非洲豬瘟病毒K145R 蛋白的原核表達及其單克隆抗體制備

耿笑林，孫杰，王彥偉，黃甜，劉鵬，曹紅梅，逄文強，郝麗影，鄧均華，黃玉欣，田克恭，

（1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000；3.洛陽普泰生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽 471000）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種豬、野豬等豬科動物的傳染病[1-2]，軟蜱是其傳播的重要媒介之一[3]。由于目前尚無疫苗可用，該病自2018 年8 月首次傳入我國以來[4-5]，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來沉重打擊。

ASFV 病毒粒子直徑約為200 nm，由幾個同心圓層組成，中心含有基因組的類核，由內(nèi)向外被核心殼層、內(nèi)囊膜、二十面體衣殼和外囊膜包圍[6]。根據(jù)毒株的不同，雙鏈DNA 基因組包含150～167 個開放閱讀框[7]。通過對整個病毒基因組的測序和遺傳分析，開放閱讀框的功能包括病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白和其他功能，涉及病毒毒力和/或宿主范圍、RNA 轉(zhuǎn)錄和修飾、核苷酸甲基化、DNA 復(fù)制、蛋白質(zhì)編碼基因的預(yù)測和/或鑒定[8-11]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多種不同的病毒編碼或病毒誘導(dǎo)的感染細胞蛋白，以及50多種ASFV 顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白[12-14]。然而，許多蛋白質(zhì)的功能和抗原特性仍然未知，嚴重阻礙了疫苗的開發(fā)。

在ASFV 感染的野豬肺細胞中，K145R 蛋白含量較高[15-16]；在2 個靈長類細胞系HEK-293 和Vero表達的ASFV 產(chǎn)物中，K145R 蛋白含量排在前5位[17]；對感染豬的轉(zhuǎn)錄組分析表明，K145R 在RNA水平上表達豐富[18]。以上結(jié)果表明，K145R 是一種重要的病毒蛋白，但目前對于K145R 蛋白的生物學(xué)功能完全未知。K145R 蛋白在哺乳動物細胞中大量表達，與病毒復(fù)制有關(guān)，針對K145R 蛋白的抗體可能有助于防止ASFV 感染。為了進一步了解K145R 蛋白的功能，通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)可溶性表達并純化K145R 蛋白，對目的蛋白的大小及免疫反應(yīng)性進行鑒定，制備單克隆抗體，并進行特異性、與病毒反應(yīng)性等鑒定，旨在為K145R 蛋白的功能研究及亞單位疫苗、診斷試劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 大腸桿菌DH5α 和BL21(DE3)感受態(tài)細胞、質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；pET28a載體由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存，引物及基因序列合成與測序，均由蘇州金唯智生物科技有限公司完 成；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)高保真DNA 聚合酶，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA 連接酶和限制性內(nèi)切酶均購自賽默飛世爾科技公司；HRP 標記的羊抗豬IgG、HRP 標記的羊抗鼠IgG、FITC 標記的羊抗鼠IgG、FITC標記的羊抗豬IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT，均購自Sigma 公司；ASFV 陽性血清、ASFV 抗原板，均購自歐洲非洲豬瘟參考實驗室[Centro de Investigacin en Sanidad Animal(CISA-INIA)，Madrid，Spain]；小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定用ELISA試劑盒，購自洛陽佰奧通實驗材料中心。

1.1.2 主要設(shè)備 IC222 EXCELLA 恒溫培養(yǎng)箱購自德國Medcenter Einrichtungen 公司，E24R 恒溫培養(yǎng)振蕩器購自NBS 公司，6132核酸蛋白測定儀購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白K145R的原核表達及鑒定

1.2.1.1 重組表達質(zhì)粒pET28a-K145R的構(gòu)建根據(jù)GenBank 公布的ASFV SY18 株K145R 基因序列（GenBank 登錄號：MH766894.1）設(shè)計PCR 引物，正向引物（K145R-F）序列：5′-GCCGGGCATATGTTCTCTAACAAAAAAT-3′（包含Nde Ⅰ酶切位點），反向引物（K145R-R）序列：5′-GGGCCGCTCGAGTTTAGAGC-3′（包含Xho Ⅰ酶切位點）。以合成的密碼子優(yōu)化后的K145R 基因序列為模板，使用引物組F/R 擴增目的基因片段，PCR 反應(yīng)程序為95 ℃變性20 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后，與pET28a載體一同由Nde Ⅰ和Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h，并進行純化回收，回收產(chǎn)物與載體由T4 DNA連接酶室溫連接1 h，然后轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞。挑取單菌落提取質(zhì)粒后進行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒即為pET28a-K145R。酶切驗證正確后，進行測序鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，即為K145R蛋白的表達菌株。

1.2.1.2 重組K145R 蛋白的表達和純化 將pET28a-K145R 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆至LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，取2 mL 培養(yǎng)過夜的菌種接種至含50 mg/L 卡那霉素的200 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.8～1.0 時，溫度降為28 ℃，并添加終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白表達，誘導(dǎo)時長為12 h（未誘導(dǎo)組不添加IPTG）。收集菌體沉淀，使用緩沖液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH 值7.0）按1∶40 的體積比進行重懸，超聲破碎，4 ℃、13 500 r/min條件下離心10 min，分離上清、沉淀（用原倍體積的上述緩沖液重懸），向搖瓶發(fā)酵所得菌體破碎上清加入0.01 mol/L 咪唑，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，采用Ni Sepharose 6 Fast Flow 蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)親和層析純化，收集洗脫產(chǎn)物，用SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)表達情況。

1.2.1.3 重組K145R 蛋白的Western blot 鑒定 重組K145R 蛋白純化后與誘導(dǎo)組分離上清一同進行Western blot 鑒定，使用空載體（不含目的基因片段）轉(zhuǎn)化BL21(DE3)的菌體破碎液作為陰性對照。Western blot 條件：電壓25 V，電流2.5 mA，轉(zhuǎn)膜時間10 min；分別以1 000 倍稀釋的ASFV 陽性血清和陰性血清作為一抗，以2 000 倍稀釋的HRP 標記的羊抗豬IgG作為二抗。

1.2.2 雜交瘤細胞株的建立 取4～6 周齡雌性BALB/c 小鼠，利用純化的重組K145R 蛋白對其進行免疫，首次免疫按照1∶1（V/V）和弗氏完全佐劑充分乳化，第2、3 次免疫按照1∶1（V/V）和弗氏不完全佐劑充分乳化，免疫量均為0.1 mg/只，經(jīng)背部皮下多點免疫，每14 d 免疫1 次，共免疫3 次。第3 次免疫后7 d 采集血清，利用K145R 蛋白建立的間接ELISA 方法檢測免疫后小鼠血清中的抗體水平，對抗體效價最高的小鼠在細胞融合前3 d 進行加強免疫（0.2 mg/只，不加佐劑）。取其脾細胞，用常規(guī)PEG 融合法與SP2/0 細胞按10∶1 比例進行融合，以重組K145R 蛋白建立的間接ELISA 方法檢測雜交瘤細胞上清，將陽性細胞孔連續(xù)進行亞克隆，直至克隆孔全部為陽性，擴大培養(yǎng)并凍存。

1.2.3 單克隆抗體腹水的制備 取8～10 周齡BALB/c 小鼠，每只腹腔注射0.5 mL 液體石蠟，于10 d后每只小鼠腹腔注射含量為30萬個/mL的雜交瘤細胞0.5 mL，待小鼠腹部明顯膨大后，抽取腹水，10 000 r/min離心10 min，收集上清，-70 ℃以下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 單克隆抗體的鑒定

1.2.4.1 單克隆抗體效價測定 將腹水系列稀釋后作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，用重組K145R 蛋白建立的間接ELISA 方法檢測，檢測結(jié)果為陽性的孔對應(yīng)的最高稀釋度為腹水的抗體效價。

1.2.4.2 單克隆抗體亞類檢測 按小鼠單克隆抗體Ig 類/亞類/亞型鑒定用ELISA 試劑盒說明書進行檢測。

1.2.4.3 單克隆抗體特異性檢測 純化的重組K145R 蛋白和空載體蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，在封閉液中封閉2 h，加入1∶100 稀釋的單克隆抗體，4 ℃過夜。再與HRP 標記的羊抗鼠IgG反應(yīng)，加入DAB顯色液后，觀察結(jié)果。

1.2.4.4 單克隆抗體與ASFV 反應(yīng)性 用商品化的ASFV抗原板，加入1∶100稀釋的單克隆抗體作為一抗，同時設(shè)置PBS 和ASFV 陽性血清分別作為陰、陽性對照，37 ℃反應(yīng)1 h，以FITC 標記的羊抗鼠IgG 或羊抗豬IgG 作為二抗，37 ℃反應(yīng)40 min，用PBS 洗滌后置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達質(zhì)粒pET28a-K145R的構(gòu)建

以合成的K145R 基因序列為模板，使用引物組K145R-F/R 對目的基因進行PCR 擴增，得到大小約450 bp的基因片段。使用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶同時對目的片段和pET28a載體進行雙酶切，酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ 感受態(tài)細胞。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，并用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶進行雙酶切鑒定，結(jié)果可得到pET28a 載體片段和目的基因K145R 片段（圖1）。將酶切驗證正確的重組表達載體pET28a-K145R進行測序，結(jié)果表明序列正確。

2.2 重組K145R蛋白的表達與純化

SDS-PAGE結(jié)果表明，與未誘導(dǎo)組相比，誘導(dǎo)組上清中有明顯的蛋白質(zhì)條帶，大小約為17 ku，與預(yù)測結(jié)果大小一致，而沉淀中較少，說明重組K145R蛋白以可溶性形式表達。純化后可得到較為單一的目的蛋白條帶，表明純化所得目的蛋白純度較高（圖2）。

2.3 重組K145R蛋白Western blot鑒定

從圖3 可以看出，誘導(dǎo)組菌體超聲上清及重組K145R 蛋白純化樣品均可鑒定出大小約為17 ku 的條帶?？梢?，重組K145R 蛋白可與ASFV 陽性血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)。

2.4 K145R蛋白單克隆抗體的制備

通過細胞融合、篩選及3 次亞克隆，獲得1 株能夠穩(wěn)定分泌抗K145R 蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為1D4。通過小鼠腹腔注射雜交瘤細胞株1D4，制備了小鼠腹水。

2.5 K145R蛋白單克隆抗體的鑒定

2.5.1 效價 利用重組K145R 蛋白建立間接ELISA 方法，測定制備的雜交瘤細胞株1D4 小鼠腹水的效價為1:5 120 000。

2.5.2 亞類 單克隆抗體1D4 的重鏈為IgG2a，輕鏈為κ。

2.5.3 特異性 從圖4 可以看出，單克隆抗體1D4與ASFV 重組K145R 蛋白呈現(xiàn)出特異性顯色反應(yīng)，而與空載體蛋白無顯色反應(yīng)，表明單克隆抗體1D4能特異性識別重組K145R蛋白。

2.5.4 與ASFV 反應(yīng)性 用ASFV 抗原板檢測單克隆抗體1D4，單克隆抗體1D4 有黃綠色熒光（圖5）。表明單克隆抗體1D4能與ASFV反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

表達ASFV 蛋白有助于ASFV 亞單位疫苗的研究及診斷試劑開發(fā)，其中對部分蛋白質(zhì)已進行表達和研究[19-21]，但有關(guān)K145R 蛋白研究較少。K145R蛋白在病毒復(fù)制周期的后期表達豐富，沒有被整合到ASFV 顆粒中，對ASFV 的體外繁殖不是必需的，但大量存在于細胞質(zhì)中，且均勻分布[22]，說明K145R蛋白可能在病毒的感染過程中具有重要的功能。

通過對經(jīng)典毒株BA71 和無致病性毒株BA71V的基因組序列對比分析發(fā)現(xiàn)，K145R 蛋白與多基因家族MGF505 同源性高[23]，可能與蛋白質(zhì)的免疫逃避系統(tǒng)有關(guān)。由于BA71V 缺失K145R 基因，K145R蛋白可能是ASFV 相關(guān)的毒力蛋白。此外，K145R蛋白也應(yīng)用于ASFV 的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和追蹤病毒傳播起源研究[24]。由于有關(guān)K145R 蛋白研究較少，潛在的功能未知，針對K145R 蛋白的外源表達和抗體制備，可為其功能研究和ASFV診斷奠定基礎(chǔ)。

本研究構(gòu)建了K145R 蛋白的重組表達載體pET28a-K145R，誘導(dǎo)表達結(jié)果顯示，表達的重組K145R 蛋白主要以可溶性形式存在，大小約為17 ku。Western blot 分析證實，重組K145R 蛋白具有良好的反應(yīng)原性。以純化的重組K145R 蛋白為免疫原，獲得單克隆抗體1D4，其ELISA效價可達1∶5 120 000，能特異性識別重組K145R 蛋白，且可與ASFV 反應(yīng)。本研究獲得的重組K145R 蛋白及其抗體可應(yīng)用于K145R 蛋白的功能研究，并有望用于ASFV亞單位疫苗的研究及診斷試劑開發(fā)。

綜上，本研究成功構(gòu)建了原核表達載體pET28a-K145R，并得到了約為17 ku 的可溶性重組K145R 蛋白，利用表達的重組蛋白制備了能特異性識別重組K145R 蛋白、且能與ASFV 反應(yīng)的單克隆抗體，為后續(xù)ASFV 蛋白功能研究及診斷試劑開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。