家庭自制酵素中的微生物污染檢測

何曼 李松 仇雨 周璇 陳麗麗

摘 要：目的：了解家庭自制酵素的微生物污染狀況，為酵素的安全食用提供參考數(shù)據(jù)。方法：收集6個家庭中蘋果、火龍果和香蕉酵素，每種2個樣品，共6個樣品，按照中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會食用植物酵素團體標準（T/CBFIA 08003—2017），發(fā)酵完成后在貯存0 d、5 d、10 d、15 d、20 d時取樣，對其感官性狀、菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母數(shù)量進行測定。結(jié)果：6個檢樣感官性狀和大腸菌群數(shù)均符合標準。樣品菌落總數(shù)均大于102 CFU/mL，且菌落總數(shù)隨著保存時間的延長有增長趨勢;蘋果和火龍果酵素的霉菌總數(shù)均大于20 CFU/mL，香蕉酵素的霉菌總數(shù)合格;所有檢樣的酵母菌數(shù)量較高，均超過104 CFU/mL，且呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢。結(jié)論：自制酵素菌落總數(shù)、霉菌總數(shù)和酵母菌總數(shù)均有超標情況，存在一定的健康風險。

關(guān)鍵詞：自制酵素;菌落總數(shù);大腸菌群數(shù);霉菌;酵母菌

酵素產(chǎn)品主要盛行于日本、美國、一些歐洲國家及東南亞地區(qū)，且形成了品牌產(chǎn)業(yè)規(guī)模。近十多年來，在中國開始盛行，越來越多的酵素理念被引入到農(nóng)業(yè)、食品、美容保健等領(lǐng)域[1-2]。酵素是用果蔬、菌菇或中草藥等作為原材料，通過發(fā)酵，形成富含礦物質(zhì)、氨基酸、多種酶、乳酸、醋酸和少量乙醇等代謝產(chǎn)物的液態(tài)和固態(tài)食品[3-4]。

酵素富含大量脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶、乳酸、醋酸、少量乙醇等代謝產(chǎn)物、酚類和黃酮類等生物活性成分，植物酵素中還有大量的抗氧化成分和多種營養(yǎng)物質(zhì)[5-6]。不同原料酵素具有的功能不相同，如桑葚酵素可以補益腎肝、延緩衰老[7-8];獼猴桃酵素能夠安神益智、美容養(yǎng)顏[9];黑加侖酵素能夠預(yù)防高血壓，心臟病，具有較強的抗氧化能力[10-11]。

酵素因為其眾多的功效而受到很多人的青睞，近年來，家庭自制酵素越來越流行。但自制酵素由于沒有對其生產(chǎn)條件進行嚴格地控制，在生產(chǎn)和貯存過程中容易受到微生物污染，微生物的污染程度與貯存的時間密切相關(guān)。被污染的酵素其食用價值和功效價值將會受到影響，也會對人體的健康造成危害。為評價家庭自制酵素的衛(wèi)生微生物指標合格情況，本項目收集了6家3種不同原材料的酵素，檢測不同貯存時間后的感官性狀、pH值、菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、霉菌和酵母數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

普通營養(yǎng)瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司;月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯和煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

實驗所用酵素為6個家庭的自制酵素，包括蘋果、香蕉、紅心火龍果酵素，制備過程均為將各種原材料洗凈瀝干，切碎（<0.5 cm3），加入酵素桶中，用無菌水溶解白砂糖后加入，攪拌均勻后，密封發(fā)酵7 d而成。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯，按試劑說明書配制，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，分裝后備用。

1.2.2 pH測定

取少量樣品用酸度計（sartorius PB-10）進行測定。

1.2.3 樣品稀釋處理

用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品pH值，使其在6.5～7.5，以無菌操作，分別取貯存0 d、5 d、10 d、15 d、20 d的各種酵素25 mL于裝有225 mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi)，充分振蕩，制成1︰10的均勻稀釋液。用滅菌吸管吸取1︰10稀釋液1 mL，加入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振蕩試管，混合均勻，做成1︰100的稀釋液。另取1 mL滅菌吸管，按上述操作，制成10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1 mL滅菌吸管。

1.2.4 菌落總數(shù)測定

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016），測定樣品中菌落總數(shù)[12]。根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求對標本污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，取1 mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。加入約15 mL，46 ℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1 mL稀釋液的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，在（36±1）℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)（48±2）h。

1.2.5 大腸菌群檢測

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）的MPN法，測定樣品中大腸菌群數(shù)[13]。

（1）初發(fā)酵實驗。每個樣品選擇3個適合的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種

1 mL，（36±1） ℃培養(yǎng)（24±2） h，觀察管內(nèi)是否產(chǎn)生氣泡，（24±2） h產(chǎn)氣者進行復(fù)發(fā)酵實驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至（48±2）h，產(chǎn)氣者進行復(fù)發(fā)酵實驗，未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。

（2）復(fù)發(fā)酵實驗（證實實驗）。用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于BGLB肉湯中（36±1）℃培養(yǎng)（48±2） h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。

根據(jù)確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù)，檢索大腸菌群MPN表，報告每mL樣品中大腸菌群的MPN值。

1.2.6 霉菌和酵母菌計數(shù)

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB4789.15—2016），測定樣品中霉菌和酵母菌數(shù)[14]。根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或?qū)吮疚廴厩闆r的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，每個稀釋度取1 mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。加入46 ℃馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。同時將馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基傾入加有1 mL稀釋液的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，在（28±1）℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)5 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官指標

本次實驗共檢測蘋果、火龍果和香蕉酵素，每種2個樣品，共6個樣品。其中蘋果和香蕉酵素均呈乳白色，火龍果酵素呈紫紅色，具有該水果特有的芳香性氣味，pH均小于4，無肉眼可見的外來雜質(zhì)。

2.2 菌落總數(shù)

由表1可知，本實驗檢測的3種自制酵素中菌落總數(shù)含量均達104 CFU/mL以上，且隨著保存時間的延長，菌落總數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢如圖1所示。

此外，不同原料的自制酵素菌落總數(shù)達到最大值的時間不同，蘋果酵素在第10 d時的菌落總數(shù)達到最大值，火龍果和香蕉在第5 d達到最大值。

2.3 大腸菌群數(shù)

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）的MPN法，測定了樣品中大腸菌群數(shù)，發(fā)現(xiàn)樣品中的大腸菌群數(shù)均小于3，見表2。

2.4 霉菌數(shù)

由表3可知，蘋果酵素和火龍果酵素的霉菌數(shù)量均大于20 CFU/mL，最大為350 CFU/mL;香蕉酵素的霉菌數(shù)量小于20 CFU/mL;隨保存時間的延長，霉菌數(shù)量無明顯變化規(guī)律。

2.5 酵母菌數(shù)

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016），測定樣品中的酵母菌數(shù)。由表4可知，每種自制酵素樣品中酵母菌的含量均較高，均超過10 CFU/mL。在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢如圖2所示。

3 結(jié)論與討論

（1）本實驗共收集了6個家庭自制的3種酵素樣品，先觀察其感官性狀，并檢測其pH值，發(fā)現(xiàn)蘋果和香蕉酵素均呈乳白色，火龍果酵素呈紫紅色，具有該水果特有的芳香性氣味，pH均<4，無肉眼可見的外來雜質(zhì)。與中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會食用植物酵素團體標準食物酵素[15]中關(guān)于感官性狀的要求：自制酵素應(yīng)具有產(chǎn)品應(yīng)有的色澤，滋味且無肉眼可見的雜質(zhì)，pH<4相吻合。

（2）菌落總數(shù)為衛(wèi)生微生物指示性指標之一，用來判定食品樣品被微生物污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。菌落總數(shù)一定程度上能夠反映食品的新鮮程度、是否變質(zhì)以及生產(chǎn)過程的衛(wèi)生狀況等，人體長期食用菌落總數(shù)超標的食物，可能會引起胃腸道疾病。本實驗檢測的6個酵素樣品菌落總數(shù)均在104 CFU/mL以上，且隨著保存時間的延長，菌落總數(shù)呈先減少后增加的趨勢。T/CBFIA 08003—2017食物酵素[16]要求：酵素中菌落總數(shù)小于102 CFU/mL，檢測的自制酵素樣品的菌落總數(shù)均超標。酵素在制備的過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，pH值逐漸下降，酵素產(chǎn)品的pH均<4，然后在貯存過程中，由于微生物的繁殖，pH值逐漸增高，而細菌最合適的pH條件為7.2左右，導(dǎo)致隨著保存時間的延長菌落總數(shù)先減少后增加。

（3）大腸菌群主要來源于人和溫血動物糞便，可以指示腸道傳染病傳播的可能性。本實驗6個樣品中的大腸菌群數(shù)均<3，說明制作過程中不存在糞便污染，腸道疾病傳播的可能性較小。

（4）霉菌和酵母菌是發(fā)酵食品中常見的微生物，少量的霉菌和酵母不會造成食品質(zhì)量安全事故。但是霉菌過度生長會造成食品霉變，酵母菌污染會導(dǎo)致產(chǎn)品脹包、腐敗及風味的改變，給食品質(zhì)量和安全帶來影響。酵母菌和霉菌過度繁殖會影響食品的風味，許多霉菌的代謝產(chǎn)物具有很強的毒性，甚至致癌。T/CBFIA 08003—2017食物酵素的標準[15]要求霉菌的數(shù)量小于20 CFU/mL，本實驗中香蕉酵素霉菌總數(shù)均小于20 CFU/mL，而蘋果和火龍果酵素中霉菌數(shù)量均大于20 CFU/mL，最大達350 CFU/mL，這可能與水果的水分和含糖量有關(guān)，一般含糖高、水分高的食物更利于霉菌的生長。酵素中的酵母菌含量較高，呈現(xiàn)隨保存時間延長先增加后減少。酵母菌前期數(shù)量的增加可能是因為在發(fā)酵過程中添加了大量的白砂糖，酵母菌可以利用糖類物質(zhì)進行生長和繁殖，然后糖類的量減少，醇類和酸類物質(zhì)增多，酵母菌的生長受到抑制，導(dǎo)致其數(shù)量減少[16]。

目前，食品安全已經(jīng)成為了廣泛關(guān)注的問題，而微生物污染是影響食品安全最重要的因素。食品中微生物污染情況的檢測是防止微生物污染食品流入市場、保障人們身體健康的關(guān)鍵措施。因此，加強食品微生物污染檢測至關(guān)重要。

通過對家庭自制酵素的主要衛(wèi)生微生物指標的測定，發(fā)現(xiàn)自制酵素產(chǎn)品的菌落總數(shù)、霉菌和酵母總數(shù)均超標，提示食用自制酵素有一定的健康風險。自制酵素的制作應(yīng)嚴格把控酵素的生產(chǎn)、貯存條件，盡量通過正規(guī)渠道購買合格、安全的產(chǎn)品，使酵素以最低的安全風險發(fā)揮其最大的食用價值。

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