Pooling PCR 技術常規(guī)用于HIV 感染狀態(tài)診斷的可行性研究

唐翼龍，易志強，劉麗萍，張娜，靳廷麗，丁晨，胡強

（江西省疾病預防控制中心，江西 南昌 330029）

在目前的艾滋病防制工作中，Western Blot 法（免疫印跡檢測法）已成為一種廣泛應用的、用于診斷HIV 病毒感染狀態(tài)的方法。其檢測程序為：抗體初篩、抗體復檢、免疫印跡檢測[1]。其中，篩查抗體的方法有酶聯(lián)免疫法，化學發(fā)光法等；抗體確證的方法有普通免疫印跡法（WB）、條帶/線性免疫印跡法(RIBA/LIBA)。這些經(jīng)典的HIV 抗體檢測方法為我國的艾滋病防制做出了重要貢獻，但檢測抗體的方法有其局限性[2]：對于早期HIV 感染病例，因為抗體還沒有產(chǎn)生，使用此類方法去篩查血液樣本，有漏檢的風險[3]；在艾滋病病程晚期,因病人的免疫系統(tǒng)崩潰，抗體產(chǎn)量不夠或者抗體親和力不佳[4,5]，使用Western Blot 法檢測病人的樣本，會得出“HIV 抗體不確定”的結(jié)果，且隨訪觀察病人血清也不再陽轉(zhuǎn)，這會貽誤病人的抗病毒治療；另外，對于孕產(chǎn)婦，常有干擾抗體導致Western Blot法檢測不確定的情況，這種情況下，做不做母嬰阻斷成了難題。本項目研究Pooling PCR 法的比較優(yōu)勢，以及在醫(yī)療衛(wèi)生機構的臨床應用中在特定條件下常規(guī)替代Western Blot 法的可行性，現(xiàn)將研究情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 對象與材料在南昌市轄區(qū)內(nèi)選定某省級綜合性醫(yī)療機構，自2015年1 月至2018年12 月，在病人HIV 抗體篩查有反應時，立即采集血漿樣本（全血樣本經(jīng)EDTA 抗凝劑處理）送檢。

1.2 儀器與試劑 羅氏公司的cobas AmpliPrep/TaqMan 全自動核酸檢測系統(tǒng),及配套的試劑cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test,v2.0；MP公司的蛋白免疫印跡儀，及配套的HIV BLOT 2.0試劑。

1.3 方法 該醫(yī)療機構將復檢有反應的、能采集到血漿的樣本（剔除已報告病例和未采集到血漿的病例）按檢測流程全部送達江西省疾病預防控制中心進行免疫印跡法(Western Blot，過夜孵育）檢測艾滋病病毒抗體，同時檢測病毒載量，并觀察低載量樣本稀釋后的核酸檢測情況。

2 結(jié)果

2.1 送檢樣本的免疫印跡檢測及載量檢測總體情況 2015年1 月-2018年12 月，剔除已報告病例和未采集到血漿的病例后，該醫(yī)療機構有165 份樣本經(jīng)抗體法（免疫印跡）確證陽性。這165 個病例的病毒載量檢測值中，最低值為3330copies/ml，最高值為15800000 copies/ml,中位數(shù)為151000 copies/ml，幾何均數(shù)為159969 copies/ml，見表1。

表1 165例HIV 感染者抗病毒治療前的樣本的病毒載量值分布情況

2.2 載量值較低的樣本稀釋后的檢測情況 從165例樣本中選取6 份載量值較低的樣本經(jīng)50 倍、100 倍稀釋后做病毒載量檢測，均能檢測出核酸陽性，見表2。

表2 低病毒載量值樣本經(jīng)稀釋處理后的核酸檢測情況

2.3 Pooling PCR 法與Western Blot 法的檢測效能比較 HIV 抗體陽性的樣本，其核酸檢測結(jié)果全部陽性；在高危人群中，能觀察到抗體陰性但核酸陽性即感染早期病例的存在[6]；在艾滋病晚期病例中,常有HIV 抗體不確定但高病毒載量病例的情況。見表3。

2.4 Pooling PCR 法的特異性問題 Pooling PCR 法本質(zhì)上就是一個檢測核酸的方法，只是涉及的樣本的集合（混合）和分拆；先檢測混合樣本，混合樣本中發(fā)現(xiàn)陽性樣本后再逐級分拆定位，最終識別出感染HIV 病毒的病例。在《全國艾滋病檢測技術規(guī)范（2015 版》中，已介紹了Pooling PCR 法在血液篩查及高危人群中的應用；在《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷（WS 293-2019)》的6.1.1 章節(jié)的“d”子項中已列明“有流行病學史或艾滋病相關臨床表現(xiàn)，兩次HIV 核酸檢測均為陽性”即可做出HIV 感染診斷。以上可見，Pooling PCR 法的特異性方面已不是問題。

2.5 Pooling PCR 法與Western Blot 法的檢測成本比較 如果某地區(qū)艾滋病病毒感染率為萬分之十，某醫(yī)療機構檢測10000 份血樣,以識別出其中全部HIV 感染者為最終目的，使用Western Blot 法的理論最大試劑總成本為56800 元，投下去5680 元可以識別出一個HIV 感染者；如使用Pooling PCR 法配套國產(chǎn)試劑檢測,用100 份樣本組成一個集合樣本，集合樣本中檢出核酸陽性后再逐級拆分，最終識別出HIV 核酸陽性的病人血樣，其最大核酸試劑總成本為51000 元，投下去5100 元可以識別出一個感染者[8],見表4。

3 討論

本研究165 個已感染HIV 但尚未開始抗病毒治療的病例中，載量最低值為3330copies/ml，最高值為15800000copies/ml。低于5000copies/ml 者有4例，占比為2.42%，按照現(xiàn)行HIV 感染者核酸法5000copies/ml 診斷標準[7]，這部分低病毒載量病例有漏診的風險。其實現(xiàn)今的核酸檢測多為閉蓋式的，實驗室PCR 擴增產(chǎn)物污染的風險已經(jīng)得到控制，是否可以下調(diào)HIV 感染核酸診斷的載量閾值，后續(xù)可以做擴大樣本的研究。6例低病毒載量樣本經(jīng)100 倍稀釋后仍然能夠被檢出，所以，一級集合大小設定為100 份樣本技術上是可行的。本研究表明，在一級集合大小為100 份樣本且人群HIV流行率不高于10‰0的情況下，以發(fā)現(xiàn)1 個HIV 感染者所需耗費的平均試劑成本計算，Pooling PCR法的成本略低于Western Blot 法。相對于酶聯(lián)法、化學發(fā)光法、免疫印跡法等檢測抗體的方法而言，檢測核酸的方法是更敏感的，它的窗口期僅為1周[7]，能發(fā)現(xiàn)早期HIV 感染者。自2015年開始，Pooling PCR 法已在獻血員的篩查中得到了全國性廣泛應用[9,10],發(fā)現(xiàn)了不少抗體窗口期病例，為降低輸血的殘余風險做出了很大貢獻。Pooling PCR 法的優(yōu)勢也在于：它能發(fā)現(xiàn)和確診晚期HIV 感染者，有利于艾滋病人盡早獲得治療。這種方法尤其適用于孕產(chǎn)婦樣本的檢測。對于孕產(chǎn)婦群體，常有干擾抗體導致免疫印跡試驗結(jié)果為不確定的情況，這增加了孕產(chǎn)婦的心理負擔。如果對所有HIV 抗體不確定的孕婦立即進行母嬰阻斷,可能會導致很多的孕婦接受不必要的抗HIV 病毒治療，對孕婦、胎兒產(chǎn)生一些不必要的毒副作用。本研究表明，使用Pooling PCR 法以100 份樣本做一個一級混合樣，其臨床應用時的診斷敏感性并不會低于檢測抗體的方法。另外，在當?shù)厝巳旱母腥韭蕿?0‰0以下時，以發(fā)現(xiàn)HIV 感染者數(shù)計算的人均試劑成本略低于Western Blot 法的成本。所以,使用Pooling PCR 法替代Western Blot 法，用于艾滋病病毒感染的診斷，在經(jīng)濟上是可行的，在實際工作中是必要的。綜上可見，在人群的HIV 感染率為10‰0以下時，在規(guī)模較大的醫(yī)療衛(wèi)生單位、獨立醫(yī)學實驗室、專業(yè)體檢公司，Pooling PCR 法可以替代Western Blot 法，其特別有利于艾滋病病毒感染早期、晚期病例的診斷以及排除抗體不確定孕產(chǎn)婦的HIV 感染。