右美托咪定對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷程度、氧化應(yīng)激及TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的影響

王志濤，劉德君

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450014）

近年來，心血管疾病的發(fā)生率正逐年增加，而在心血管疾病患者在接受治療后心肌缺血再灌注（Myocardial ischemia-reperfusion，I/R）會(huì)造成心肌細(xì)胞的損傷，影響心功能，甚至加重病情，產(chǎn)生預(yù)后不良，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前I/R 造成損傷的機(jī)制還不明確，有研究報(bào)道[1]氧化應(yīng)激反應(yīng)可能參與了心肌損傷，心肌缺血后氧自由基清除能力降低，當(dāng)血液再灌注后，短時(shí)間內(nèi)大量的氧自由基，破壞細(xì)胞膜及線粒體功能。炎癥反應(yīng)[2]可能是另一個(gè)參與機(jī)制，氧自由基會(huì)引起白細(xì)胞表明特殊粘附因子的過表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附、聚集、浸潤(rùn)，形成微血栓，激活自身免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，造成心肌損傷。Toll 樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用[3]。右美托咪定（dexmedetomidine,Dex）是一類鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物，常用于臨床麻醉。有報(bào)道[4]Dex在多種手術(shù)使用后能夠調(diào)控機(jī)體炎癥因子表達(dá)，拮抗氧自由基過量生成，保護(hù)組織器官，而Dex在I/R 運(yùn)用較少。本研究通過Dex對(duì)大鼠I/R 后的心肌損傷、氧化應(yīng)激、TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的影響，為臨床預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性成年健康SD 大鼠36只，體重250±20g，由我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器 大鼠肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB isoenzyme，CK-MB)、大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac Troponin Ⅰ,cTn-Ⅰ)、大鼠N 端前腦鈉素（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NTproBNP）、大鼠乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司，Anti-TLR4、Anti-NF-kB p65 抗體購(gòu)于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，內(nèi)參抗體及二抗均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量檢測(cè)試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)伯騰儀器有限公司，電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)bio-rad 公司，小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸機(jī)，購(gòu)于上海嘉鵬有限公司，可見分光光度計(jì)購(gòu)于上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 動(dòng)物分組及造模 將所有大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3 組，每組12 只。實(shí)驗(yàn)組大鼠通過微量注射泵靜脈泵注5μg/kgDex 預(yù)處理，損傷組和對(duì)照組泵注同等劑量0.9%氯化鈉溶液預(yù)處理，1h 后進(jìn)行造模，其中對(duì)照組只穿線不結(jié)扎。建立大鼠I/R 模型[5]：將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，以烏拉坦1g/kg 腹腔注射對(duì)大鼠麻醉，切開氣管連接呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，沿著胸骨左緣切開第3～4 肋，行胸廓切開術(shù)以暴露心臟，對(duì)大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎，30min 后松開結(jié)扎線，血流再灌注120min。以心電圖顯示ST段下降50%以上或高聳的T段得到恢復(fù)為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后采集大鼠全身血，3000r/min 離心10min，取上清保存。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)各組大鼠血清中CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH 等心肌損傷標(biāo)志物表達(dá)水平。上述操作嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書操作。

1.4.2 氧化應(yīng)激檢測(cè) 取各組大鼠的心肌組織，超聲粉碎，1000r/min 離心取上清液，采用可見分光光度法檢測(cè)各組SOD 活性及GSH、MDA 含量。上述操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.4.3 TLR4/NF-κB 檢測(cè) 取各組大鼠的心肌組織，采用Western blot 法檢測(cè)TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量，具體如下[6]：⑴提取蛋白。使用裂解液充分裂解心肌組織，16000×g 離心提取蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，后水浴鍋煮，100℃，5min；⑵電泳。配置13%的濃縮膠，加入電泳緩沖液，將樣本及蛋白Marker 加入凝膠孔中，80V 下電泳50min，待蛋白Marker 到達(dá)分離膠改用120V 電泳2h。⑶轉(zhuǎn)膜。取下分離膠，按照2 層海綿、2 張濾紙、分離膠、PVDF 膜、2 張濾紙、2 層海綿順序組裝濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，低溫100 V 濕轉(zhuǎn)60min；⑷封閉。取出PVDF 膜浸泡在5%的脫脂牛奶中封閉，置于搖床室溫封閉2h。⑸洗膜：參照蛋白Marker 剪下目的條帶，TBST 洗膜3 次。⑹抗體孵育。先后加入一抗和二抗進(jìn)行孵育，4℃搖床過夜。⑺顯色。PCDF膜經(jīng)ECL 發(fā)光液處理，暗室曝光、顯影、定影、凝膠成像儀分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)本次研究所得數(shù)據(jù)均采取SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件展開分析。計(jì)量資料的表達(dá)形式為（），行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH等心肌損傷指標(biāo)比較 見表1。

表1 三組血清CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH 等心肌損傷指標(biāo)比較

2.2 三組心肌組織SOD、GSH、MDA 等氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表2。

表2 三組心肌組織SOD、GSH、MDA 等氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.3 三組心肌組織TLR4、NF-κB表達(dá)水平比較實(shí)驗(yàn)組TLR4的表達(dá)量為0.81±0.09，損傷組TLR4的表達(dá)量為1.57±0.15，對(duì)照組的TLR4表達(dá)量為0.18±0.03，實(shí)驗(yàn)組和損傷組的TLR4表達(dá)量與對(duì)照組相比，明顯較多（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組的TLR4表達(dá)量與損傷組相比，明顯較少（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組NFκB的表達(dá)量為0.56±0.06，損傷組NF-κB的表達(dá)量為1.21±0.11，對(duì)照組的NF-κB表達(dá)量為0.25±0.05，實(shí)驗(yàn)組和損傷組的NF-κB表達(dá)量與對(duì)照組相比，明顯較多（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組的NF-κB表達(dá)量與損傷組相比，明顯較少（P<0.05）。見圖1。

圖1 三組TLR4、NF-κB水平比較

3 討論

心血管疾病會(huì)引發(fā)心臟血流灌注減少，心臟供氧不足，導(dǎo)致心肌缺血缺氧，心肌細(xì)胞代謝異常，心功能衰弱，心臟無法正常工作，威脅患者的生命健康。治療心肌缺血的治療方法是血流再灌注，可恢復(fù)心臟供氧供血，但是據(jù)研究報(bào)道[7]缺血再灌注后患者會(huì)出現(xiàn)心律失常、心肌梗死面積擴(kuò)大、心功能低下等更嚴(yán)重的損傷，甚至死亡，是心血管疾病臨床治療中的障礙。目前對(duì)抗I/R的主要方法有使用缺血預(yù)適應(yīng)藥物、抗氧自由基藥物、抑制鈣超載類藥物、VEC 保護(hù)劑、抗氧化劑、傳統(tǒng)中藥等，有報(bào)道Dex 是一類新型的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[8]。

CK-MB 一類主要存在于心肌組織中的肌酸激酶亞型，能催化肌酸和ATP 生成磷酸肌酸和ADP，CK-MB 急性心肌梗死時(shí)3～4h 開始升高，12～28h達(dá)到高峰，可高度提示心肌損傷[9]。NT-proBNP 是BNP 激素原分裂后沒有活性的N 末端片段，主要由心室肌細(xì)胞分泌，其在人體中水平較BNP 穩(wěn)定，其升高主要與內(nèi)毒素及炎癥因子、心肌抑制因子及循環(huán)血容量有關(guān)，可反映心肌功能障礙，是臨床檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物之一[10]。cTn-Ⅰ是一類調(diào)節(jié)鈣介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互反應(yīng)的蛋白，主要分布在心肌中，急性心肌梗死發(fā)病后3～6 h 開始升高，14～20 h 達(dá)高峰，是心肌損傷高度特異度的診斷標(biāo)志物之一[11]。LDH 一類NAD 依賴性激酶，有多種亞型，廣泛存在于腎臟、心肌、骨骼肌中，心肌梗死后6～9 h 開始上升，36～60 h 達(dá)到高峰，因此可作為急性心肌梗死后期的輔助診斷指標(biāo)[12]。研究結(jié)果顯示 損傷組I/R 后，CK-MB、cTn-Ⅰ、NTproBNP、LDH水平均顯著升高，而使用Dex的實(shí)驗(yàn)組CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH水平均明顯降低，說明I/R對(duì)心肌組織造成了明顯損傷，而Dex 有助于預(yù)防心肌損傷，保護(hù)心肌組織。

心肌缺氧時(shí)可生成大量氧自由基，氧自由基能和細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸使膜脂質(zhì)產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷，并形成脂質(zhì)過氧化物，破壞細(xì)胞膜、線粒體膜、溶酶體膜完整性，使胞膜的流動(dòng)性、通透性增高[13]。SOD 能通過歧化反應(yīng)催化超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫，是動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)重要的抗氧化劑，起到抗衰老、抑制心腦血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、慢性病、抗疲勞等作用，當(dāng)機(jī)體存在過量氧化物時(shí)，SOD 被大量釋放和激活，消除氧化物，可作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)之一[14]。GSH 是三肽活性物質(zhì)，分布于人體各個(gè)器官組織中，是細(xì)胞內(nèi)重要的還原劑，防止由活性氧物質(zhì)和重金屬對(duì)重要細(xì)胞組分造成損害，能與其結(jié)合生成谷胱甘肽二硫化物，通過谷胱甘肽還原酶還原為GSH，調(diào)節(jié)維持體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，參與多種細(xì)胞增殖、分化及凋亡等生命活動(dòng)的調(diào)控。當(dāng)機(jī)體存在大量的氧自由基使，GSH 被大量消耗，含量降低[15]。MDA 是機(jī)體氧自由基的主要代謝產(chǎn)物，其含量直接反映了組織細(xì)胞的過氧化速率和強(qiáng)度，是氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷的重要標(biāo)志物[16]。本研究結(jié)果顯示，大鼠I/R 后心肌細(xì)胞中的SOD活性增強(qiáng)，GSH 含量降低，MDA 含量上升，而使用Dex的實(shí)驗(yàn)組SOD 活性顯著降低，GSH 含量顯著升高，MDA 含量顯著降低，說明I/R 能夠造成大量氧自由基，使心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，而Dex 能夠緩解心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激，保護(hù)心肌細(xì)胞避免其的受到損傷。

在I/R 過程中，缺血的心肌細(xì)胞釋放大量損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular pattems，DAMPs），參與免疫應(yīng)答，TLR4 被激活，經(jīng)過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活NF-κB 信號(hào)，促進(jìn)下游炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)，造成心肌組織損傷[17,18]。本研究結(jié)果顯示研究結(jié)果顯示損傷組I/R 后，TLR4、NF-κB水平均顯著升高，而使用Dex的實(shí)驗(yàn)組TLR4、NF-κB水平均明顯降低，說明Dex 是TLR4/NF-κB通路的負(fù)調(diào)控因子，有助于緩解I/R造成的炎癥反應(yīng)，降低心肌組織的損傷。

綜上所述，Dex 能夠有效的減少I/R對(duì)心肌的損傷，降低TLR4、NF-κB的表達(dá)，負(fù)調(diào)控其信號(hào)通路，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，有助于心肌功能恢復(fù)，保護(hù)心肌。Dex的合理劑量是接下來需要研究的重點(diǎn)，低劑量可能達(dá)不到效果，高劑量可能會(huì)引起不良反應(yīng)發(fā)生。