竹醋液與漂白液對(duì)大腸桿菌抑菌殺菌效果對(duì)比

袁花艷,周獻(xiàn)峰,徐偉兵（廣東省惠州市惠陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心,廣東 惠州 516211）

近年來(lái)含氯消毒劑的發(fā)展較快，由以前的氯氣及主要含次氯酸鈣的漂白粉，發(fā)展到現(xiàn)在的二氧化氯、氯化溴和氯代異氰尿酸等高效、快速、廣譜的消毒劑[1]，但漂白液依然是日常生活中常使用的消毒劑。然而含氯消毒劑也有其自身的弱點(diǎn)，它的殺菌性能易受到有機(jī)物及酸堿度的影響，對(duì)物品有一定的腐蝕作用，有些含氯消毒劑不夠穩(wěn)定，容易分解，消毒劑還能與體系中的芳香族化合物反應(yīng)生成劇毒的物質(zhì)，污染環(huán)境，危害人體健康。竹醋液是20世紀(jì)末日本率先開(kāi)發(fā)成功的一種純天然綠色環(huán)保產(chǎn)品，主要成分為水（約含80%），次要成分為有機(jī)酸類（約含7%-11%，其中醋酸約含6%）、酚類（約含6%-8%）、酮類（約含0.8%-1%）、醛類（約含0.02%-1%）、醇類（約含0.01%-1%）和一些微量成分（約含0.05%-1%），成分隨著熱解溫度、炭化設(shè)備、精制方法、儲(chǔ)存條件等的不同而變化[2]。在日本、韓國(guó)等國(guó)竹醋液在農(nóng)林業(yè)上的研究應(yīng)用已較為廣泛。據(jù)研究，竹醋液具有殺菌、殺蟲(chóng)、保鮮除臭、無(wú)毒副作用等諸多優(yōu)異的特性[3-5]；竹醋液在農(nóng)業(yè)上可以用于調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)，促進(jìn)植物的發(fā)芽[6]；在醫(yī)藥衛(wèi)生和環(huán)境保護(hù)上可以作殺菌劑和抑菌劑使用[7]。但將竹醋液與其他種類的消毒劑比較研究國(guó)內(nèi)外都較少，因此本研究就是通過(guò)將竹醋液作為消毒劑對(duì)大腸桿菌抑制殺滅方面的應(yīng)用，以及與漂白液進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果為竹醋液在某些應(yīng)用部分或者全部替代漂白液提供參考，以減少化學(xué)消毒劑的用量，為以后環(huán)保消毒劑的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 竹醋液：由廣東自然堂生物有限公司提供，pH=2-3。漂白液：商品名：藍(lán)月亮漂白液，生產(chǎn)廠家：廣州藍(lán)月亮實(shí)業(yè)有限公司，凈含量為1.2kg，有效氯含量為40000mg/L，pH=12-13，生產(chǎn)期為2019年2月3日，有效期至2021年2月3日。標(biāo)準(zhǔn)硬水（硬度342mg/L）；胰蛋白胨生理鹽水溶液（TPS）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），實(shí)驗(yàn)試劑制備以及應(yīng)用參考《2008年消毒技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行[8]。大腸桿菌由惠陽(yáng)疾控微生物室提供。用打孔機(jī)制備直徑為7mm的紙片，高壓后備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 ①不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。②電熱恒溫培養(yǎng)箱（湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）。③電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）。④三角恒溫水箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液配制方法 吸取5.0mL稀釋液加入到第6代大腸桿菌菌種的新鮮斜面瓊脂培養(yǎng)基，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0mL吸管將洗液移至另一無(wú)菌試管中，在手掌上拍打80次，以使細(xì)菌懸浮均勻。制備成實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的菌懸液濃度。

1.2.2 消毒劑配制方法 分別取五體積的竹醋原液與五體積無(wú)菌水將其混合均勻，并對(duì)該稀釋液進(jìn)行逐級(jí)稀釋（即二倍稀釋），稀釋成竹醋液濃度分別為50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%和1.5625%以及原液七個(gè)濃度梯度；分別取五體積漂白液與五體積無(wú)菌水將其混合均勻，并對(duì)該稀釋液進(jìn)行逐級(jí)稀釋（即二倍稀釋），稀釋成漂白液濃度分別為20000mg/L、10000mg/L、5000mg/L、2500mg/L、1250mg/L和625mg/L以及原液七個(gè)濃度梯度；將竹醋液替代標(biāo)準(zhǔn)硬水，按照上述方法操作以及稀釋梯度，稀釋漂白液得到相應(yīng)的六個(gè)稀釋濃度。

1.2.3 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù) 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)使用平板傾注法，操作程序如下：取10支試管置于試管架上，每管加入4.5mL稀釋液。由左向右，逐管標(biāo)上10-1、10-2、10-3、……、10-10 。用1.0ml試管吸取0.5mL新鮮的第六代大腸桿菌菌懸液加入10-1管內(nèi)。將10-1管依前法在手掌上用力振打80次，混勻，再吸取出0.5mL加入10-2管內(nèi)，如此類推，直至10-10管。

取6個(gè)平皿，由左至右，逐皿標(biāo)上10-5至10-10，取出10-5至10-10菌懸液管，吸取其中混合均勻的懸液1.0mL對(duì)號(hào)加于各個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)平皿。將40℃-45℃熔化的培養(yǎng)基，傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿15mL-20mL。將平皿蓋好，即刻輕輕搖動(dòng)均勻，平放。待瓊脂凝固后，反轉(zhuǎn)平皿使底向上置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)。

培養(yǎng)至48小時(shí)后，觀察并計(jì)算各平皿的菌落數(shù)。記錄每平板菌落數(shù)在15cfu-300cfu的稀釋度。一般含菌量約為1×108cfu/mL-5×108cfu/mL。平行三次試驗(yàn)，組間誤差率不應(yīng)該超過(guò)10%，計(jì)數(shù)平均結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)。平板間誤差率=（板間菌落平均數(shù)/板間菌落平均數(shù)）×100%。

1.2.4 中和劑的鑒定 在細(xì)菌殺滅試驗(yàn)中所用中和劑的鑒定，至少應(yīng)平行進(jìn)行以下各組試驗(yàn)。

第1組：中和劑+菌懸液→培養(yǎng)

第2組：（消毒劑+中和劑）+菌液→培養(yǎng)

第3組：稀釋液+菌懸液→培養(yǎng)

第4組：稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基→培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，所測(cè)中和劑可判為合格。

①第1、2和3組有相似量試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，懸液試驗(yàn)作用體系中菌量在50cfu/mL-300cfu/mL之間。其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過(guò)15%。第1、2和3組間菌落數(shù)誤差率計(jì)算公式如下：

②第4組無(wú)菌生長(zhǎng)。

③試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)均應(yīng)符合以上要求。

1.2.5 抑菌環(huán)測(cè)定 采用平板擴(kuò)散法分別用移液加樣器取五個(gè)濃度梯度藥劑8ul加于7mm的圓形小濾紙片上，然后用滅菌鑷子將帶藥濾紙片（稱紙碟）放入皿內(nèi)接過(guò)0.2ml含菌量為7.43×108cfu/mL的培養(yǎng)基上，每皿放三片（竹醋液、漂白液、對(duì)照），重復(fù)三次，各紙碟間距離要適宜，放置時(shí)要平放，迅速、準(zhǔn)確，放下后就不能再移動(dòng)，每放一片要立即蓋上皿蓋防污染，經(jīng)過(guò)37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h培養(yǎng)后，測(cè)定抑菌圈直徑，正確測(cè)量各菌抑菌圈直徑，精確到0.5mm。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 采用試管二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度。取竹醋液5mL，加入裝有5mL液體培養(yǎng)基的試管中，搖勻后取5mL置于另一支裝有5mL液體培養(yǎng)基的試管中，稀釋為含有不同濃度竹醋液5mL混合液，依次類推，最后一管棄去5mL的混合液，并設(shè)對(duì)照組（一管為生長(zhǎng)對(duì)照管，一管為空白對(duì)照管，均不含竹醋液或者漂白液），取菌懸液含菌量為7.43×108cfu/mL0.1mL接種于各試管中和生長(zhǎng)對(duì)照管中，充分搖勻，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h。觀察試管澄清度，若液體培養(yǎng)基混濁，表示細(xì)菌生長(zhǎng)，若液體培養(yǎng)基完全清亮，表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度為最小抑菌濃度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，從最小抑菌濃度檢測(cè)結(jié)果的澄清液體培養(yǎng)基中取出0.1mL，涂布平板，細(xì)菌置37℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)。無(wú)菌落生長(zhǎng)的最小濃度為最小殺菌濃度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 殺菌率的測(cè)定 根據(jù)MBC的結(jié)果，每種消毒液作3個(gè)濃度梯度的配比液。取4.5mL竹醋液，加入裝有4.5mL標(biāo)準(zhǔn)硬水的試管中。搖勻后再吸取4.5ml混合液，加入另一支裝有4.5mL標(biāo)準(zhǔn)硬水的試管中，如此類推，直至最后一管。最后一管搖勻后再吸4.5mL混合液，棄去，作竹醋液稀釋液（竹醋液加標(biāo)準(zhǔn)硬水）。挑選MBC濃度及臨近的3支竹醋液與硬水的配比液，加入0.5mL含菌量為7.43×105cfu/mL菌懸液，混合搖勻并開(kāi)始計(jì)時(shí)。分別于2分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘時(shí)各吸取0.5mL混合液移入相應(yīng)的

裝有4.5mL中和劑的試管中混勻。中和10分鐘后吸取0.2mL移入平皿，加入TSA，搖勻，待TSA凝固后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。用TPS稀釋液做對(duì)照組。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 符合稀釋后菌數(shù)計(jì)數(shù)在15-300的都只是稀釋到108時(shí)才符合，通過(guò)計(jì)算可以得到三組數(shù)據(jù)的誤差率為9.86%，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為7.43×109，見(jiàn)表1。

表1 大腸桿菌菌落計(jì)數(shù)（cfu/ml）

2.2 中和劑鑒定結(jié)果 漂白液第1、2、3和4組菌落計(jì)數(shù)為171、165、162和0；竹醋液第1、2、3和4組菌落計(jì)數(shù)為171、170、162和0。

根據(jù)上述的計(jì)算公式，可知分別用漂白液、竹醋液作為消毒劑時(shí)，計(jì)算出本次中和劑實(shí)驗(yàn)鑒定的組間菌落數(shù)誤差率分別為2.00%和2.38%。結(jié)果均符合中和劑鑒定的要求，因此判定該中和劑合格。

2.3 抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 相同稀釋倍數(shù)的情況下漂白液的抑菌圈大于竹醋液的抑菌圈，而漂白液和竹醋液的混合液抑菌圈明顯大于前面兩個(gè)消毒劑。此外，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到1∶8時(shí)，隨著稀釋倍數(shù)的增加，竹醋液的抑菌圈大小改變不明顯。見(jiàn)表2。

表2 消毒劑的抑菌圈（單位為cm）

2.4 MIC測(cè)定結(jié)果 竹醋液與漂白液最低抑菌稀釋度都是1∶64，即竹醋液含量為1.5625%，漂白液的濃度為625mg/L，MIC由大到小分別為漂白液、竹醋液以及漂白液與竹醋液混合液。見(jiàn)表3。

表3 最小抑菌濃度結(jié)果

2.5 MBC測(cè)定結(jié)果 竹醋液的MBC為二倍稀釋到1∶16即竹醋液含量為6.25%，而漂白液是到1∶64即濃度為625mg/L，漂白液的最小殺菌濃度比竹醋液要小，而漂白液與竹醋液混合液的最小殺菌濃度比前兩者都要小。見(jiàn)表4。

表4 最小殺菌濃度結(jié)果

2.6 殺菌率測(cè)定結(jié)果 同等稀釋倍數(shù)的情況下，漂白液的殺菌能力要比竹醋液強(qiáng)，而漂白液與竹醋液混合液的殺菌能力比前兩者均要強(qiáng)。見(jiàn)表5、表6。

表5 殺菌計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/ml）

表6 殺菌率計(jì)算結(jié)果[n(%)]

3 討論

竹醋液可以廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療保健、食品加工、處理污水等多個(gè)領(lǐng)域，但在抗菌消毒方面尚有待于開(kāi)發(fā)[9]。與之相比較的漂白液早已在多個(gè)領(lǐng)域的消毒中廣泛應(yīng)用，但含氯消毒劑理化性質(zhì)不穩(wěn)定，易受pH、有機(jī)質(zhì)和還原物質(zhì)的影響，受日光的照射易分解失效，難以貯存，而且對(duì)人體健康也會(huì)造成危害。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在相同稀釋倍數(shù)的情況下漂白液的抑菌圈均大于竹醋液的抑菌圈，當(dāng)竹醋液替代標(biāo)準(zhǔn)硬水為稀釋液時(shí)，此時(shí)抑菌圈明顯大于前面兩個(gè)消毒劑的抑菌圈。另外隨著稀釋倍數(shù)的增加，竹醋液抑菌圈大小的改變并不是特別明顯。在MIC的測(cè)定結(jié)果上竹醋液與漂白液之間的比較上并無(wú)明顯區(qū)別，最低殺菌稀釋率均為1∶64，即竹醋液含量為1.5625%，漂白液的濃度為625mg/L。而從MBC的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)和殺菌率的結(jié)果可以看出，漂白液均要優(yōu)于竹醋液，竹醋液和漂白液復(fù)配液的MBC和殺菌率又均高于漂白液和竹醋液。此次研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)的周建斌等[10]、李忠琴[11]、蔣新龍[12]研究結(jié)果一致，表明竹醋液有一定的抑菌殺菌作用。該實(shí)驗(yàn)中竹醋液與漂白液的混合比例，由于時(shí)間問(wèn)題并沒(méi)有廣泛開(kāi)展研究，而這些問(wèn)題都有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討，使得竹醋液更好地被利用。

漂白液和竹醋液都具有一定的抑菌殺菌作用[13-15]。竹醋液可以在抑菌方面替代或者部分替代漂白液使用，而且竹醋液與漂白液混合有比較明顯的增效作用，可以達(dá)到更好抑菌效果，加上竹醋液是一種天然綠色產(chǎn)品，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，這為以后減少漂白劑的使用以及其他有害環(huán)境的消毒劑使用提供了參考，為新型環(huán)保消毒劑的開(kāi)發(fā)利用提供了參考。