豬氨基肽酶N 作為受體介導(dǎo)豬冠狀病毒感染的研究進(jìn)展

韋欣欣，李澤輝，靳曉慧，魏戰(zhàn)勇

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046）

冠狀病毒（Coronavius，CoV）屬于套式病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、正冠狀病毒亞 科（Orthocoronavirinae）、冠狀病毒屬（Coronavirus），為有囊膜的單股正鏈RNA 病毒。冠狀病毒顆粒呈橢圓形、球形或輕度多形性，直徑為60～200 nm，可在電鏡下觀察到棒狀突起，形狀與王冠相似[1]。冠狀病毒根據(jù)其基因組差異分為α、β、γ 和δ 等4 個(gè)屬，有著嚴(yán)格的宿主特異性，是感染各種動(dòng)物和人類的重要傳染病原，主要癥狀是引起感染的宿主呼吸道和胃腸道發(fā)生病變，少部分冠狀病毒感染后還有可能會(huì)導(dǎo)致宿主肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)病變[2]。冠狀病毒最早是從雞的身上分離出來(lái)，以雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）為代表，到1965 年分離出第1 株人冠狀病毒后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)7種可以感染人類的冠狀病毒，其中3種為可引起人高致病性呼吸道感染的冠狀病毒，分別為2003年廣東省境內(nèi)暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（Severe acute respiratory syndrome，SARS）、2012 年沙特阿拉伯暴發(fā)的中東呼吸綜合征（Middle east respiratory syndrome，MERS）以及2019年湖北武漢暴發(fā)的2019 新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎疫情（Coronavirus disease 2019，CoVID-19），對(duì)人類的生命健康造成了極其嚴(yán)重的威脅。這些急性致病性病原（SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2）的高致死率，再次引起了全世界對(duì)于冠狀病毒的廣泛關(guān)注，使科學(xué)家進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到研究冠狀病毒的重要性[3-4]。

除了感染人外，近年來(lái)冠狀病毒在豬群中的感染流行也頻發(fā)，如豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）[5]、豬呼吸道冠狀病毒（Porcine respiratory coronavirus，PRCV）、2010 年由變異的強(qiáng)毒株引起的豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）[6-10]、2014 年新發(fā)的 豬 δ 冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）、2017 年新發(fā)的豬腸道α冠狀病毒（Swine enteric alphacoronavirus，SeACoV），這些豬腸道冠狀病毒病的暴發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，每年因豬冠狀病毒性腹瀉病造成的養(yǎng)豬業(yè)損失高達(dá)300億元[11]。

綜述了豬氨基肽酶N（Porcine aminopeptidase N，pAPN）受體與不同豬冠狀病毒受體結(jié)合域（RBD）結(jié)合機(jī)制方面的研究進(jìn)展，分析不同豬冠狀病毒在侵染宿主時(shí)與受體結(jié)合方式的異同，并對(duì)pAPN 受體抑制劑的相關(guān)研究進(jìn)行探討，為研究豬冠狀病毒（SeCoVs）感染機(jī)制提供參考。

1 冠狀病毒受體

絕大多數(shù)冠狀病毒感染宿主的首個(gè)重要步驟是識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體從而啟動(dòng)入侵，通過(guò)宿主細(xì)胞的內(nèi)吞作用等使病毒的基因組釋放進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行復(fù)制和增殖[12]。冠狀病毒表面存在一種向外突出的纖突（Spike，S）蛋白，對(duì)于冠狀病毒顆粒與其宿主細(xì)胞內(nèi)受體的結(jié)合和膜融合等過(guò)程有著重要的功能[13]。S 蛋白是Ⅰ型跨膜融合蛋白，分子質(zhì)量較大，在病毒顆粒包裝過(guò)程中會(huì)被蛋白水解酶切割為S1 和S2 兩個(gè)亞單位。S1 包含有RBD，主要是負(fù)責(zé)病毒-宿主細(xì)胞間的識(shí)別和結(jié)合，S2 包含有融合肽（Fusion peptide，F(xiàn)P），主要在病毒-宿主細(xì)胞的膜融合過(guò)程中發(fā)揮功能[14]。冠狀病毒S蛋白可直接影響病毒的毒力，所識(shí)別的受體種類及其在機(jī)體內(nèi)的分布情況等也是確定冠狀病毒宿主特異性和組織嗜性的關(guān)鍵因素之一[15]。

目前，已發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒受體主要有4種，分別是氨基肽酶N（Aminopeptidase N，APN）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1（Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1）、二肽基肽酶-4（Dipeptidyl peptidas-4，DPP4）。其中，APN 屬Ⅱ型糖蛋白，是一種鋅金屬蛋白酶，主要是Ⅰ型冠狀病毒的黏附性受體，在小腸絨毛表面及呼吸道上皮細(xì)胞中大量表達(dá)[16-17]；ACE2 在腎素-血管緊張素系統(tǒng)的活動(dòng)中扮演重要角色，能夠水解血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ），呼吸道上皮細(xì)胞表達(dá)的ACE2 蛋白是SARS-CoV 和SARS-CoV-2 感染細(xì)胞必不可少的[18-19]；CEACAM1 是Ig 超家族成員，廣泛分布在胃腸道上皮細(xì)胞、小血管內(nèi)皮細(xì)胞等，冠狀病毒結(jié)合特異的受體CEACAM1 造成突起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，從而促進(jìn)病毒與細(xì)胞的膜融合過(guò)程[20]；DPP4是Ⅱ型跨膜蛋白，在細(xì)胞表面以二聚體形式存在，可溶性DDP4 存在于循環(huán)系統(tǒng)，是MERS-CoV 感染細(xì)胞的功能性受體[21]。

2 豬氨基肽酶

pAPN 常大量表達(dá)于豬腸道上皮細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞[22-23]。冠狀病毒通過(guò)其S 蛋白識(shí)別宿主pAPN中特異氨基酸感染宿主。pAPN編碼963個(gè)氨基酸，可被胰蛋白酶分解為95 ku 的N 端和50 ku 的C 端兩部分，有3 個(gè)抗原表位存在于剩余區(qū)域，pAPN 結(jié)合病毒的能力可能與其抗原中和區(qū)和受體結(jié)合區(qū)的位點(diǎn)突變有關(guān)[24]。pAPN 蛋白結(jié)構(gòu)以及pAPN 抑制劑作用的結(jié)構(gòu)區(qū)域如圖1 所示[25]。真核表達(dá)系統(tǒng)、原核表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)是目前pAPN 的主要表達(dá)方式。越來(lái)越多的研究表明，pAPN 可能是多種豬冠狀病毒侵入時(shí)的主要入侵受體[26-27]。

隨pAPN 受體的廣泛研究，pAPN 受體阻斷藥物也逐漸成為冠狀病毒的研究熱點(diǎn)之一。目前，已有部分pAPN 病毒結(jié)合位點(diǎn)得到鑒定，但具體的病毒結(jié)合區(qū)域仍有待闡明，抗pAPN 多克隆抗體、單鏈抗體和噬菌體展示等技術(shù)的使用更為防控TGEV、PEDV 提供了思路及方法。SHIRATO 等[28]制備的抗pAPN-C 片段的多克隆抗體可有效識(shí)別pAPN，同時(shí)運(yùn)用噬菌體ELISA 技術(shù)制備的抗pAPN 單鏈抗體能夠特異結(jié)合pAPN。WANG 等[29]體外表達(dá)pAPN 并免疫兔，獲得高滴度pAPN 的免疫血清，通過(guò)這些抗體與pAPN 的中和反應(yīng)來(lái)有效阻斷TGEV 的感染。MENG 等[30]通過(guò)噬菌體展示技術(shù)設(shè)計(jì)出H、S 和F 等3 個(gè)合成肽，發(fā)現(xiàn)PEDV S 蛋白可與H 肽相互作用，從而來(lái)抑制病毒感染，為研究PEDV S 蛋白病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合和抑制位點(diǎn)提供了思路。

3 pAPN受體介導(dǎo)的豬冠狀病毒感染

3.1 TGEV

TGEV 最早在1946 年被分離，其引起腸道感染的特點(diǎn)主要是劇烈嘔吐、脫水和嚴(yán)重急性腹瀉，尤其在出生不到14 d 的仔豬中有著極高的致死率[31]。DELMAS 等[16]采用TEGV 中和抗體方法研究發(fā)現(xiàn)，pAPN是TGEV 感染的主要功能性受體，同時(shí)明確指出TGEV 在pAPN 受體上的結(jié)合位點(diǎn)是第717—813 aa。GODET 等[32]通過(guò)TGEV S 蛋白不同酶切短體與pAPN 免疫共沉淀的方法，明確pAPN 與TGEV S 蛋白結(jié)合位點(diǎn)是Ser506 至Ile728，同時(shí)這也是S 蛋白的抗體黏附位點(diǎn)，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。

TGEV S 蛋白除了能與pAPN 結(jié)合，還可以與唾液酸相互結(jié)合，從而促進(jìn)TGEV 的感染。研究表明，TGEV 感染缺失唾液酸的細(xì)胞時(shí)，病毒的感染性不會(huì)受到抑制，但會(huì)導(dǎo)致TGEV 結(jié)合細(xì)胞表面的能力下降6倍，表明S 蛋白與唾液酸的結(jié)合并不是TGEV感染所必需的，但唾液酸是TGEV 感染宿主的輔助結(jié)合因子[33]。SCHWEGMAN 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，TGEV感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞時(shí)，若吸附時(shí)間減少至5 min，用唾液酸水解酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，則使TGEV 感染率降低80%，說(shuō)明TGEV 的感染在吸附時(shí)間較短時(shí)有賴于唾液酸的結(jié)合。由此可見，唾液酸結(jié)合活性對(duì)TGEV 在小腸的不利環(huán)境中感染具有重要意義[35]。

3.2 PRCV

PRCV 與TGEV 有著較高的同源性，但對(duì)TGEV和PRCV 進(jìn)行S 蛋白測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，兩者存在有明顯差異，PRCV S 蛋白在N 端有224 個(gè)氨基酸殘基的缺失[36]，而TGEV S 蛋白與pAPN 結(jié)合位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)缺失。研究證明，PRCV 可利用pAPN作為入侵細(xì)胞的受體[37]。TGEV S 蛋白與唾液酸輔助因子結(jié)合的位置與PRCV 不同，這有可能是TGEV 與PRCV 組織嗜性存在差異的原因[38]。

PRCV 可在呼吸道中進(jìn)行高度復(fù)制，在小腸和胃黏膜細(xì)胞中感染率極低，并不會(huì)導(dǎo)致胃腸疾病[39]。PRCV 感染只會(huì)引起短暫的咳嗽和呼吸困難，造成輕微和短暫的疾病，但其與其他病原體發(fā)生共感染會(huì)成為一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題。

3.3 PEDV

近幾年來(lái)，PEDV 疫情在亞洲暴發(fā)并持續(xù)流行[40]，對(duì)養(yǎng)豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，人們開始廣泛開展PEDV 感染宿主細(xì)胞受體的相關(guān)研究。早期研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型冠狀病毒對(duì)于受體的選擇高度保守，PEDV 作為Ⅰ型冠狀病毒，可能與TGEV、FCoV 和HCoV-229E 一樣，以pAPN 作為介導(dǎo)感染宿主的功能性受體[41]。LI 等[42]將pAPN 轉(zhuǎn)染到對(duì)PEDV 不易感的 犬腎細(xì)胞 系MDCK細(xì)胞，pAPN 在MDCK 細(xì)胞中充分表達(dá)后，MDCK 細(xì)胞可被PEDV成功感染。單智夫[43]將pAPN 拆分為SPA、SPB 和SPC 3 個(gè)片段，分別轉(zhuǎn)染至MDCK 細(xì)胞中，再對(duì)MDCK 細(xì)胞接種PEDV，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染SPC 片段的細(xì)胞出現(xiàn)病變，證明SPC 段存在pAPN 的受體功能域，即定位了與PEDV 感染有關(guān)的關(guān)鍵氨基酸區(qū)域是500—963位氨基酸。

目前，關(guān)于pAPN 能否作為PEDV 功能性受體存在著很大爭(zhēng)議，非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）常常用來(lái)增殖PEDV，但并不能表達(dá)pAPN。而與此相反的是，豬睪丸細(xì)胞（ST）可表達(dá)pAPN，但PEDV 并不能在ST細(xì)胞中高效繁殖。NAM等[44]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面pAPN 受體的密度與PEDV 感染能力密切相關(guān)，提示ST 細(xì)胞表達(dá)pAPN 的量過(guò)低是其不能被PEDV有效感染的原因。

LIU 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，PEDV 的S1 亞單位可 與pAPN 結(jié)合，而TGEV 與pAPN 結(jié)合力明顯較低，提示可能有多種細(xì)胞表面蛋白質(zhì)能夠作為PEDV 的受體。DENG等[46]的研究結(jié)果表明，PEDV在Vero細(xì)胞中的感染不會(huì)因?yàn)閜APN 與短肽相互作用而受到抑制，可以認(rèn)為其受體是另外一種與pAPN 差異較大的蛋白質(zhì)。CHEN等[22]研究發(fā)現(xiàn)，PEDV不能感染ST細(xì)胞，表達(dá)pAPN 的人宮頸癌細(xì)胞（Hela-pAPN）以及CPK細(xì)胞也不能被PEDV有效感染。與此相反的是，TGEV 對(duì)于這3種細(xì)胞均可有效感染。由此表明，PEDV 的功能性受體并非pAPN。JI 等[47]通過(guò)研究PEDV 的S1 亞單位與pAPN 的結(jié)合機(jī)制發(fā)現(xiàn)，PEDV 與其他甲型冠狀病毒如TGEV、PRCV、HCoV-229E 具有明顯差異，以此來(lái)解釋PEDV 不能感染ST細(xì)胞的原因。通過(guò)基因敲除技術(shù)發(fā)現(xiàn)，缺失pAPN的Vero 細(xì)胞仍然存在另一種受體介導(dǎo)PEDV 侵入[47]，缺失pAPN基因的豬不會(huì)感染TGEV，但仍會(huì)感染PEDV[48]。

大量研究結(jié)果表明，PEDV 有可能通過(guò)不同受體介導(dǎo)感染宿主細(xì)胞[47-49]，pAPN 作為PEDV 感染宿主的功能性受體尚未有定論，仍然需要更進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。PEDV 可以有效感染包括人、猴、豬以及蝙蝠在內(nèi)的多個(gè)物種的細(xì)胞，說(shuō)明PEDV 的受體很有可能是物種進(jìn)化過(guò)程中較為保守的一類蛋白質(zhì)。

3.4 PDCoV

PDCoV 是一類δ 型腸道冠狀病毒，也是目前唯一被發(fā)現(xiàn)的可感染豬的丁型冠狀病毒[49-50]。感染PDCoV 的豬通常會(huì)出現(xiàn)水樣腹瀉和嘔吐癥狀，與感染TGEV 和PEDV 的豬有著相似的臨床反應(yīng)[51]。PDCoV S 蛋白S1 亞基有A、B、C 和D 等4 個(gè)結(jié)構(gòu)域，A 結(jié)構(gòu)域和B 結(jié)構(gòu)域作為主要的蛋白質(zhì)組成成分發(fā)揮結(jié)合功能，結(jié)構(gòu)域C 和結(jié)構(gòu)域D 主要發(fā)揮維持S1亞基整體結(jié)構(gòu)的功能。PDCoV S1 亞基沒有任何血凝活性，即不能結(jié)合唾液酸，A結(jié)構(gòu)域被發(fā)現(xiàn)能夠結(jié)合黏液素，但是目前并沒有直接證據(jù)表明這種活性與PDCoV結(jié)合受體相關(guān)[52-53]。

SHANG 等[53]通過(guò)斑點(diǎn)雜交（Dot-blot）試驗(yàn)得出，結(jié)構(gòu)域B 不能與pAPN 相互作用，說(shuō)明可能存在其他細(xì)胞表面蛋白質(zhì)來(lái)介導(dǎo)PDCoV 侵入宿主細(xì)胞。盧曼曼等[54]以TGEV 為指示病毒，通過(guò)入侵宿主細(xì)胞感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在ST 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)pAPN，對(duì)PDCoV 的增殖過(guò)程無(wú)明顯影響；通過(guò)阻斷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，可溶性pAPN 并不能有效阻止PDCoV 感染ST 細(xì)胞。以上研究結(jié)果表明，pAPN 不是PDCoV 入侵宿主的受體，而且與PDCoV 增殖無(wú)關(guān)。為進(jìn)一步篩選鑒定ST細(xì)胞表面的PDCoV受體分子，盧曼曼等[54]用PDCoV-S1 蛋白真核表達(dá)純化系統(tǒng)，表達(dá)出最接近天然蛋白質(zhì)構(gòu)象的PDCoV-S1 蛋白，通過(guò)免疫共沉淀的方法篩選出可能的受體，并對(duì)篩選出的受體進(jìn)行基因沉默和過(guò)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，宿主熱休克蛋白pHSPCB 在PDCoV 感染過(guò)程中起著重要作用。當(dāng)pHSPCB 表達(dá)量高時(shí)，PDCoV 復(fù)制能夠得到促進(jìn)；表達(dá)量低時(shí)，PDCoV 復(fù)制被抑制?？梢?，pAPN 不是PDCoV 的受體分子，從而為PDCoV 的感染機(jī)制研究提供了新的研究思路。

與上述研究報(bào)道不同，劉炎等[55]分別利用純化的PDCoV S1 蛋白和PDCoV 病毒，采用免疫印記、免疫熒光、免疫共沉淀、流式細(xì)胞技術(shù)等多種檢測(cè)方法，對(duì)不同表達(dá)量的pAPN 和已經(jīng)敲除pAPN的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合感染介導(dǎo)試驗(yàn)，證明pAPN 能夠介導(dǎo)PDCoV 感染宿主細(xì)胞。也有一些研究表明，過(guò)表達(dá)pAPN 能夠促使非易感的BHK-21 細(xì)胞被PDCoV 感染，并且研究發(fā)現(xiàn)，敲除pAPN基因能夠一定程度地抑制PDCoV的感染效果[27]。

TGEV 已被證明是利用pAPN 作為其功能性受體，唾液酸為其輔助因子。對(duì)于PEDV 來(lái)說(shuō)，在其侵入過(guò)程中pAPN 的作用存在爭(zhēng)議，因?yàn)橥僖核釋?duì)不同的PEDV 毒株具有多種結(jié)合活性，唾液酸在PEDV 進(jìn)入中的作用有待進(jìn)一步闡明。PRCV 同樣使用pAPN 作為功能性受體。PDCoV 是SECoVs 中唯一的δ 型冠狀病毒，在感染過(guò)程中表現(xiàn)出巨大的種間差異（圖2）[55]。

4 小結(jié)與展望

對(duì)于豬冠狀病毒受體的研究主要包括豬冠狀病毒受體的結(jié)構(gòu)特征、生理功能，以及在病毒感染過(guò)程中與S 蛋白的相互作用等，研究這些為解釋冠狀病毒的致病機(jī)制和研發(fā)受體阻斷藥物提供了理論依據(jù)。目前，介導(dǎo)PEDV 和PDCoV 感染宿主的受體是否為pAPN 存在爭(zhēng)議。此外，PEDV 感染Vero細(xì)胞的受體不同于感染豬腸道細(xì)胞的受體，宿主細(xì)胞生存的環(huán)境有無(wú)胰酶的存在也可能造成所用受體不一致。

豬冠狀病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，其進(jìn)化變異速度較快，而其是否能夠利用pAPN 之外的其他多種受體尚不清楚，揭示pAPN 受體及其他可能受體的結(jié)合機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其與不同物種間傳播的關(guān)系，可幫助預(yù)測(cè)豬冠狀病毒的變異及其在新宿主中的暴發(fā)，對(duì)于研發(fā)抗病毒藥物有重要意義。