卵巢組織中BMP15、GPR30的表達(dá)與PCOS卵泡發(fā)育障礙的關(guān)系

忽平

（南陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 南陽 473000）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科常見的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，生育期婦女PCOS 發(fā)病率達(dá)4%～18%，占無排卵性不孕癥的50%～70%。PCOS 可誘發(fā)多種生殖系統(tǒng)腫瘤、代謝綜合征、精神癥狀等不良遠(yuǎn)期并發(fā)癥，嚴(yán)重影響婦女的生活質(zhì)量[1-3]。故研究PCOS 卵泡發(fā)育障礙發(fā)病機(jī)制，為其治療提供思路是生殖領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。關(guān)于PCOS的發(fā)病機(jī)制研究目前尚未闡明。有報(bào)道指出[4]PCOS 發(fā)病原因主要與卵巢內(nèi)部自分泌和旁分泌因子水平紊亂有關(guān)。有研究報(bào)道[5]骨形成蛋白15（BMP15）在PCOS卵泡發(fā)育障礙患者血清中水平異常，BMP15 是轉(zhuǎn)化生長因子β 超家族中的一員，可促進(jìn)初級卵泡和原始卵泡的生長發(fā)育，并促進(jìn)原始卵泡向次級卵泡進(jìn)化。雌二醇（E2）及其受體可促進(jìn)卵泡體細(xì)胞的增殖分化，對卵泡功能的完整性起著重要作用。雌激素受體G蛋白偶聯(lián)受體（GPR30）是新型雌激素受體，已有研究證實(shí)[6,7]其在正常人的卵巢和卵泡中有顯著作用，但是否在PCOS 發(fā)病過程中起作用，相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究選取我院實(shí)施手術(shù)治療的41例PCOS患者卵巢組織（PCOS 組）、因良性腫瘤實(shí)施卵巢腫瘤切除術(shù)獲取的正常卵巢組織40例（對照組），對比分析兩組卵巢組織中的BMP15、GPR30表達(dá)差異，旨在確定上述指標(biāo)在PCOS 診斷中的價(jià)值。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2016年1 月-2018年1月實(shí)施手術(shù)治療的41例PCOS患者卵巢組織（PCOS 組）、因良性腫瘤實(shí)施卵巢腫瘤切除術(shù)獲取的正常卵巢組織40例為對照組。PCOS 組,年齡27～39 歲,平均30.6±2.0 歲。對照組,年齡26～40 歲，平均30.8±2.9 歲。兩組研究對象的年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 入選排除標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者表現(xiàn)為稀發(fā)排卵、無排卵，高雄激素血癥，超聲檢查發(fā)現(xiàn)卵巢呈多囊性改變；⑵對照組為的月經(jīng)周期規(guī)律，經(jīng)期3～5d；⑶對照組卵巢組織經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)未被腫瘤侵犯；⑷本研究符合《赫爾辛基宣言》相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理規(guī)定，對研究對象的各項(xiàng)資料保密。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴甲狀腺疾??；⑵先天性腎上腺皮質(zhì)增生；⑶庫欣綜合征；⑷免疫系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕性疾病。

1.3 免疫組化染色 采用免疫組化Elivision 二步法。100 ml／L 甲醛溶液固定卵巢組織將其連續(xù)切片厚度為5μm，脫蠟至水，0.01 mol／L 檸檬酸溶液(pH 6.0)高壓蒸汽3 min，修復(fù)抗原。分別將組織切片與GPR30 一抗(兔來源多克隆抗體，濃度1:200，Invitrogen 公司生產(chǎn))或BMPl5 一抗（兔來源單克隆抗體，濃度1：200，克隆號：JE51-47，Invitrogen 公司生產(chǎn)），4℃孵育過夜。PBs 洗滌3 遍，再與二抗(山羊抗兔IgG,濃度：1：2000，Invitrogen 公司生產(chǎn))室溫孵育30min。PBS 洗滌3 遍，DAB 顯色。實(shí)驗(yàn)均設(shè)立陰性對照和空白對照。染色后切片背景為紫藍(lán)色，陽性表達(dá)為黃色或棕褐色，每張切片均由2 名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生共同判斷。免疫組化結(jié)果判定：BMP15、GPR30 主要在卵母細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞膜中表達(dá)。BMP15蛋白、GPR30蛋白的陽性表達(dá)呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)，⑴根據(jù)著色強(qiáng)度：0 分為無色、1 分為淡黃色、2 分為棕黃色、3 分為褐色、黑色；⑵根據(jù)陽性細(xì)胞比例：陽性細(xì)胞數(shù)目所占比例≤10%為1 分、陽性細(xì)胞所占比例11%～50%為2 分、陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3 分、陽性細(xì)胞數(shù)所占比例>75%為4 分，兩種積分相乘總分<3 分為陰性、≧3 分為陽性。

1.4 一般指標(biāo)檢測 檢測兩組的體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、血清雌激素（E2）、促黃體生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）、睪酮（T）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。BMI、E2、LH、FSH、T、HOMA-IR 檢測：采用ELISA 法，所需試劑盒均購自羅氏公司，操作步驟嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究收集的所有數(shù)據(jù)均在SPSS21.0 中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)分別采用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 PCOS 組和對照組的BMI、生殖激素水平、HOMA-IR 比較 PCOS 組患者的BMI、血清E2、LH、T、HOMA-IR 測定值均高于對照組（P<0.05），PCOS 組的血清FSH 低于對照組（P<0.05）,見表1。

表1 PCOS 組和對照組的BMI、生殖激素水平、HOMA-IR 比較（）

表1 PCOS 組和對照組的BMI、生殖激素水平、HOMA-IR 比較（）

2.2 PCOS 組和對照組的原始卵泡中卵母細(xì)胞的BMP15蛋白、GPR30蛋白表達(dá)比較 PCOS 組的原始卵泡中卵母細(xì)胞的GPR30蛋白陽性率顯著高于對照組（P<0.05），BMP15蛋白陽性表達(dá)率低于對照組（P<0.05），見表2、圖1、圖2。

圖1 原始卵泡中卵母細(xì)胞的GPR30蛋白表達(dá)（如圖中箭頭所示細(xì)胞核中的GPR30蛋白著色顆粒），A 為對照組、B 為PCOS 組，400 倍。

圖2 原始卵泡中卵母細(xì)胞的BMP15蛋白表達(dá)（如圖中箭頭所示細(xì)胞核中的BMP15蛋白著色顆粒），A 為對照組、B 為PCOS 組，400 倍。

表2 原始卵泡中卵母細(xì)胞的BMP15蛋白、GPR30蛋白表達(dá)比較[n（%）]

2.3 PCOS 組和對照組的初級卵泡中卵母細(xì)胞的BMP15蛋白、GPR30蛋白表達(dá)比較 PCOS 組的初級卵泡中卵母細(xì)胞的GPR30蛋白陽性率顯著高于對照組（P<0.05）,BMP15蛋白陽性表達(dá)率低于對照組（P<0.05），見表3、圖3、圖4。

圖3 初級卵泡中卵母細(xì)胞的GPR30蛋白表達(dá)（圖中紅箭頭和黑色箭頭分別為細(xì)胞膜及細(xì)胞核中的GPR30蛋白著色顆粒），A 為對照組、B 為PCOS 組，400 倍。

圖4 初級卵泡中卵母細(xì)胞的BMP15蛋白表達(dá)（圖中紅箭頭和黑色箭頭分別為細(xì)胞膜及細(xì)胞核中的BMP15蛋白著色顆粒），A 為對照組、B 為PCOS 組，400 倍。

表3 初級卵泡中卵母細(xì)胞的BMP15蛋白、GPR30蛋白表達(dá)比較[n（%）]

3 討論

卵源性因子在卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟過程中起重要作用[8]其中包括BMP15蛋白，有研究報(bào)道[9]BMP15 可促進(jìn)原始卵泡和初級卵泡的形成，促進(jìn)原始卵泡向次級卵泡的生長轉(zhuǎn)化,還能促進(jìn)竇前卵泡向竇卵泡的轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)卵丘膨脹，在卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟過程中起著重要作用。還有研究通過對比分析經(jīng)過卵巢刺激的廢棄卵子復(fù)合物和正常卵巢顆粒細(xì)胞中BMP15水平發(fā)現(xiàn),顆粒細(xì)胞中與卵子中BMP15水平一致,說明其同時(shí)在促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和顆粒細(xì)胞增生過程中發(fā)揮作用。還有研究報(bào)道[10,11]BMP15 可直接調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增生、分化、代謝、黃素化和凋亡過程，上述一系列分泌信號可通過顆粒細(xì)胞的縫隙連接蛋白傳導(dǎo)至卵細(xì)胞，建立顆粒細(xì)胞和卵子間的交流，共同影響卵泡發(fā)育的整個(gè)過程。此外，有研究報(bào)道[12]BMP15 除了直接影響卵泡成熟和顆粒細(xì)胞增殖外，可通過調(diào)節(jié)黃體的生成和功能間接影響卵泡的發(fā)育和排卵過程。鑒于BMP15在卵泡發(fā)育過程中的多樣功能，推測BMP15 分泌異?？赡軈⑴cPCOS 卵巢功能障礙的發(fā)病過程。本研究結(jié)果顯示，PCOS 組較正常卵巢組，原始卵泡中卵母細(xì)胞和初級卵泡中卵母細(xì)胞分泌的BMP15蛋白陽性表達(dá)率顯著下降，這與既往研究報(bào)道一致[13]。說明，BMP15 可促進(jìn)初級卵泡和原始卵泡的成熟，對維持卵巢正常功能具有積極作用。

目前已有報(bào)道明確[14]甾體激素代謝異常是PC OS患者卵巢功能異常發(fā)病的主要因素，其中已證實(shí)，雄激素代謝異常在PCOS 發(fā)病機(jī)制的作用，關(guān)于雌激素代謝異常對PCOS患者卵巢功能影響的研究報(bào)道相對較少。有基礎(chǔ)研究報(bào)道[15]通過單獨(dú)使用戊酸雌二醇或聯(lián)合使用孕激素、雄激素、人絨毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin,HCG）及胰島素等均可建立PCOS 模型，但單獨(dú)使用戊酸雌二醇建立的PCOS 模型與人體PCOS 病理狀態(tài)更接近。另外有研究[16]通過使用抑制雌激素合成的藥物（如克羅米芬、他莫昔芬等）可誘導(dǎo)PCOS患者的卵泡繼續(xù)發(fā)育。以上研究報(bào)道均提示，雌激素過多可能是PCOS患者卵巢功能障礙的危險(xiǎn)因素，故研究雌激素及其受體在PCOS患者卵細(xì)胞中的表達(dá)水平有利于加深卵泡發(fā)育機(jī)制的研究。經(jīng)典的雌激素受體包括ERα和ERβ，定位于胞漿或胞核，通過調(diào)節(jié)不同基因發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)，GPR30 是一種與傳統(tǒng)雌激素受體ERα、ERβ 不同源的新型雌激素受體，通過傳統(tǒng)的基因型效應(yīng)和新型的非基因型效應(yīng)調(diào)控雌激素水平。后者發(fā)生效應(yīng)迅速，可在幾秒至幾分的短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)雌二醇與GPR30 結(jié)合，激活下游信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖或凋亡。有研究報(bào)道[17]斑馬魚中GPR30 可抑制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，抑制其成熟。目前已有研究發(fā)現(xiàn)GPR30在正常卵巢組織卵母細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中的表達(dá)但未有報(bào)道表明其在PCOS患者卵巢組織中的表達(dá)狀況。本研究結(jié)果顯示，PCOS患者卵巢組織初級卵泡和原始卵泡中GPR30 較正常卵巢組織顯著高表達(dá)，證明，GPR30 作為新型雌激素受體在雌激素信號傳導(dǎo)中的作用及參與PCOS 卵巢功能障礙過程的作用。此外，本研究結(jié)果顯示，PCOS患者BMI、HOMA-IR、LH、T水平顯著升高與既往利用胰島素或孕激素的方法建立PCOS 模型的原理一致。而FSH水平顯著降低，是卵泡發(fā)育障礙的主要原因，與既往研究報(bào)道一致[18]。

綜上所述，PCOS患者卵巢組織中BMP15表達(dá)下調(diào)、GPR30表達(dá)上調(diào)，可能參與卵泡發(fā)育過程有關(guān)。本研究創(chuàng)新處，確定雌激素受體信號通路、卵源性因子BMP15在PCOS 卵巢功能障礙發(fā)病機(jī)制中的作用，為其臨床治療提供思路。