北五味子褐斑病內(nèi)生生防真菌篩選及防治效果研究

張譽(yù)薺，任躍英，文湘穗，王雨濛，方平，李寶全，冷世和

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.集安帝王谷北五味子種植專業(yè)合作社，吉林 通化 134200；3.白山市嘉和特產(chǎn)有限公司，吉林 白山 134300）

北五味子[Schisandra chinensis(Tuecz.) Baill.]為木蘭科多年生落葉木質(zhì)藤本植物，主產(chǎn)區(qū)為東北三省，是東北地區(qū)的道地藥材[1]，其干燥果實(shí)入藥，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效[2]。北五味子不僅是醫(yī)藥珍品，而且還可加工成保健類食品，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。北五味子植株的病害種類較多[3]，近年來隨著市場需求量的增大，其種植面積日益增加，病害問題也隨之增多，對(duì)北五味子的生產(chǎn)種植及產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。北五味子褐斑病為葉部病害，其病原菌為球狀莖點(diǎn)霉[Phoma glomerate（corad）Wollena ex Hoehapf][4]，葉片在發(fā)病初期表面出現(xiàn)黃褐色病斑，隨著發(fā)病時(shí)間的增加，病斑面積增大，最終導(dǎo)致葉色發(fā)黃，嚴(yán)重時(shí)植株死亡。目前，國內(nèi)外對(duì)于北五味子褐斑病的報(bào)道較少[5-7]，關(guān)于北五味子內(nèi)生真菌對(duì)褐斑病生防作用的研究未見報(bào)道。鑒于此，以北五味子褐斑病病原菌為供試菌株，北五味子根莖為試驗(yàn)材料，篩選出對(duì)其生防效果較好的內(nèi)生真菌，旨在對(duì)北五味子藥材種植及其褐斑病防治提供科學(xué)理論依據(jù)，也為進(jìn)一步研究北五味子內(nèi)生真菌生物學(xué)功能及藥用植物內(nèi)生真菌資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試植株材料及病原菌菌株：3 年生北五味子植株根莖材料采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥園內(nèi)；北五味子褐斑病病原菌Phoma glomerate（corad）Wollena ex Hoehapf 為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物育種實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（馬鈴 薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL）、查氏培養(yǎng)基[硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.1 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL]、馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL）。

試劑及儀器：Biofiux 真菌DNA 提取試劑盒，北京博邁斯生物科技有限公司；PCR 引物、dNTP、TaqDNA 酶，華大基因（武漢）有限公司。DY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；Geneamp 9700型PCR 儀，美國Applied Biosystems 公司；BIS-910 凝膠成像儀，北京東勝生物科技公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DM 1000 光學(xué)顯微鏡，德國Leica 公司；HC-2518R 高速冷凍離心機(jī)，杭州華創(chuàng)儀器有限公司；KYC-100B空氣恒溫振蕩器，上海新苗器械公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌形態(tài)學(xué)觀察 將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基及查氏培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后觀察其形態(tài)，并挑取部分菌絲于10 mL無菌水中，振蕩搖勻后吸取適量菌液滴加到載玻片上，于光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子及菌絲形態(tài)。

1.2.2 內(nèi)生真菌的分離及純化 采用組織分離法[8]，選取健康無病害的北五味子根莖材料，將其剪成5 cm 長度大小，按照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行表面消毒，將表面消毒結(jié)束的組織材料在無菌工作臺(tái)中剪成1～2 mm 的組織塊，將其接種于PDA 培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基接種3 個(gè)組織塊，設(shè)置3 組重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基中根莖組織塊邊緣長出菌苔后挑取菌絲進(jìn)行分離純化，3～4 次純化后可得到較純菌株；另外，設(shè)置對(duì)照組用以檢查組織表面消毒是否徹底，即將最后一次漂洗組織的無菌水均勻涂布于培養(yǎng)基上，觀察是否有菌落長出。

1.2.3 內(nèi)生生防真菌篩選 采用平板對(duì)峙法[10-12]對(duì)分離出的內(nèi)生真菌進(jìn)行生防效果篩選。在無菌工作臺(tái)中，用直徑7 mm 的打孔器將病原菌與內(nèi)生真菌制成菌餅，并接種至PDA 培養(yǎng)基中，兩菌餅間隔2 cm，每株內(nèi)生真菌設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，并設(shè)置1 組只接種病原菌的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后，用十字交叉法測量對(duì)照組病原菌的半徑（Rc）和被內(nèi)生真菌抑制生長的病原菌的趨勢(shì)半徑（Rp），計(jì)算拮抗率。

拮抗率=（Rc－Rp）/Rc×100%。

參照周春元等[13]的方法，將初篩生防效果較好（拮抗率60%以上）的內(nèi)生真菌菌株接種到300 mL PDB 培養(yǎng)基中，于25 ℃、120 r/min 條件下振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，7 d 后于4 ℃、12 000 r/min 條件下離心10 min取上清液，經(jīng)0.22 μm 無菌濾膜過濾后得到發(fā)酵液，將冷卻至45 ℃的PDA 培養(yǎng)基與發(fā)酵液以2∶1（V∶V）比例混合，配制成含有內(nèi)生生防真菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基，將病原菌接種于培養(yǎng)基中，并設(shè)置不含發(fā)酵液的培養(yǎng)基作為對(duì)照，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后，用十字交叉法測量含有發(fā)酵液的培養(yǎng)基（Rp）及對(duì)照培養(yǎng)基（Rc）中病原菌的菌落半徑大小，計(jì)算拮抗率。

1.2.4 內(nèi)生生防真菌對(duì)北五味子褐斑病的防治機(jī)制研究 細(xì)胞膜透性測定：用無菌蒸餾水將1.2.3篩選的生防效果最好的菌株發(fā)酵液配制成25、50、100、200、300 mL/L 的發(fā)酵液溶液，收集恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 的褐斑病菌菌絲并清洗干凈，分別精確稱取1 g 菌絲放入到不同含量發(fā)酵液溶液中，測定初始電導(dǎo)率（R1）后將發(fā)酵液溶液置于25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中120 r/min 培養(yǎng)30、60、90、120、150、180 min后測定電導(dǎo)率（R2），然后沸水浴15 min，冷卻后測定電導(dǎo)率（R3），計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。

相對(duì)電導(dǎo)率=（R2－R1）/（R3－R1）×100%[14]。

可溶性蛋白含量測定：分別將5、10、20、40、60 mL 發(fā)酵液加入至200 mL PDB 培養(yǎng)基中混勻，制成含發(fā)酵液25、50、100、200、300 mL/L 的培養(yǎng)基，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)褐斑病菌菌絲并收集。精確稱取1 g菌絲，加入石英砂及5 mL磷酸緩沖液，用液氮迅速研磨成漿，4 ℃、8 000 r/min離心10 min后取上清液1 mL，采用考馬斯亮藍(lán)常量法在595 nm 處進(jìn)行吸光度測定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的可溶性蛋白含量[14]。

可溶性蛋白含量=（C×V/a）/w。

式中，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)含量；V為提取液總體積；a為所取上清液體積；w為菌絲取樣量。

麥角甾醇含量測定：參照可溶性蛋白含量測定方法，配制不同含量WG9 發(fā)酵液的培養(yǎng)基，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)褐斑病菌菌絲3 d 并收集。稱取5 g 菌絲于玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，放入到80 ℃干燥箱中，將菌絲水分烘干達(dá)到恒質(zhì)量后將其研磨成粉末狀，精確稱取1 g干粉于錐形瓶中，按照1∶10（m∶V）的比例加入無水乙醇，將其充分混勻后，3 500 r/min 離心10 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾得濾液。在292 nm 波長處使用分光光度計(jì)測定濾液的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算麥角甾醇含量[15]。

幾丁質(zhì)含量測定：參照可溶性蛋白含量測定方法，配制不同含量WG9 發(fā)酵液的培養(yǎng)基，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)褐斑病菌菌絲1、2、3 d。收集培養(yǎng)的菌絲并冷凍干燥24 h后，加入2%NaOH溶液，90 ℃水浴2 h去除蛋白質(zhì)，3 500 r/min離心15 min后棄去液體，將剩下的固體物質(zhì)按順序用蒸餾水、乙醇和丙酮洗滌，洗滌后將用于洗滌的有機(jī)試劑揮發(fā)干，剩下的固體物質(zhì)即為幾丁質(zhì)，稱質(zhì)量并記錄[16]。

褐斑病病原菌的微觀形態(tài)變化：取可溶性蛋白含量測定試驗(yàn)中經(jīng)不同含量發(fā)酵液培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌絲，使用光學(xué)顯微鏡觀察微觀形態(tài)的變化。

1.2.5 內(nèi)生生防真菌防治效果測定 參照王壯[17]的方法進(jìn)行離體葉片預(yù)防及治療試驗(yàn)。預(yù)防試驗(yàn)：選取健康無病害的五味子離體葉片，用無菌脫脂棉吸適量水包裹在葉柄位置用以保濕，選取葉片表面對(duì)稱位置處用無菌牙簽扎4 個(gè)缺口，在缺口處滴加內(nèi)生生防真菌無菌發(fā)酵液50 μL，24 h 后用直徑7 mm的打孔器將病原菌制成菌餅并將菌餅扣置于缺口上，另外設(shè)置1 組由無菌蒸餾水代替內(nèi)生生防真菌無菌發(fā)酵液的對(duì)照，將葉片置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中，光照保濕培養(yǎng)3 d 后根據(jù)表1 評(píng)定病害等級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

表1 北五味子褐斑病病害等級(jí)Tab.1 Disease level of Schisandra chinensis brown spot

治療試驗(yàn)：選取健康無病害的五味子離體葉片，用無菌脫脂棉吸適量水包裹在葉柄位置用以保濕，選取葉片表面對(duì)稱位置處用無菌牙簽扎4 個(gè)缺口，用直徑7 mm 的打孔器將病原菌制成菌餅并將菌餅扣置于缺口上，24 h 后在缺口菌餅處滴加內(nèi)生生防真菌無菌發(fā)酵液50 μL，另外設(shè)置1組由無菌蒸餾水代替內(nèi)生生防真菌無菌發(fā)酵液的對(duì)照，將葉片置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中，光照保濕培養(yǎng)3 d 后根據(jù)表1評(píng)定病害等級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

病情指數(shù)=∑（病害等級(jí)×本級(jí)病害葉片數(shù)）/（病害最高等級(jí)數(shù)×調(diào)查總?cè)~片數(shù)）×100，

防治效果=（對(duì)照組葉片病情指數(shù)-處理組葉片病情指數(shù)）/對(duì)照組葉片病情指數(shù)×100%。

1.2.6 內(nèi)生生防真菌的鑒定 形態(tài)學(xué)觀察：將1.2.3篩選的生防效果最好的內(nèi)生真菌接種于PDA 培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，觀察菌落外觀特征，并挑取菌株制成裝片，利用光學(xué)顯微鏡觀察其菌絲顏色、菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)等微觀特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[18]對(duì)分離出的內(nèi)生真菌進(jìn)行初步鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：內(nèi)生生防真菌的DNA 提取參照試劑盒說明進(jìn)行，提取后進(jìn)行ITS 鑒定，引物序列分別為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴(kuò)增采用30 μL體系：1 μL 內(nèi)生菌DNA模板、17.8 μL ddH2O、3 μL Buffer、2 μL dNTP、3 μL Primer 1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、3 μL Primer 2（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、0.2 μLTaq酶。PCR 反應(yīng)過程：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復(fù)35 個(gè)循環(huán)后72 ℃反應(yīng)10 min。取3 μL 樣品上樣，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（150 V、100 mA、20 min），觀察電泳結(jié)果。PCR 產(chǎn)物及內(nèi)生生防真菌的ITS 序列由華大基因（武漢）有限公司進(jìn)行純化和測序。將測序結(jié)果登 錄NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.gov），進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，搜索相似性最高的序列，并利用MEGA 6.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定內(nèi)生生防真菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 北五味子褐斑病病原菌形態(tài)學(xué)觀察

如圖1A、C 所示，在PDA 培養(yǎng)基上，病原菌菌落呈現(xiàn)黑褐色，周圍有一圈白色菌絲，培養(yǎng)5 d 時(shí)其菌落直徑為63.6 mm；如圖1B、D 所示，在查氏培養(yǎng)基上，病原菌菌落外觀形態(tài)與PDA 培養(yǎng)基上的菌落差異明顯，呈現(xiàn)粉白色，培養(yǎng)5 d 時(shí)菌落直徑為58.2 mm，略小于PDA 培養(yǎng)基上的菌落。病原菌微觀形態(tài)如圖1E所示，其菌絲細(xì)長有分枝，尖端彎曲，分生孢子呈無色橢圓形狀，無隔膜，選取20 個(gè)測量其大小，平均值為3.92 μm×1.43 μm。

2.2 北五味子褐斑病內(nèi)生生防真菌的篩選

如表2所示，平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，從北五味子根莖中分離得到的16 株內(nèi)生真菌中，有7 株內(nèi)生真菌對(duì)褐斑病病原菌有較為明顯的抑菌作用，將其中1 株生防效果最好（拮抗率為64.73%）的內(nèi)生生防真菌（圖2A）標(biāo)記為WG9，病原菌與生防真菌WG9 中間有抑菌帶，與對(duì)照（圖2B）相比，其產(chǎn)孢量及菌落半徑減少。

表2 內(nèi)生真菌對(duì)五味子褐斑病病原菌拮抗率Tab.2 Antagonistic rate of endophytic fungus to brown spot pathogen

WG9 的發(fā)酵液生防試驗(yàn)如圖3 所示，北五味子褐斑病病原菌在含有WG9 發(fā)酵液的PDA 培養(yǎng)基上（圖3A）生長緩慢，菌落大小明顯小于在不含WG9 發(fā)酵液的PDA 培養(yǎng)基上生長的病原菌菌落（圖3B），測量菌落半徑并計(jì)算后，其拮抗率為48.21%。

2.3 內(nèi)生生防真菌WG9對(duì)北五味子褐斑病的殺菌機(jī)制

由圖4 可知，隨WG9 發(fā)酵液含量增大和培養(yǎng)時(shí)間增加，添加褐斑病病原菌的WG9發(fā)酵液溶液相對(duì)電導(dǎo)率呈升高趨勢(shì)。培養(yǎng)180 min 時(shí)，25、50、100、200、300 mL/L WG9 發(fā)酵液溶液的相對(duì)電導(dǎo)率均達(dá)到最大值，分別為16.51%、22.95%、26.67%、27.19%、29.90%、36.05%，說明WG9 發(fā)酵液可使褐斑病病原菌的細(xì)胞膜遭到破壞，胞內(nèi)物質(zhì)滲出量隨WG9 發(fā)酵液含量增大而增加，造成相對(duì)電導(dǎo)率上升。

可溶性蛋白是生物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)維持其體內(nèi)水分平衡具有重要意義，在外界環(huán)境脅迫下對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[19]。由表3 可知，隨WG9發(fā)酵液含量的增大，褐斑病病原菌的可溶性蛋白含量呈上升趨勢(shì)，說明病原菌在受到WG9發(fā)酵液的刺激下，合成大量可溶性蛋白抵御外界脅迫，且隨發(fā)酵液含量增大，其合成的可溶性蛋白含量增加。

表3 不同含量WG9發(fā)酵液溶液培養(yǎng)3 d后褐斑病病原菌可溶性蛋白含量Tab.3 Soluble protein content of brown spot pathogen after 3 d treatment with different concentration of WG9 fermentation broth

麥角甾醇又稱麥角固醇，是真菌微生物細(xì)胞膜的重要組成部分，對(duì)細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性、膜上酶活性及細(xì)胞活力等細(xì)胞生理功能具有重要作用[20]。由表4 可知，隨WG9 發(fā)酵液含量的增大，褐斑病病原菌的麥角甾醇含量呈減少趨勢(shì)，發(fā)酵液含量從0 mL/L 增大至300 mL/L，褐斑病病原菌麥角甾醇含量從8.356 mg/g 降至5.869 mg/g，表明WG9 發(fā)酵液可使褐斑病病原菌細(xì)胞膜麥角甾醇含量降低，從而致使其細(xì)胞膜生理功能受損。

表4 不同含量WG9發(fā)酵液溶液處理3 d后褐斑病病原菌麥角甾醇含量Tab.4 Ergosterol content of brown spot pathogen after 3 d treatment with different concentration of WG9 fermentation broth

幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞的重要組成部分，位于真菌細(xì)胞壁的內(nèi)層，對(duì)維持其基本結(jié)構(gòu)和生理功能起著非常重要作用，幾丁質(zhì)占真菌干質(zhì)量的比例很高，在某些菌株中可達(dá)45%[21-22]。由圖5 可知，隨WG9發(fā)酵液含量的增大，褐斑病病原菌的幾丁質(zhì)含量呈減少趨勢(shì)，并且培養(yǎng)時(shí)間越久，幾丁質(zhì)含量越低，當(dāng)發(fā)酵液含量為300 mL/L 時(shí)，培養(yǎng)1、2、3 d 的幾丁質(zhì)含量均降至最低值，分別從0.283 g/g降至0.250 g/g，0.269 g/g 降至0.246 g/g，0.264 g/g 降至0.238 g/g。表明WG9 發(fā)酵液可使褐斑病病原菌細(xì)胞膜的幾丁質(zhì)含量降低，推測發(fā)酵液中某些物質(zhì)可催化病原菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的水解，抑制真菌菌絲生長。

如圖6 所示，正常的病原菌（A）菌絲完整，細(xì)胞壁較厚，菌絲內(nèi)部無橫隔；用300 mL/L 發(fā)酵液溶液培養(yǎng)3 d 后的病原菌（B）菌絲內(nèi)部有橫隔出現(xiàn)，與正常病原菌菌絲相比，細(xì)胞壁變薄呈透明狀，且不光滑。

2.4 內(nèi)生生防真菌WG9的防治效果測定

內(nèi)生生防真菌WG9 對(duì)離體葉片北五味子褐斑病的預(yù)防試驗(yàn)如圖7 所示，經(jīng)過預(yù)防處理的葉片病斑面積明顯小于無菌水處理對(duì)照，其防治效果為63.28%；內(nèi)生生防真菌WG9 對(duì)離體葉片北五味子褐斑病的治療試驗(yàn)如圖8 所示，經(jīng)過治療處理的葉片病斑面積明顯也小于無菌水處理對(duì)照的葉片，其防治效果為55.49%。

2.5 內(nèi)生生防真菌WG9的鑒定

2.5.1 形態(tài)學(xué)觀察 分離出的優(yōu)良內(nèi)生生防真菌WG9 其外觀形態(tài)及微觀形態(tài)如圖9 所示，培養(yǎng)5 d后菌落為直徑50.2 mm 的橢圓形，呈粉紫色，菌落外圈有少量的白色菌絲，分生孢子較多，不易形成單菌落。在微觀形態(tài)下觀察，其菌絲無色，較細(xì)，菌絲 頂端有指狀分枝；孢子無色，較小，呈圓形。

2.5.2 分子生物學(xué)鑒定 通過對(duì)內(nèi)生生防真菌WG9 的ITS 序列分析，其序列長度為585 bp，在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，從中選擇了10 株ITS 相似度較高的菌株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生生防真菌WG9與 NCBI 登錄號(hào) MT 420635.1（Purpureocillium lilacinum）、MT 279298.1（Purpureocillium lilacinum）、KC 478538.1（Purpureocillium lilacinum）的序列相似性為99%，基于Neighbour-joining 算法（Bootstrap 值為500）構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖10所示，內(nèi)生生防真菌WG9 與NCBI 登錄號(hào)MT 420635.1、MT 279298.1、KC 478538.1 處于同一分支上，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，將其鑒定為淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）。

3 結(jié)論與討論

目前，國內(nèi)外對(duì)于北五味子病害的研究報(bào)道較少，北五味子褐斑病于2012年才第一次被報(bào)道[4]，與北五味子其他病害相比，屬于一種新發(fā)現(xiàn)的病害，故對(duì)于該病害沒有較為完整的研究。該病原菌喜光照，并且溫度較高時(shí)有利于其生長及產(chǎn)孢，病原菌孢子萌發(fā)的最低相對(duì)濕度為90%，在相對(duì)濕度為100%的條件下經(jīng)4 h 就可以萌發(fā)[5]，因此該病害在降雨量較大、光照充足的夏季發(fā)病較為嚴(yán)重。北五味子作為東北地區(qū)的道地藥材，給當(dāng)?shù)胤N植農(nóng)戶帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)收益，但隨著種植面積的增大，其病害問題也日趨加重，有關(guān)該病的流行規(guī)律和防治技術(shù)還需進(jìn)一步研究。

本研究從北五味子根莖中分離出的1株優(yōu)良生防真菌WG9為淡紫擬青霉，該菌種首次從北五味子植株中被分離出來[23-24]。淡紫擬青霉在防治植物線蟲方面有著不可取代的地位，SASSER[25]研究發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉可應(yīng)用在30 多種寄主植物上并且防治線蟲成功率達(dá)68.0%，同時(shí)淡紫擬青霉對(duì)玉米小斑病菌、小麥赤星病菌、棉花枯萎病菌、水稻惡苗病菌等植物病原菌也具有顯著的拮抗作用。GESELL等[26]在早期的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉菌可以高效轉(zhuǎn)化殺菌劑聯(lián)苯，并且可以與其他殺菌劑混合使用同時(shí)不影響自身效果。目前，國內(nèi)外對(duì)于淡紫擬青霉的研究主要集中于防治線蟲，對(duì)于其在植物病害方面的研究報(bào)道較少[27]，本研究發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉WG9對(duì)北五味子褐斑病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，在對(duì)WG9發(fā)酵液的抑菌機(jī)制研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該發(fā)酵液對(duì)病原菌的可溶性蛋白、麥角甾醇、幾丁質(zhì)含量及細(xì)胞膜透性都有一定的影響，并且通過顯微鏡觀察到經(jīng)過發(fā)酵液處理的菌絲形態(tài)發(fā)生了一定的變化。幾丁質(zhì)作為真菌細(xì)胞壁的重要組成部分，參與了其外骨架結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，在維持細(xì)胞形態(tài)及幫助細(xì)胞抵抗外界脅迫過程中發(fā)揮重要作用[28]，同時(shí)也在真菌生長發(fā)育、入侵新生態(tài)域、啟動(dòng)宿主免疫反應(yīng)中起重要作用[29]，故許多抗真菌藥物的開發(fā)都以幾丁質(zhì)作為理想靶標(biāo)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著WG9 發(fā)酵液含量的上升，病原菌菌絲的細(xì)胞膜透性和可溶性蛋白含量升高，麥角甾醇和幾丁質(zhì)含量降低，說明WG9發(fā)酵液對(duì)病原菌的細(xì)胞壁有一定的損傷作用，但發(fā)酵液損傷細(xì)胞壁的作用機(jī)制是否是通過抑制幾丁質(zhì)的合成來實(shí)現(xiàn)的，還有待深入研究。

長期使用傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥會(huì)使植物病原菌產(chǎn)生耐藥性，故可將WG9開發(fā)成防治植物病原菌的生防制劑，而且淡紫擬青霉的生長對(duì)于營養(yǎng)條件要求很低，在農(nóng)副產(chǎn)品的廢料、廢渣中都能夠生長[31]，所以其制劑成本很低，可工業(yè)化量產(chǎn)，但是植株類型、土壤理化性質(zhì)以及土壤微生態(tài)等外界因素會(huì)使其生防效果受到影響，故后期還應(yīng)對(duì)其生防效應(yīng)進(jìn)行大田試驗(yàn)研究。