2 株偽狂犬病毒變異株全基因組測序及主要保護(hù)性抗原氨基酸變異分析

郭振華，邢廣旭，翁茂洋，金前躍，喬松林，張改平，2，3

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）也稱奧耶斯基氏?。ˋujeszky’s disease，AD），最早由匈牙利科學(xué)家奧耶斯基（Aujeszky）于1902年報道。其致病病原是偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV），也稱為豬皰疹病毒1 型（Suid herpesvirus 1，SuHV-1）和奧耶斯基病毒（AD virus，ADV）[1]。PRV 可以感染多種動物，如狗、貓、羊、牛、狐貍、貂和鼠等，致死率幾乎為100%[2]。豬是PRV 唯一的自然宿主，PRV 感染后可以在豬體內(nèi)建立起持續(xù)終身的潛伏感染。母豬感染后主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、返情和死胎等繁殖障礙癥狀；仔豬主要表現(xiàn)為流涎、口吐白沫、顫抖、角弓反張等神經(jīng)癥狀，死亡率很高[3]；保育豬通常以神經(jīng)癥狀為主，同時伴有一定的呼吸道癥狀，但死亡率大大降低；育肥豬則以呼吸道癥狀為主，偶見輕微的神經(jīng)癥狀[4]。

從20 世紀(jì)90 年代到2010 年，我國主要通過接種PRV 弱毒疫苗（如Bartha-K61 株和HB-98 株）防控該病，并取得了良好的效果。2011 年開始，許多接種疫苗的豬場相繼暴發(fā)了PR[5-6]。AN等[1]證實(shí)，該次疫情是由新出現(xiàn)的PRV 變異株引起的，且現(xiàn)有疫苗（Bartha-K61 株）針對變異株感染不能提供完全保護(hù)。隨后PRV 變異株在我國多個省份迅速傳播，GU等[7]于2013—2016年對山東省采集的5 033份血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，PRV gE 抗體陽性率為57.8%；解偉濤等[8]于2014—2016 年針對河南地區(qū)臨床樣本的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，PRV 野毒感染的豬場陽性率達(dá)到了90%左右，血清樣品的gE 抗體陽性率為46.2%。PRV 變異株的再度流行給我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來了新的挑戰(zhàn)。

gB、gC和gD 蛋白是PRV 主要的保護(hù)性抗原，與免疫保護(hù)緊密相關(guān)[9-12]，研究其變異特征對監(jiān)測我國PRV 毒株的遺傳變異情況具有重要意義。鑒于此，對本實(shí)驗(yàn)室分離的PRV 毒株HeNLH/2017 和HeNZM/2017 進(jìn)行全基因組序列的測定，并利用生物信息學(xué)方法分析其主要保護(hù)性抗原的遺傳變異情況，以豐富我國PRV 流行毒株的基因組數(shù)據(jù)，旨在為PR的流行與防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 毒株及細(xì)胞

HeNLH/2017 和HeNZM/2017 PRV 毒株由本 實(shí)驗(yàn)室從河南漯河地區(qū)和中牟地區(qū)臨床病料中分離獲得。病毒的擴(kuò)繁在PK-15細(xì)胞上進(jìn)行。

1.2 病毒培養(yǎng)與核酸提取

將HeNLH/2017 和HeNZM/2017 兩個PRV 毒株分別接種于PK-15 細(xì)胞，待病變率達(dá)到80%時，收集培養(yǎng)上清并保存；貼壁細(xì)胞用PBS洗1遍，然后按照基因組提取試劑盒操作說明提取細(xì)胞和病毒的總DNA。用NanoDrop One（ThermoFisher Scientific公司）儀器測定提取核酸的濃度。

1.3 病毒基因組測序

將提取的總DNA 送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行病毒基因組測序，采用Illumina NovaSeq 二代測序方法。序列的拼接和標(biāo)注參照HN1201毒株（GenBank No.KP722022）進(jìn)行。

1.4 基因組同源性分析

基因組同源性分析采用平均核苷酸相似性（Average nucleotide identity，ANI）（https://www.ezbiocloud.net/tools/orthoani）進(jìn)行。

1.5 進(jìn)化樹及主要抗原氨基酸變異分析

從GenBank 數(shù)據(jù)庫獲得參考毒株的序列（表1）。全基因組 序列的比對采用MAFFT（Multiple alignment using fast fourier transform）程序進(jìn)行；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建采用MEGA 6.0的鄰位法（Neighbor-joining tree with 1 000 bootstrap）進(jìn)行。利用DNAStar 軟件中的MegAlign（Clustal W method）程序進(jìn)行氨基酸序列的多重比對分析。

表1 毒株序列信息Tab.1 The strain sequence information in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV分離毒株基因組測序結(jié)果

按照基因組提取試劑盒（TaKaRa）操作說明提取細(xì)胞和PRV 的總DNA，采用Illumina NovaSeq二代測序方法（上海派森諾生物科技股份有限公司）完成了PRV 的全基因組序列測定，結(jié)果顯示，HeNLH/2017 和HeNZM/2017 PRV 分離株基因組全長約為143 kb，GC 含量約為73.8%（表2），基因組結(jié)構(gòu)與已報道的結(jié)果一致（圖1），包含1 個UL區(qū)（Unique long region）和1 個US 區(qū)（Unique short region），以及位于US 區(qū)兩側(cè)的內(nèi)部重復(fù)區(qū)（Internal repeat sequence，IR）和末端重 復(fù)區(qū)（Terminal repeat sequence，TR）。PRV 基因組共編碼70 個開放閱讀框（Open reading fram，ORF），其中，UL 區(qū)包含59 個基因，參與病毒DNA 復(fù)制以及病毒粒子的組裝和成熟；US 區(qū)7 個基因，主要與病毒的感染和毒力有關(guān)；IR 區(qū)和TR 區(qū)則各包含2 個基因US1 和ICP4/IE180。2 株P(guān)RV 分離株的全基因組序列已上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫（MT775883 和MW560175）。

表2 2株P(guān)RV分離株基因組序列分析Tab.2 Genome sequence analysis of two PRV isolates

2.2 PRV分離毒株基因組同源性分析

PRV 基因組核苷酸同源性分析顯示（圖2），HeNLH/2017 和HeNZM/2017 PRV 分離株間的基因組核苷酸同源性為99.59%。我國流行毒株與歐美代表性毒株Bartha 株的遺傳差異較大，為4.36%～4.72%；而我國流行毒株之間的同源性均較高，為98.31%～99.59%，其中2011 年以來流行的變異毒株與我國經(jīng)典毒株Ea 和Fa 的同源性為98.31%～98.90%，遺傳差異為1.10%～1.69%；變異毒株彼此之間的同源性為98.90%～99.59%，遺傳差異為0.41%～1.10%。

2.3 PRV分離毒株遺傳進(jìn)化分析

分別基于PRV 全基因組序列和gC 基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。從圖3 可以看出，PRV 毒株可以明顯分為2 個基因型，基因1 型（Genotype 1）主要包括歐美地區(qū)的流行毒株，如Bartha、Kaplan 和Becker 等；基因2 型（Genotype 2）主要包括我國流行的毒株，又進(jìn)一步分為基因2.1 亞型（Genotype 2.1）（以Ea 和Fa 株為代表）和基因2.2 亞型（Genotype 2.2）（以HeN1 和HN1201 株為代表）。本研究分離的HeNLH/2017 和HeNZM/2017 PRV 毒株均屬于基因2.2亞型。

2.4 PRV分離毒株主要保護(hù)性抗原氨基酸變異分析

通過氨基酸序列比對，分析了PRV 不同毒株gB、gC和gD蛋白的氨基酸變異情況。從圖4可以看出，與Bartha 株相比，2 株P(guān)RV 分離株以及我國其他PRV 流行毒株的gB 蛋白有36 個氨基酸的差異，包括75SPG77的缺失和94G 的插入，氨基酸差異達(dá)到3.93%；gC 蛋白有40 個氨基酸的差異，包括63AAASTPA69連續(xù)7個氨基酸的插入，氨基酸突變率達(dá)到了8.21%；gD 蛋白共有14 個氨基酸的差異，包括278S/RPRP281氨基酸的插入，氨基酸突變率約為3.47%。

與經(jīng)典毒株Ea和Fa相比，2株P(guān)RV分離株以及我國2011 年以來流行的其他PRV 變異毒株氨基酸序列均非常保守，gB 蛋白僅有5 個氨基酸的差異，分別是T85A、R454K、H563K、T740A、V898A；gC 蛋白有3個氨基酸的變異，分別是T34N、E99K、G194E；gD 蛋白有278S/RP279的缺失和V338A位點(diǎn)的變異。

3 結(jié)論與討論

PRV 基因組大小約140 kb，且具有高GC 含量（70%以上）和存在反復(fù)出現(xiàn)的重復(fù)序列等特征，這為PRV 全基因組序列的測定帶來了困難[13]。近年來，隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展成熟和成本的降低，能夠高效率地完成復(fù)雜基因組的測序工作。本研究利用Illumina NovaSeq 二代測序方法，成功獲得了2 株P(guān)RV 變異毒株的全基因組序列。核苷酸同源性分析顯示，HeNLH/2017 和HeNZM/2017 分離株與Bartha 株的核苷酸同源性為95.28%～95.37%；而與我國早期流行毒株Ea 和Fa 的同源性為98.70%～98.80%，與我國2011年以來新出現(xiàn)的變異毒株的同源性為98.90%～99.42%。說明分離毒株與變異毒株的核苷酸同源性更高。

根據(jù)地域分布和遺傳差異，PRV 可以分為基因1 型和基因2 型[13-14]?；? 型主要在歐美地區(qū)流行，并且大部分地區(qū)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了該病的凈化；而基因2 型則在亞洲主要是在中國流行，根據(jù)遺傳和致病性差異，又進(jìn)一步分為基因2.1 亞型和基因2.2 亞型[15]?；?.1亞型即通常說的經(jīng)典毒株，以我國早期分離株Ea 和Fa 為代表；基因2.2 亞型即通常所說的變異毒株，主要指2011 年以來引起我國PRV 再度流行的毒株。進(jìn)化樹分析顯示，本研究分離的2株P(guān)RV 與我國流行的變異毒株處于同一進(jìn)化分支，均屬于基因2.2 亞型。此外，也有多個研究報道了PRV 不同毒株之間的基因重組現(xiàn)象，其中具有代表性的是SC 株和HLJ-2013 株，通過全基因組序列的分析，發(fā)現(xiàn)它們在Bartha 毒株與我國本土流行毒株之間發(fā)生了基因序列重組[15-18]。進(jìn)化樹分析也與這一發(fā)現(xiàn)一致，當(dāng)以全基因組構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹時，SC株和HLJ-2013 株屬于基因2 型；而以gC基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，SC 株和HLJ-2013 株同屬于基因1型。

變異毒株的致病性顯著高于經(jīng)典毒株[19]，且接種Bartha-K61 和Bucharest 疫苗后針對該類毒株的中和抗體水平較低[1，12]；豬群接種Bartha-K61 疫苗后，可以針對我國早期流行毒株（Ea 和SC）提供良好的免疫保護(hù)，但對流行毒株（PRV-XT和JS-2012）僅能提供部分保護(hù)[12，20]。本研究采集病料的2 個豬場豬群均接種了Bartha-K61 疫苗，母豬每年接種4次，無明顯臨床癥狀；新生仔豬表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀、流涎等，多在48 h 內(nèi)死亡。因此，有必要加緊研發(fā)針對我國PRV 新流行變異毒株的疫苗，從而更好地開展防控凈化工作。

gB、gC和gD 蛋白是PRV 主要的保護(hù)性抗原，與不同流行毒株間的交叉保護(hù)和免疫逃逸緊密相關(guān)[9-12]。與Bartha疫苗毒株相比，我國PRV 流行毒株gB、gC 和gD 蛋白均廣泛發(fā)生了氨基酸變異[21-22]。其中，gB 蛋白還包括特征性的75SPG77位的缺失和94G位的插入，gC 蛋白包括63AAASTPA69連續(xù)7 個氨基酸的插入，gD 蛋白包括278S/RPRP281位氨基酸的插入。此外，gB蛋白主要有3個抗原表位區(qū)域，分別是59—126 aa、214—279 aa 和540—734 aa[23]，而gB 蛋白發(fā)生變異和插入的位置大部分位于59—126 aa和540—734 aa 抗原表位區(qū)，這在一定程度上解釋了Bartha 疫苗對我國流行毒株保護(hù)效果不佳的原因。另外，需要注意的是，與早期PRV 毒株相比，我國流行的PRV 變異毒株較為保守（gD 蛋白具有278S/RP279的缺失），僅發(fā)生了個別氨基酸的變異，且這些發(fā)生變異的氨基酸與Bartha 株中對應(yīng)的位點(diǎn)一致。在gB 蛋白發(fā)生變異的5 個氨基酸中，有4 個（T85A、H563K、T740A和V898A）與Bartha 株中一致；在gC 蛋白發(fā)生變異的3 個氨基酸中，有2個（T34N和E99K）與Bartha 株一致；gD 蛋白僅有的1 個氨基酸變異（V338A）也與Bartha 株一致。因此，變異毒株的免疫逃逸機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究測定分析了2 株P(guān)RV 的基因組遺傳特征，并進(jìn)一步分析了主要保護(hù)性抗原gB、gC 和gD 蛋白的氨基酸變異情況。我國流行毒株與歐美地區(qū)的毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，且主要保護(hù)性抗原均廣泛發(fā)生了基因突變，并包含特征性的氨基酸插入或缺失序列。我國2011 年以來流行的變異毒株與早期流行毒株之間雖然存在一定的遺傳差異，但整體同源性依然很高。