QSOX1、CXCL10、β2GPI在乙型肝炎病毒相關(guān)性肝病患者中的表達(dá)及相關(guān)性研究

李 曾， 謝 青， 李金強(qiáng)

乙型肝炎病毒（HBV）感染已嚴(yán)重威脅到人類的身體健康，因病毒持續(xù)感染刺激致使肝臟反復(fù)發(fā)作炎癥和纖維化，是慢性肝炎、肝硬化及原發(fā)性肝癌的首要病因[1]。尋找準(zhǔn)確度較高、簡(jiǎn)單無創(chuàng)的新型檢測(cè)指標(biāo)對(duì)于HBV相關(guān)性肝病的病情評(píng)估判定具有重要的臨床意義。研究表明，巰基氧化酶1（quiescin sulfhydryl oxidase 1，QSOX1）作為巰基氧化酶家族中的一員，其過表達(dá)產(chǎn)生的大量過氧化氫可以通過改變細(xì)胞內(nèi)部微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。趨化因子配體10 （chemokine ligand 10，CXCL10）及其受體之間的相互作用是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用，參與乙型肝炎（乙肝）相關(guān)肝癌的發(fā)生與發(fā)展[3]。β2糖蛋白Ⅰ（beta 2 glycoprotein I, β2GPI），β2GPI/抗 β2GPI抗體復(fù)合物能夠增強(qiáng)某些細(xì)胞株趨化因子表達(dá)[4]，β2GPI與HBsAg具有高度親和力，參與HBV的感染，促進(jìn)HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生[5-6]。但目前臨床中缺乏系統(tǒng)的三者聯(lián)合檢測(cè)HBV相關(guān)性肝病的相關(guān)研究。本文旨在探索QSOX1、CXCL10、β2GPI在HBV感染不同階段的表達(dá)差異，為臨床尋找HBV相關(guān)性肝病早期診斷無創(chuàng)標(biāo)志物提供線索。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 病例來源 通過單盲試驗(yàn)選取2019年3月—2020年3月在長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院接受治療的HBV相關(guān)性肝病包括慢性乙肝、肝硬化、肝癌患者共120例，男68例，女52例，年齡18～63歲，平均（38.5±21.4）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：HBV相關(guān)性肝病診斷及分期符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》標(biāo)準(zhǔn)[7]；肝癌診斷依據(jù)我國(guó)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》[8]；入院時(shí)未接受免疫調(diào)節(jié)和抗病毒治療；患者及其家屬均知情，簽署知情通知書。經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)合并或重疊感染其他嗜肝病毒，罹患自身免疫性肝病，合并有嚴(yán)重心肺腎等重要器官功能不全，糖尿病患者及其他免疫缺陷性疾病，妊娠期、哺乳期患者，精神病患者。

1.1.2 病例分布 患者分為慢性乙肝40例，男26例，女14例，平均年齡（38.5±21.4）歲，其中輕度15例，中度13例，重度12例；肝硬化40例，男20例，女20例，平均年齡（37.5±20.4）歲，其中代償期肝硬化18例，失代償期肝硬化22例；肝癌40例，男22例，女18例，平均年齡（38.0±20.9）歲。選取同時(shí)期非HBV感染肝病患者40例為非HBV肝病組，男20例，女20例，年齡20～65歲，平均年齡（40.4±19.4）歲，其中包括非酒精性脂肪肝肝炎20例，酒精性脂肪肝肝炎11例，藥物性肝炎9例。同期無HBV感染的健康體檢志愿者40例，為正常組，男25例，女15例，年齡18～66歲，平均（39.9±22.8）歲。各組之間患者性別、平均年齡等一般資料均具可比性，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 肝功能測(cè)定 抽取受檢者清晨空腹靜脈血5 mL，置于真空采血管（不含抗凝劑）中，血液凝固后，使用高速離心機(jī)以3 600 r/min的速度離心5 min，分離血清，分裝在EP管中，于－20℃冰箱中保存，待檢。采用放射免疫法測(cè)定患者肝功能指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）水平，試劑盒由上海海軍醫(yī)學(xué)研究所提供，采用日立7600-020全自動(dòng)生化儀檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，并保證質(zhì)控符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。HBV DNA定量檢測(cè)采用熒光定量PCR分析儀檢測(cè)，均由上海?？迫A生物工程股份有限公司完成。

1.2.2 QSOX1、CXCL10、β2GPI檢測(cè) 采用ELISA測(cè)定QSOX1、CXCL10和β2GPI，試劑盒由蘇州卡爾文生物科技有限公司提供。測(cè)定前準(zhǔn)備：①將標(biāo)本稀釋至1 mL/瓶，室溫下溶解10 min，濃度是2 000 ng/L，溶解的標(biāo)本先稀釋到1 000 ng/L，標(biāo)本稀釋液做空白孔；②稀釋溶液A：稀釋前根據(jù)事先計(jì)算好的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所需要的總量進(jìn)行配制（100 μL/孔），稀釋液A 1∶100稀釋；③稀釋溶液B，稀釋前根據(jù)事先計(jì)算好的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所需要的總量進(jìn)行配制（100 μL/孔），稀釋液B 1∶100稀釋；④稀釋濃縮洗滌液：濃縮洗滌液30 mL于37 ℃恒溫箱，水浴15 min，搖勻，加入醫(yī)用蒸餾水720 mL，1∶25倍稀釋，備用。ELISA測(cè)定：酶標(biāo)板每孔分別加待檢標(biāo)本100 μL，晃動(dòng)混勻，覆膜，37 ℃培育2 h；棄液，甩干，勿洗滌。每孔加A工作液100 μL，覆膜，37 ℃培育1 h；棄液，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，甩干；每孔加B工作液100 μL，覆膜，37℃培育1 h；棄液，甩干，洗板5次，每次浸泡 1～2 min，400 μL/每孔，甩干；每孔加底物液90 μL，酶標(biāo)板覆膜37 ℃避光顯色15～30 min，終止條件為前3～4孔有明顯的梯度藍(lán)色而后3～4孔梯度并不明顯；加終止液50 μL/孔，反應(yīng)得到終止，此時(shí)藍(lán)色即刻轉(zhuǎn)為黃色。終止液的加入順序與底物液的加入順序應(yīng)盡量保持一致；采用波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的光密度（D值）并讀數(shù)。根據(jù)D值計(jì)算待檢標(biāo)本中的QSOX1、CXCL10和β2GPI的水平。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料采用x±s描述，多組間比較采用F值分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QSOX1、CXCL10、β2GPI水平及肝功能檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 各組檢測(cè)結(jié)果比較 如表1所示，與正常組比較非HBV肝病組QSOX1、CXCL10、β2GPI水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），ALT水平高于正常組（P＜0.05）。肝癌組、肝硬化組、慢性乙肝組 QSOX1、CXCL10、β2GPI、ALT水平高于非HBV肝病組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肝癌組QSOX1、CXCL10、β2GPI表達(dá)高于肝硬化組和慢性乙肝組，ALT水平低于這兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肝硬化組QSOX1、CXCL10、β2GPI表達(dá)高于慢性乙肝組，ALT水平低于該組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組研究對(duì)象QSOX1、CXCL10、β2GPI水平及肝功能比較Table 1 Results of QSOX1, CXCL10, β2GPI, and liver function tests in each group

2.1.2 不同嚴(yán)重程度慢性乙肝患者的檢測(cè)結(jié)果 如表2所示，中度慢性乙肝患者QSOX1、CXCL10、β2GPI、TBIL水平高于輕度患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。重度慢性乙肝患者QSOX1、CXCL10、β2GPI、TBIL表達(dá)高于中度患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 不同嚴(yán)重程度慢性乙型肝炎患者QSOX1、CXCL10、β2GPI表達(dá)水平及肝功能比較Table 2 QSOX1, CXCL10, β2GPI expression and total bilirubin levels in terms of severity of chronic hepatitis B

2.1.3 不同分期肝硬化患者檢測(cè)結(jié)果 如表3所示，非HBV肝病組與正常組QSOX1、CXCL10、β2GPI水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。失代償期肝硬化患者QSOX1、CXCL10、β2GPI、ALT、TBIL水平高于代償期肝硬化患者、正常組、非HBV肝病組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。代償期肝硬化患者 QSOX1、CXCL10、β2GPI、ALT、TBIL水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 不同分期HBV相關(guān)性肝硬化患者QSOX1、CXCL10、β2GPI水平及肝功能比較Table 3 QSOX1, CXCL10, β2GPI expression and liver function levels compared between patients in terms of HBV-associated cirrhosis

2.2 QSOX1、CXCL10、β2GPI與肝功能指標(biāo)相關(guān)性比較

經(jīng)過Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，QSOX1與ALT呈正相關(guān)（r=0.374，P=0.018）；CXCL10與ALT 呈正相關(guān)（r=0.357，P=0.020）；β2GPI與 ALT呈正相關(guān)（r=0.389，P=0.010）。QSOX1與 TBIL呈正相關(guān)（r=0.642，P=0.001）；CXCL10與 TBIL呈正相關(guān)（r=0.472，P=0.009）；β2GPI與 TBIL呈正相關(guān)（r=0.644，P=0.001）。

3 討論

HBV是一個(gè)小DNA病毒，是嗜肝DNA病毒科的一種。HBV的感染已經(jīng)嚴(yán)重威脅到全球人類的健康，它有流行性廣等特點(diǎn)，僅亞洲患病率已經(jīng)超過了10%[9]。從臨床上來講，慢性乙肝發(fā)展成為原發(fā)性肝癌的概率特別大，而原發(fā)性肝癌每年能夠造成全球100萬人死亡[10]，并呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，因而需注重HBV相關(guān)性肝病尤其是肝癌的早期診斷治療。

QSOX1作為一種二硫鍵形成酶，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白能起到氧化折疊作用，還可氧化生成過氧化氫[11]。QSOX1在腫瘤細(xì)胞中的分泌量較高，研究證實(shí)QSOX1水平與腫瘤的形成和發(fā)展有密切關(guān)系[12]。本研究結(jié)果顯示，在HBV相關(guān)性肝癌患者中，QSOX1呈現(xiàn)出顯著高表達(dá)，提示QSOX1表達(dá)的增加可能預(yù)示肝癌的發(fā)生和發(fā)展變化。同樣在HBV相關(guān)性慢性乙肝重度患者以及失代償期肝硬化患者中，QSOX1呈現(xiàn)出較高表達(dá)，表明QSOX1表達(dá)水平隨著肝病嚴(yán)重程度加重而增高。

CXCL10在趨化單核細(xì)胞和造血細(xì)胞集落形成中大量存在，抑制T細(xì)胞活化、介導(dǎo)細(xì)胞融解、抑制血管生成等[13]。CXC趨化因子對(duì)血管生成、肝臟炎癥發(fā)生、新生物增生、纖維化形成、免疫反應(yīng)有重要影響，在肝硬化發(fā)生中也起到一定作用[14]。Toshiro等[15]證實(shí)，在慢性肝炎患者中CXCL10的含量比正常人顯著增高。以往研究證實(shí)，在HBV相關(guān)性肝病肝炎、肝硬化患者的肝臟中，CXCL10表達(dá)均有明顯增高，以及參與發(fā)生多種疾病[16]。CXCL10一方面參與血管的新生、腫瘤成長(zhǎng)和器官硬化等，另一方面趨化白細(xì)胞炎癥聚集，可能參與乙肝相關(guān)肝癌的發(fā)展[17]。本研究結(jié)果顯示，在HBV相關(guān)性肝病、肝癌患者、慢性乙肝重度患者、失代償期肝硬化患者中，CXCL10的表達(dá)顯著增高，這說明炎癥反應(yīng)隨著HBV相關(guān)性肝炎患者疾病的嚴(yán)重程度增加而加重，同時(shí)CXCL10的表達(dá)也隨之升高。

β2GPI被發(fā)現(xiàn)是自身免疫性疾病抗磷脂抗體綜合征重要自身抗原，近年來的研究表明β2GPI與機(jī)體的免疫功能有關(guān)[18-19]。據(jù)報(bào)道，β2GPI能與HBV表面抗原相結(jié)合，并且其結(jié)合的活性在病毒復(fù)制活躍的患者血漿中更強(qiáng)[20]。Abdel-Wahab等[21]研究表明，β2GPI還在與HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生機(jī)制中起到重要作用。本研究結(jié)果顯示，在HBV相關(guān)性肝病、肝癌患者、慢性乙肝重度患者和失代償期肝硬化患者中，β2GPI都呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，提示β2GPI在HBV相關(guān)性肝病的發(fā)生中隨著疾病程度增加而呈現(xiàn)出高表達(dá)。

經(jīng)過Pearson相關(guān)性分析，QSOX1、CXCL10、β2GPI與肝功能ALT、TBIL指標(biāo)之間呈正相關(guān)，患者肝功能損傷越嚴(yán)重，HBV相關(guān)性肝病患者病情越重。

綜上所述，QSOX1、CXCL10、β2GPI可作為反映HBV相關(guān)性肝病患者肝臟炎癥損傷程度的重要指標(biāo)，與患者肝功能損傷有一定的關(guān)聯(lián)，可能參與HBV相關(guān)性肝病發(fā)展，在HBV相關(guān)性肝病臨床診斷中具有重要價(jià)值。