4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因多樣性分析和傳播風(fēng)險評估

劉 燕,朱 冬,2，何 燕，楊宇帆，彭 超，錢永明，王 東,唐 赟,路 璐*

(1.西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,四川 南充 637009;2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085;3.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 南充 637002;4.西華師范大學(xué)法學(xué)院,四川 南充 637002)

我國是抗生素生產(chǎn)和使用大國，每年抗生素生產(chǎn)量約21萬t，其中9.7萬t(占年總產(chǎn)量的46.1%)抗生素用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素被應(yīng)用于疾病預(yù)防和治療，同時作為飼料添加劑促進(jìn)動物生長。然而，長期濫用或不合理使用抗生素會誘導(dǎo)畜禽糞便中產(chǎn)生大量的抗生素耐藥微生物和抗生素抗性基因。大量研究發(fā)現(xiàn)，畜禽糞便中含有高度富集的抗生素抗性基因，這些糞便會對養(yǎng)殖區(qū)域及周圍環(huán)境造成潛在的抗性基因污染。同時，抗性基因的污染不同于傳統(tǒng)的化學(xué)污染物，抗性基因可通過各種可移動遺傳元件，如整合子、轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒等，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等基因水平轉(zhuǎn)移方式在同一菌種的個體之間甚至在不同菌種之間傳遞，并通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合的途徑進(jìn)入其他環(huán)境細(xì)菌和致病菌中，對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成潛在的威脅。

目前，我國對產(chǎn)生的大量畜禽糞便主要是通過肥料化技術(shù)進(jìn)行資源化利用。雖然堆肥技術(shù)可以消減畜禽糞便中抗生素的殘留、抗生素抗性基因的豐度以及致病微生物，但是一些研究發(fā)現(xiàn)堆肥后糞肥中仍有較高豐度的抗性基因存在，表示堆肥可能是良好的生物反應(yīng)器，能促進(jìn)其抗性微生物的增殖。此外，農(nóng)田土壤中施用糞肥顯著提高了抗生素抗性基因的豐度和多樣性,可能導(dǎo)致耐藥性微生物和抗性基因在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的擴(kuò)散與傳播。然而，除了批量地施用于農(nóng)田土壤外，這些糞肥還可用于家庭種植花卉或者果蔬。目前隨著網(wǎng)絡(luò)交易平臺的成熟，糞肥也大量在網(wǎng)絡(luò)平臺售賣，比如淘寶平臺糞肥銷售廠家約有700家，每天交易量達(dá)數(shù)百起。這種網(wǎng)絡(luò)銷售途徑可能是抗生素抗性基因在更廣范圍上傳播的新途徑，進(jìn)而導(dǎo)致被施用土壤中抗生素抗性基因的污染。此外，有研究表明肥料中的抗生素抗性基因能遷移至地上種植的植物或蔬菜根際、葉際中，進(jìn)而可能通過食物鏈進(jìn)入人體，對人類健康造成潛在的威脅。因此，探究網(wǎng)絡(luò)銷售的糞肥中抗生素抗性基因的多樣性和豐度，并評估其潛在的傳播風(fēng)險顯得尤為緊迫。

本研究以在網(wǎng)絡(luò)平臺購買的牛糞、羊糞、雞糞和雞羊混合糞4種糞肥作為供試材料，采用高通量熒光定量PCR技術(shù)對4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因的豐度和多樣性進(jìn)行比較分析，評估網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥是否為抗生素抗性基因的傳播途徑，進(jìn)而評價其傳播風(fēng)險。本文采用的296個引物涵蓋了283個抗生素抗性基因(針對9種主要的抗生素：氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、MLSB類、磺胺類、四環(huán)素類、萬古霉素類、多重抗性類和其他類)、12個可移動遺傳元件標(biāo)記基因和細(xì)菌16S rRNA基因，以期對網(wǎng)絡(luò)源糞肥中抗生素抗性基因污染情況有較全面的認(rèn)識，并為可能的潛在生態(tài)環(huán)境風(fēng)險評價提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試糞肥信息

于2018年10月8日在淘寶在線交易平臺，分別在4個月銷量大于1 300 kg的廠家購買了牛糞肥、雞糞肥、羊糞肥和雞羊混合肥4種發(fā)酵糞肥，發(fā)貨地址分別是河南鄭州、河南安陽、四川成都和安徽合肥。其中，雞糞肥、羊糞肥、雞羊混合糞肥是將其糞便經(jīng)過堆肥發(fā)酵而形成的畜禽類糞肥；牛糞肥為蚯蚓堆肥，即使用發(fā)酵過的純牛糞堆成壟狀飼養(yǎng)蚯蚓，經(jīng)蚯蚓消化后的肥料，再經(jīng)過堆肥過篩再次發(fā)酵，形成松散的均勻粒狀的牛糞肥。將各種糞肥過2 mm孔徑篩并裝入塑封袋中置于-20℃冰箱，以備后續(xù)分子生物學(xué)分析。

1.2 總DNA的提取

采用Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals,Cleveland,OH,USA) 提取糞肥中的微生物總DNA，每個樣品3個重復(fù)。樣品中DNA濃度和質(zhì)量采用NanoDrop分光光度計 (Nanodrop Technologies Inc.,Wilmington,DE) 進(jìn)行測定和評估，所提取的DNA樣品的A260/A280值在1.8～2.0之間，提取的DNA樣品保存于-20℃以備后續(xù)分析。

1.3 熒光定量PCR分析

實時熒光定量PCR擴(kuò)增使用SYBRPremix ExTaq TM(TliRNaseH Plus)試劑盒在CFX96 Optical Real-Time PCR System熒光定量儀(Bio-Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA,USA)上進(jìn)行分析,對所有樣品的16S rRNA基因豐度進(jìn)行絕對定量。實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線采用含有16S rRNA基因的質(zhì)粒，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線按10倍梯度稀釋，得到7個數(shù)量級的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)粒濃度的變化范圍為10～10copies/μL。實時熒光定量PCR擴(kuò)增體系為10 μL：5.0μL SYBRPremixEx Taq TM(TliRNaseH Plus)，1.0 μL DNA模板，10 μmol/L正、反向引物各0.1 μL，3.8 μL滅菌雙蒸水，陰性對照采用滅菌雙蒸水代替樣品DNA，擴(kuò)增效率為90.6%～101.3%，

R

在0.97～0.99的范圍內(nèi)。對4種糞肥的3個重復(fù)樣品開展微生物總DNA的定量測定。

1.4 高通量熒光定量PCR測定抗生素抗性基因和可移動遺傳元件

糞肥中的抗生素抗性基因在SmartChip Real-Time PCR Systems(WaferGen Inc.,USA)高通量實時熒光定量PCR平臺測定。抗性基因引物參照文獻(xiàn)[5]，使用了283對抗性基因引物、8對轉(zhuǎn)座酶基因、4對整合酶-整合子基因和1對細(xì)菌通用16S rRNA基因引物。高通量熒光定量PCR擴(kuò)增體系的體積為100 nL，其中各試劑終濃度為：1×LightCycler 480 SYBRGreen IMaster Mix (Roche，USA),Nuclease-free PCR-Grade water，1 μg/μL的牛血清蛋白(BSA)，5 ng/μL的DNA模板和1 μmol/L的上下游引物。高通量熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，60℃退火延伸30 s，總共40個循環(huán)；熱循環(huán)儀Cycler的程序自動升溫進(jìn)行熔解曲線分析。高通量熒光定量PCR每個芯片都有不添加DNA模板(用滅菌超純水代替)的陰性對照。高通量熒光定量PCR反應(yīng)得到的數(shù)據(jù)通過Cycler預(yù)設(shè)定的篩選條件(擴(kuò)增效率介于1.8～2.2)進(jìn)行導(dǎo)出。根據(jù)Smart Chip Real-Time PCR Systems的靈敏度和精確度，確定循環(huán)次數(shù)

C

值為31次時作為儀器的檢測限，每個樣品的2個重復(fù)均被檢測出，且擴(kuò)增效率在90%～110%內(nèi)被視為有效數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計分析

抗生素抗性基因和可移動遺傳元件的相對拷貝數(shù)參照Zhu等的研究，采用公式(1)進(jìn)行估算，并根據(jù)Stalder等的研究，采用公式(2)計算抗生素抗性基因的絕對豐度。具體計算公式如下：

C

=10[(31-)(103)]

(1)

基因的絕對拷貝數(shù)

(2)

式中:

C

為抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)(copies/bacterial cell)；

C

為PCR反應(yīng)收集到特定熒光時的循環(huán)次數(shù)(次)；

A

為抗生素抗性基因的絕對豐度(copies/g)，16S rRNA基因的拷貝數(shù)(copies/g)。

本文利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行計算分析，使用SPSS 23.0(SPSS Inc.，USA)進(jìn)行單因素方差顯著性分析和相關(guān)性統(tǒng)計分析，利用 Origin Pro 2018(Origin Lab，USA)制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中檢測出的抗生素抗性基因和可移動遺傳元件的種類

4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中檢測出的抗生素抗性基因和可移動遺傳元件的種類，見圖1。

圖1 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中檢測出的抗生素抗性基因和可移動遺傳元件的種類Fig.1 Diversity of antibiotic resistance genes and Mobile Genetic Elements(MGEs) in the four manure

由圖1可以看出：

(1) 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中共檢測出165種不同的抗生素抗性基因亞型，其中羊糞肥中檢出的抗生素抗性基因最多，有130種，牛糞肥和雞羊混合糞肥中檢出的抗生素抗性基因最少，均為89種，雞糞肥中檢出98種抗生素抗性基因[見圖1(a)]，這一發(fā)現(xiàn)與施用豬糞的水稻土壤(107種)、大型養(yǎng)豬場糞便(136種)、雞糞肥(127種)和牛糞肥(107種)等環(huán)境中檢出的抗生素抗性基因的個數(shù)相當(dāng)，表明網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中存在多樣性豐富的抗生素抗性基因。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中共檢出的可移動遺傳元件的數(shù)量為10種，包括3個整合子和7個轉(zhuǎn)座子，其中羊糞肥中檢出的可移動遺傳元件的個數(shù)最多，為8種[見圖1(a)]。已有研究表明，抗生素抗性基因在環(huán)境中的水平基因轉(zhuǎn)移與可移動遺傳元件密切相關(guān)，抗生素抗性基因可以隨著可移動元件(如整合子、質(zhì)粒等)進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移，使得抗性基因在不同種屬微生物間傳播，更是加劇了抗性基因在不同環(huán)境介質(zhì)中的傳播風(fēng)險?？梢苿舆z傳元件作為基因水平轉(zhuǎn)移重要的分子傳播元件，在4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中均被檢出，表明在這4種糞肥中存在抗生素抗性基因水平轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險。

(2) 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中檢出的抗生素抗性基因主要以氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)脂類-林肯酰胺類-鏈陽性菌素B類(MLSB類)、多重耐藥類和四環(huán)素類為主，分別占整體的比例為22%、21%、17%和14%[見圖1(b)]，該發(fā)現(xiàn)與以往在牛糞肥、雞糞肥和豬糞肥中檢出的抗生素抗性基因的抗性類型相同。這可能與我國養(yǎng)殖業(yè)中使用的抗生素類型相關(guān)，因為抗生素的添加和殘留是畜禽糞便抗生素抗性基因富集的主要原因之一，即使抗生素的濃度非常低，也能對環(huán)境中的抗性微生物和抗性基因產(chǎn)生選擇性壓力。且也有數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，我國養(yǎng)殖業(yè)飼料中主要添加隸屬于氨基糖苷類的新霉素、慶大霉素，四環(huán)素類的土霉素、金霉素，林肯酰胺類的林可霉素，大環(huán)內(nèi)酯類的泰樂菌素等抗生素。

(3) 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因的抗性類型組成存在一定的差異。在羊糞肥中檢出的氨基糖苷類(30±0.71)、MLSB類(29±0.71)、多重耐藥類(26±0.00)、四環(huán)素類(16±0.71)抗性基因的個數(shù)顯著高于其他類糞肥(

p

<0.05)，而在牛糞肥中檢出的氯霉素類(3±0.71)抗性基因的個數(shù)高于其他類糞肥，但4種糞肥中檢出的β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素類和其他類抗性基因的種類沒有顯著差別。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因抗性類型的不同，可能是由于其糞肥對應(yīng)的養(yǎng)殖場抗生素使用情況不同，且與堆肥的方式不同有關(guān)。宋婷婷等研究發(fā)現(xiàn)，堆肥方式的不同(溫度、濕度、pH值、堆肥材料的性質(zhì)、糞便的類型等)對糞肥中抗生素抗性基因的抗性類型有顯著的影響。根據(jù)對抗生素抗性機(jī)制的不同，將檢出的抗生素抗性基因分為抗生素失活、核糖體保護(hù)、外排泵作用和其他/未知4大類。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素主要的抗性機(jī)制為抗生素失活(43%)，其次為外排泵作用(31%)和核糖體保護(hù)(23%)，其他/未知僅為3%[見圖1(c)]，這與Zhu等在3個大型養(yǎng)豬場豬糞及周邊土壤的研究結(jié)果類似，其在豬糞中也發(fā)現(xiàn)抗生素失活和外排泵作用為主導(dǎo)的抗生素抗性機(jī)制。

2.2 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因的豐度分析

4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因和可移動遺傳元件的絕對豐度和相對拷貝數(shù)，見圖2。

由圖2可以看出：

(1) 4種糞肥中抗生素抗性基因的絕對豐度介于7.18×10～3.99×10copies/g(干重)之間，且4種糞肥中抗生素抗性基因的絕對豐度間有顯著差異(

p

<0.01)。其中，牛糞肥中抗生素抗性基因的絕對豐度最低，為7.18×10copies/g(干重)；羊糞肥中抗生素抗性基因的絕對豐度最高，為3.99×10copies/g(干重)，是牛糞肥的5 555.2倍；雞羊混合糞肥中抗生素抗性基因的絕對豐度也顯著高于牛糞肥和雞糞肥，為2.66×10copies/g(干重)[見圖2(a)]。羊糞肥和雞羊混合糞肥中抗生素抗性基因的絕對豐度顯著高于以往在農(nóng)田土壤[10～10copies/g(干重)]、湖泊和水庫[10～10copies/g(干重)]、河口底泥[10～10copies/g(干重)]等環(huán)境樣品中所檢測出的抗生素抗性基因的豐度，表明糞肥的網(wǎng)絡(luò)交易可能導(dǎo)致抗生素抗性基因的高能擴(kuò)散，其攜帶的抗性基因能通過施肥等方式擴(kuò)散至不同的環(huán)境中。此外，該些網(wǎng)絡(luò)交易的羊糞肥、雞糞肥和雞羊混合糞肥所檢測出的抗生素抗性基因豐度也均高于Zhang等在雞糞肥、牛糞肥和豬糞肥[10～10copies/g(干重)]中所檢出的抗生素抗性基因的豐度，進(jìn)一步揭示網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥存在抗生素抗性基因傳播的風(fēng)險，因此亟需制定網(wǎng)絡(luò)交易糞肥抗性基因的控制標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因和可移動遺傳元件的絕對豐度和相對拷貝數(shù)Fig.2 Absolute abundance and relative abundance of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in the four types of manure

(2) 從各抗性基因類型的絕對豐度計算結(jié)果來看，4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中主導(dǎo)的抗生素抗性基因類型是氨基糖苷類(47.10%)、磺胺類(22.04%)和多重耐藥類(20.26%)，占總的絕對豐度的89.4%。這一結(jié)果與Zhang等對雞糞肥、牛糞肥和豬糞肥中抗性基因類型豐度的研究結(jié)果相似，其也發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類(20%)為豐度最高的抗性基因。而氨基糖苷類和磺胺類抗性基因的富集也可能與養(yǎng)殖業(yè)中這兩類抗生素的廣泛使用相關(guān)。多重耐藥類抗性基因在4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中的發(fā)現(xiàn)需要引起更多關(guān)注，已有研究表明多重耐藥類抗性基因的傳播對人類和動物抗感染治療是極大的威脅。多重耐藥類抗性基因的檢出和較高豐度進(jìn)一步表明需對網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥做微生物安全的防控。此外，不同類型的抗性基因絕對豐度在4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中的比例也極顯著不同(

p

<0.01)，如：雞羊混合糞肥中氨基糖苷類抗性基因的絕對豐度顯著高于其他3種糞肥(

p

<0.05)，其絕對豐度分別是牛糞肥、雞糞肥和羊糞肥的10 266.1倍、110.7倍和1.2倍；磺胺類抗性基因的絕對豐度在羊糞肥中最高，是牛糞肥、雞糞肥和羊糞肥的13 354.23倍、6.87倍和1.62倍。不同糞肥中抗生素抗性基因絕對豐度的差異可能與不同養(yǎng)殖場抗生素使用類型、用量以及后續(xù)發(fā)酵處理的差異等因素相關(guān)。如Zhu等在分析比較北京、嘉興和莆田3個養(yǎng)豬場糞肥中抗生素抗性基因的絕對豐度時也發(fā)現(xiàn)，3個養(yǎng)殖場糞肥中抗生素抗性基因的種類和豐度組成不同，該結(jié)果說明不同網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因的承載量以及類型、豐度有顯著的差異。

(3) 為評估抗生素抗性基因在整個細(xì)菌群落中的豐度及其富集程度，本文計算了4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中平均每個細(xì)菌細(xì)胞中抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)[見圖2(b)]，相對拷貝數(shù)越高，表明該樣品中抗性基因的富集密度和傳播風(fēng)險越大。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)范圍在0.013～0.727 copies/bacterial cell之間，平均每個細(xì)胞有0.253個抗性基因。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)變化規(guī)律與抗生素抗性基因絕對豐度的變化規(guī)律一致，羊糞肥中抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)仍是最高，為0.727 copies/bacterial cell，牛糞肥中抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)最低，為0.013 copies/bacterial cell,僅是羊糞肥的1/56。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)介于前期研究的堆肥污泥(0.77～2.50 copies/bacterial cell)、河口底泥(0.21～1.93 copies/bacterial cell)以及雞糞肥、牛糞肥和豬糞(0.15～1.81 copies/bacterial cell)等環(huán)境樣品中抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)檢測值。而這4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)均顯著高于何燕等在7個稻田土壤糞肥中抗生素抗性基因的檢測范圍(0.006～0.025 copies/bacterial cell)，同時也高于其他農(nóng)田土壤(平均值為0.074 copies/bacterial cell)、淡水湖泊(0.01～0.38 copies/bacterial cell)等環(huán)境樣品中抗生素抗性基因在微生物群落中的富集程度。這些結(jié)果表明網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中存在抗生素抗性基因的富集，具有較高的傳播風(fēng)險。

(4) 從各類型抗性基因的相對拷貝數(shù)計算結(jié)果來看，4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中的抗生素抗性基因種類以氨基糖苷類(39.91%)、磺胺類(24.71%)和多重耐藥類(22.60%)3類為主導(dǎo)。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中不同抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)也有顯著的差異(

p

<0.01)。如在牛糞肥、羊糞肥和雞羊混合糞肥3種糞肥中，主導(dǎo)的抗生素抗性基因為氨基糖苷類，占總抗性基因相對拷貝數(shù)的23.64%～65.57%，其次是多重耐藥類，占總抗性基因相對拷貝數(shù)的9.55%～28.11%。然而，雞糞肥中主導(dǎo)的抗性基因為磺胺類(72.35%)，其次才是氨基糖苷類(9.17%)，兩者占總抗性基因相對拷貝數(shù)的81.54%。值得注意的是，在4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中，牛糞肥中抗生素抗性基因的種類和豐度均極顯著低于其他糞肥(

p

<0.01)，且顯著低于以往在牛糞肥等糞肥中檢出的抗生素抗性基因種類和豐度。本研究中的牛糞肥經(jīng)過了蚯蚓進(jìn)一步分解，其中的有機(jī)質(zhì)進(jìn)一步得到分解。有研究表明，在長期施用污泥或雞糞肥的土壤中發(fā)現(xiàn)，土壤動物蚯蚓腸道中的抗生素抗性基因豐度顯著增加。而本研究中網(wǎng)絡(luò)購買的牛糞肥蚯蚓堆肥中較低的抗生素抗性基因豐度可能受很多未知因素的影響，其抗生素抗性基因豐度是否與抗性基因向蚯蚓腸道中遷移有關(guān)、抑或蚯蚓降低了糞肥中抗性基因的豐度，或是否由于抗性基因本身在糞源中含量較低，仍需要未來進(jìn)一步設(shè)計試驗來進(jìn)行研究驗證。該結(jié)果也進(jìn)一步表明網(wǎng)絡(luò)交易的不同糞肥中含有的抗生素抗性基因的豐度有較大的差異。

2.3 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中可移動遺傳元件豐度比較及其相對拷貝數(shù)與抗生素抗性基因相對拷貝數(shù)的相關(guān)性分析

由圖2(c)、(d)可見，4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中可移動遺傳元件(轉(zhuǎn)座子和整合子)的絕對豐度和相對拷貝數(shù)分別介于2.61×10～2.90×10copies/g(干重)和0.007～0.088 copies/bacterial cell之間，并且不同的糞肥其絕對豐度和相對拷貝數(shù)均有顯著性的差異(

p

<0.05)。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中可移動遺傳元件的絕對豐度顯著高于河口底泥[5.66×10～4.23×10copies/g(干重)]，與稻田土壤的可移動遺傳元件絕對豐度[1.14×10～2.29×10copies/g(干重)]相當(dāng)。本研究中的糞肥樣品中可移動遺傳元件的相對豐度顯著高于森林土壤，且其每克糞肥樣品中可移動遺傳元件的絕對豐度比受人為干擾極少的北極圈土壤高出10～10copies/g(干重)。羊糞肥中可移動遺傳元件的絕對豐度和相對拷貝數(shù)均顯著高于其他糞肥樣品，分別高出其他3種糞肥約4～1 110倍和6～12倍?？梢苿舆z傳元件作為基因水平轉(zhuǎn)移的重要傳播元件，表明羊糞肥中抗性基因可能有較高的傳播風(fēng)險。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中各抗性基因相對拷貝數(shù)與可移動遺傳元件相對拷貝數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果，見表1。

表1 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中各抗生素抗性基因相對拷貝數(shù)與可移動遺傳元件相對拷貝數(shù)的相關(guān)性分析Table 1 Pearson correlation for the relative copy mumber of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in the four online-trading manure

通過分析4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中各抗性基因相對拷貝數(shù)與可移動遺傳元件相對拷貝數(shù)的相關(guān)性(見表1)，結(jié)果表明：4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中總抗性基因相對拷貝數(shù)與總可移動遺傳元件的相對拷貝數(shù)呈極顯著正相關(guān)(

p

<0.01)，這一結(jié)果與在水體、雞糞、牛糞和豬糞、施肥后的土壤等不同環(huán)境樣品中的研究結(jié)果相同，表明抗生素抗性基因可通過可移動遺傳元件進(jìn)行基因的水平轉(zhuǎn)移，使得抗生素抗性基因在不同微生物間遷移傳播，進(jìn)而增加其傳播風(fēng)險，說明這些糞肥中抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移可能是抗性基因遷移傳播的重要途徑。本研究還發(fā)現(xiàn)，多重抗藥類抗性基因、四環(huán)素類抗性基因、氯霉素類抗性基因、MLSB類抗生素抗性基因的相對拷貝數(shù)與可移動遺傳元件的相對拷貝數(shù)都呈極顯著正相關(guān)(

p

<0.01)，這一結(jié)果與dela Cruz等的研究結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類和氯霉素類抗性基因相對拷貝數(shù)與可移動遺傳元件相對拷貝數(shù)具有一定的相關(guān)性，進(jìn)一步表明這4種糞肥中可移動遺傳元件可能促進(jìn)了這些抗生素抗性基因的遷移、傳播和擴(kuò)散。此外，所有的抗生素抗性基因類型都與整合子有顯著的相關(guān)性(

p

<0.05)。整合子被認(rèn)為是導(dǎo)致耐藥基因在細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移的重要原因之一，表明抗性基因的水平轉(zhuǎn)移可能在糞肥中抗生素抗性基因的富集中起著關(guān)鍵的作用，并可能加劇糞肥中抗性基因傳播的風(fēng)險。然后，這些糞肥在施入土壤后，其中的抗生素抗性基因在土壤中的歸趨行為、或傳播至地上植物的遷移行為等，仍需要進(jìn)一步開展模擬試驗研究來直接揭示抗性基因的傳播行為模式和風(fēng)險。

2.4 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中共有、獨有和主導(dǎo)的抗生素抗性基因種類分析

4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中共有、獨有和主導(dǎo)的抗生素抗性基因種類分析結(jié)果，見圖3和圖4。

圖3 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中檢出的抗生素抗性基因和可移動遺傳元件種類數(shù)的韋恩圖Fig.3 Venn based on the number of antibiotic tresisance genes and mobile genetic elements detected in the four online-trading manure

圖4 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中抗生素抗性基因和可移動遺傳元件的相對豐度熱圖Fig.4 Heat map based on the relative abundance of antibiotic resistance genes and mobile genetic elementsin the four online-trading manure

由圖3和圖4可見，4種糞肥中共有的抗生素抗性基因亞型有35種，可移動遺傳元件有4種。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中共有的主導(dǎo)抗性基因亞型和可移動遺傳元件為

sul

2(磺胺類)，

aadA

-02、

aadA

2-03、

aadA

-01、

aadA

1和

aadA

2-02(氨基糖胺類)，

tetL

-02(四環(huán)素類)，

intI

-1

LC

(整合子類)。其中，

sul

2抗性基因在牛糞肥、雞糞肥、羊糞肥和雞羊混合糞肥中分別占總抗性基因相對拷貝數(shù)的4.49%、58.26%、18.67%和18.56%，

sul

2抗性基因已在河流沉積物、土壤、養(yǎng)豬場豬糞及其周邊土壤等環(huán)境樣品中檢出并且豐度較高，這可能是由于

sul

2抗性基因通常定位于較小的非接合型質(zhì)粒或較大的可移動多重抗性質(zhì)粒上，而質(zhì)粒作為可移動元件是抗生素抗性基因水平基因轉(zhuǎn)移的重要途徑，可能導(dǎo)致了

sul

2抗性基因在各環(huán)境條件下的廣泛分布；

aadA

類基因在牛糞肥、雞糞肥、羊糞肥和雞羊混合糞肥中占總抗性基因相對拷貝數(shù)的5.30%、5.36%、31.81%和61.97%，

aadA

類抗性基因是在污水、廢水和動物糞便等環(huán)境樣品中檢出最為頻繁的一類基因，且

aadA

類抗性基因通常存在于整合子類

intI

-1的基因盒中，

aadA

類抗性基因在4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中均被檢出進(jìn)一步表明糞肥中抗性基因存在很高的水平基因遷移風(fēng)險；編碼外排泵類四環(huán)素抗性基因

tetL

-02在4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中均被檢出，并且有較高的豐度，

tetL

-02抗性基因在豬糞、土壤、廢水等環(huán)境樣品中均被檢出，此外有研究發(fā)現(xiàn)，

tetL

-02抗性基因與轉(zhuǎn)座子

tnpA

抗性基因呈顯著正相關(guān)，而轉(zhuǎn)座子作為可移動遺傳元件可促進(jìn)基因水平轉(zhuǎn)移，進(jìn)而增加其潛在的傳播風(fēng)險；

intI

-1

LC

抗性基因是對抗生素抗性基因水平遷移有關(guān)鍵作用的整合子基因，

intI

-1

LC

類整合子是判定環(huán)境是否受人為源污染的標(biāo)志基因之一，此外

intI

-1

LC

抗性基因可與很多抗生素抗性基因的基因盒進(jìn)行整合連接，如氨基糖苷類抗性基因

aadA

、四環(huán)素類抗性基因

tetG

等都在

intI

-1類整合子的基因盒中發(fā)現(xiàn)，從而使細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性。此外，不同糞肥中的主導(dǎo)抗性基因也各不相同(見圖4)。如牛糞肥中主導(dǎo)的抗性基因亞型為

aacC

(氨基糖胺類)、

mphA

-01(

MLSB

類)、

sul

2(磺胺類)和

oprD

(多重耐藥類)，占總抗性基因相對豐度的45.19%；而羊糞肥主導(dǎo)的抗性基因亞型則為

sul

2(磺胺類)、

qacEdelta

1-02和

mexF

(多重耐藥類)、

aadA

9-02、

aadA

9-01和

aadA

2-01(氨基糖胺類)，占總抗性基因相對豐度的58.15%。4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中均檢出其獨有的抗生素抗性基因(見圖3)。如羊糞肥中檢出24種其獨有的抗性基因，其中多重耐藥類

mexF

抗性基因的相對豐度最高，占總抗性基因相對豐度的28.12%。有研究發(fā)現(xiàn)

mexF

抗性基因在施用了糞肥的土壤中顯著富集；黃福義等也研究發(fā)現(xiàn)施用了豬糞的水稻土壤中

mexF

基因的相對豐度相對于對照組土壤增加了1 791倍。牛糞肥中檢出10種獨有的抗性基因，其中萬古霉素類

vanC

-03抗性基因占總?cè)f古霉素類抗性基因相對豐度的70.41%。萬古霉素作為人類抵抗細(xì)菌感染的“最后一道防線”之一，然而，隨著人類醫(yī)療中萬古霉素的廣泛使用，已在很多環(huán)境中富集，如河口沉積物、土壤、水體，萬古霉素類抗性基因的檢出和富集表明牛糞肥可能受到人為污染源的影響，并警示糞肥中抗性基因的污染亟需管控。此外，

qacEdelta

1-02抗性基因僅在羊糞肥和雞羊混合糞肥中檢出，且分別占兩者總抗性基因相對豐度的68.11%和22.76%，且該抗性基因與可移動遺傳元件呈顯著正相關(guān)(

R

=0

.

993，

p

<0.01)。

qacEdelta

1抗性基因一般存在于Ⅰ類整合子的3′保守區(qū)，該抗性基因在糞肥中的富集表明這些糞肥施用至土壤環(huán)境中會存在潛在的水平基因轉(zhuǎn)移。

3 結(jié)論與建議

(1) 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中存在豐富多樣的抗生素抗性基因，糞肥的網(wǎng)絡(luò)交易可能是抗生素抗性基因潛在的遷移和傳播載體。

(2) 購買于不同商家的4種糞肥中抗生素抗性基因的豐度均有顯著的差異(

p

<0.01)，且其主導(dǎo)的抗性基因類型以及亞基型組成均存在差異，這可能與生產(chǎn)糞肥的養(yǎng)殖場類型、抗生素使用類型以及發(fā)酵技術(shù)相關(guān)。更大尺度和廣度的網(wǎng)絡(luò)源糞肥中抗性基因的分布規(guī)律仍需進(jìn)一步探究。(3) 4種網(wǎng)絡(luò)交易的糞肥中均檢測出較高豐度的可移動遺傳元件，且抗生素抗性基因相對拷貝數(shù)與可移動遺傳元件的相對拷貝數(shù)呈極顯著正相關(guān)(

p

<0.01)，表明糞肥中的抗生素抗性基因存在轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，因此需加強對糞肥抗生素抗性基因水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險評估，并建議國家相關(guān)農(nóng)業(yè)部門加強糞肥的監(jiān)查管理，制定網(wǎng)絡(luò)交易糞肥的微生物安全標(biāo)準(zhǔn)，并完善相關(guān)法律管控。