dá)hCD46 抑制補(bǔ)體激活并不能顯著減少胰島質(zhì)量的初始損失，而是有效地限制抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。這導(dǎo)致對(duì)免疫抑制的需求減少，以保持足夠的胰島質(zhì)量來(lái)長(zhǎng)期維持正常血糖[75]。

2.5 hCD46與腎移植CD46作為CRP家族的一員，它是血漿絲氨酸蛋白酶因子Ⅰ介導(dǎo)的C3 和C5 轉(zhuǎn)化酶亞基C4b和C3b的輔助因子。在本質(zhì)上，CD46在保護(hù)細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)的經(jīng)典和替代途徑的裂解方面都非常有效[10，76]。VAKNIN-DEMBINSK等[49]首次在活體內(nèi)證明了表達(dá)在豬器官上的人CD46能夠調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活和克服移植到非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)的超急性排斥反應(yīng)的能力。有研究表明盡管存在抗體和補(bǔ)體沉積，單個(gè)CD46 轉(zhuǎn)基因可控制未經(jīng)治療的狒狒超急性腎移植排斥反應(yīng)[18]。而在GGTA1KO/hCD46豬在狒狒體內(nèi)的腎臟移植，總是伴隨著消耗性凝血病的早期發(fā)展，所有接受者都在16 d 內(nèi)實(shí)施安樂(lè)死[77]。非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(NHP)的豬腎移植存活率最近顯著提高[78]。在2015年之前，豬腎移植在NHP中的最長(zhǎng)存活時(shí)間是90 d[79]。在2015 年，ADAMS 等[80]實(shí)施一例GGTA1KO/hCD46/hCD55/hTBM/hEPCR/hCD39 豬到狒狒的異種腎移植，移植物存活136 d，腎功能良好，肌酐值正常，未出現(xiàn)明顯的排斥癥狀。2019 年，KIM等[81]進(jìn)行GGTA1KO/hCD55 豬至獼猴異種腎移植，創(chuàng)造了499 d的世界最長(zhǎng)生存紀(jì)錄。

3 總結(jié)

CD46 是人體補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的一員，是一把雙刃劍。CD46可以在先天性免疫及適應(yīng)性免疫中起到免疫作用，但也能作為一些病原菌的受體引發(fā)疾病的發(fā)生。它對(duì)病原體具有毀滅性，也可對(duì)自身組織造成類(lèi)似的損害。轉(zhuǎn)基因豬的器官雖是可以解決器官資源短缺的潛在方法，但也面對(duì)著異種抗原導(dǎo)致的排斥反應(yīng)、組織相容性差、凝血功能絮亂、炎癥等問(wèn)題。hCD46是多基因修飾中的一個(gè)，在一定程度上起到增強(qiáng)組織相容性、減輕凝血功能絮亂、抑制炎癥等作用。目前hCD46在異種心臟移植的效果較好，而在異種肝、腎、胰島移植的效果差一些，但在異種移植中起到了一定作用。hCD46 的生化結(jié)構(gòu)本身就是一個(gè)復(fù)雜調(diào)節(jié)的來(lái)源，產(chǎn)生了許多亞型，其表達(dá)受到不同信號(hào)的密切調(diào)節(jié)，如凋亡和細(xì)胞激活。在功能上，CD46不僅根據(jù)其環(huán)境微調(diào)T 細(xì)胞反應(yīng)，而且通過(guò)其對(duì)表達(dá)和酶處理的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，具有啟動(dòng)和隨后終止T 細(xì)胞反應(yīng)的能力。hCD46 的復(fù)雜性要使其在異種移植中發(fā)揮更好的作用，還需要一定的科學(xué)研究。