聚乙二醇干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎早期HBsAg快速下降的臨床及免疫學(xué)特征研究

王嘉悅， 李天駒， 付 豪， 秦 波

慢性乙型病毒性肝炎（CHB）是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一類危害極大的傳染性疾病。近年來，“功能性治愈”這一概念被越來越多的醫(yī)務(wù)工作者所重視。所謂的“功能性治愈”，也稱“臨床治愈”，是指完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續(xù)檢測不到，HBeAg陰轉(zhuǎn)，伴或不伴HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，殘留cccDNA可持續(xù)存在，肝臟炎癥緩解和肝組織病理學(xué)改善，終末期肝病發(fā)生率顯著降低[1]。雖然“臨床治愈”還不是完全意義上的治愈，但這是一種類似于急性HBV感染自發(fā)性清除的狀態(tài)，可以實(shí)現(xiàn)有效的免疫學(xué)控制，是我們目前所追求的理想的治療目標(biāo)[2]。然而目前指南和專家共識(shí)中均認(rèn)為，這只是部分患者可以達(dá)到的目標(biāo)。因此，需要探索如何讓更多的患者實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。

聚乙二醇干擾素（Peg-IFN）作為CHB治療的一線用藥，與核苷酸類似物（NA）相比，有著獨(dú)特的優(yōu)勢。有研究表明干擾素治療后HBsAg血清轉(zhuǎn)陰率高，轉(zhuǎn)歸好[3]；對(duì)于CHB患者來說，以Peg-IFN為基礎(chǔ)的治療比單用拉米夫定療法更能有效地實(shí)現(xiàn)HBsAg的清除或血清轉(zhuǎn)換，且療效優(yōu)于常規(guī)干擾素[4]；對(duì)于長期NA不太可能達(dá)到治療目標(biāo)的患者，改用Peg-IFN可以實(shí)現(xiàn)較高的HBsAg清除率[5]；接受Peg-IFN治療的HBeAg陰性的CHB患者在停止治療后持續(xù)24周的病毒學(xué)應(yīng)答率顯著高于單用拉米夫定者[6]。Peg-IFN既可直接在RNA水平抑制病毒復(fù)制，同時(shí)也可以作為免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用[7]。同樣有研究報(bào)道以Peg-IFN為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療可以誘導(dǎo)HBV特異性T細(xì)胞的恢復(fù)[8]；Peg-IFN治療還可顯著地增強(qiáng)CHB患者NK細(xì)胞的百分比和功能[9]。同樣地，Shi等[10]研究發(fā)現(xiàn)在Peg-IFN治療后功能得到恢復(fù)的CD56brihgtNK細(xì)胞可以通過TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解和TNF-α/IFN-γ介導(dǎo)的非細(xì)胞溶解途徑促進(jìn)HBsAg和cccDNA清除。有研究還發(fā)現(xiàn)具有較低效應(yīng)記憶γδT細(xì)胞比例的CHB患者在Peg-IFNα-2a治療中可能更易獲得應(yīng)答[11]。綜上可見，宿主免疫功能在Peg-IFN抗HBV治療中發(fā)揮著重要作用。

根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[1]和《慢性乙型肝炎臨床治愈（功能性治愈）專家共識(shí)》[2]的相關(guān)內(nèi)容，我們將“早期應(yīng)答”定義為：CHB患者在接受Peg-IFN治療24周時(shí)，HBV DNA下降＞2 lg IU/mL或治療中HBsAg快速下降（12周或24周時(shí)HBsAg＜200 IU/mL或下降＞1 lg IU/mL）。本研究將以接受Peg-IFN治療的HBeAg陰性的CHB患者為研究對(duì)象，探索影響早期應(yīng)答的因素，以及外周血T淋巴細(xì)胞的分布及動(dòng)態(tài)變化與Peg-IFN抗HBV療效的相關(guān)性，為預(yù)測Peg-IFN療效以及尋找新的抗HBV治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究納入2017年4月—2020年8月于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科門診就診的CHB患者204例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①成年患者（年齡≥18歲）；②血清HBsAg＜3 000 IU/mL、抗-HBs陽性或陰性、HBeAg陰性、抗-HBe陽性或陰性；③同意使用Peg-IFNα-2b（派格賓）治療，180 μg每周一次，皮下注射，并且堅(jiān)持每月監(jiān)測血常規(guī)、肝功能，每3個(gè)月監(jiān)測乙肝病毒標(biāo)志、HBV DNA定量，每半年監(jiān)測腹部B超、肝臟彈力成像、肝纖譜、甲胎蛋白（AFP）等指標(biāo)；④已了解本項(xiàng)研究及治療中的風(fēng)險(xiǎn)并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他感染性疾病，如丙型、戊型病毒性肝炎以及HIV感染等；②干擾素治療絕對(duì)禁忌證，如：妊娠或短期內(nèi)有妊娠計(jì)劃、精神病史、未能控制的癲癇、失代償期肝硬化、未控制的自身免疫病，嚴(yán)重感染、視網(wǎng)膜疾病、心功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病等基礎(chǔ)疾?。虎酆喜⑿难?、泌尿系統(tǒng)、結(jié)締組織及血液系統(tǒng)等嚴(yán)重慢性疾病；④使用Peg-IFNα-2b的過程中出現(xiàn)嚴(yán)重過敏反應(yīng)及骨髓抑制等不良反應(yīng)。

納入符合標(biāo)準(zhǔn)的患者，登記其個(gè)人信息及病史，并通過重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診系統(tǒng)獲取患者的檢驗(yàn)報(bào)告，包括血常規(guī)、肝功能、乙肝病毒標(biāo)志、HBV DNA定量、腹部B超、AFP等指標(biāo)。本研究已通過重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批，審查批號(hào)：2020-409。

1.2 樣本采集及處理

采集10名健康志愿者以及納入該研究的部分患者在不同治療階段（基線、12周、24周）的外周血10 mL，通過密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，選擇合適的細(xì)胞數(shù)（不低于2×106/管）分管，梯度凍存（使用程序性凍存盒或4℃，30 min；-20℃，2 h；-80℃，過夜）后于液氮中長期保存。主要試劑有RPMI1640（Gibco）、胎牛血清FBS（Gibco）、人外周血淋巴細(xì)胞分離液（TBD公司）、無菌PBS溶液（博士德生物）、無血清細(xì)胞凍存液（深圳達(dá)科為生物）等。

1.3 流式細(xì)胞技術(shù)分析T淋巴細(xì)胞的分布差異

從液氮罐中取出PBMC，快速復(fù)蘇細(xì)胞后計(jì)數(shù)，確保細(xì)胞數(shù)目不低于2×106/管。再進(jìn)行Fc封閉：2.5 μL Human TruStain FcX?（ Fc receptor blocking solution） /50 μL細(xì)胞體系，避光靜息8 min，免洗，直接用于后續(xù)染色。在50 μL PBS溶液重懸的細(xì)胞體系中，加入相應(yīng)的流式抗體，避光孵育20 min，之后 PBS溶液洗滌 2次（離心：300×g，5 min，室溫），最后用400 μL PBS溶液重懸后移入流式管，采用流式細(xì)胞儀檢測。數(shù)據(jù)通過FlowJo軟件進(jìn)行分析。使用的流式抗體：美國BioLegend公司提供的Human TruStain FcXTM（Fc Receptor Blocking Solution）、PE Anti-Human CD3、PerCP/Cy5.5 Anti-Human CD4、FITC Anti-Human CD8、Brilliant Violet 650TMAnti-Human CD25、APC Anti-Human CD127以及相應(yīng)的同型抗體Brilliant Violet 650TMMouse IgG1,κ、APC Mouse IgG1,κ。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件及GraphPad Prism 8.0進(jìn)行作圖和分析。非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）或頻數(shù)表示；正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。臨床資料中，不滿足正態(tài)性和方差齊性的組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，無序計(jì)數(shù)資料主要采用χ2檢驗(yàn)，并應(yīng)用logistic逐步回歸分析法對(duì)早期應(yīng)答的影響因素進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料中滿足正態(tài)分布及方差齊性者，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)；兩組間不符合方差齊性者采用Welch's 校正非配對(duì)t檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本臨床治療

共納入204例患者，男133例，女71例，曾經(jīng)接受過NA或IFN治療51例，無NA或IFN抗病毒治療史153例。在這204例患者中，實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答的患者120例，未實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答的患者84例。完成至少48～52周療程的患者137例，其中HBsAg清除的患者66例。而這66例患者中僅有4例未實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答，29例在治療結(jié)束時(shí)抗-HBs呈陽性（抗-HBs定量＞10 mIU/mL），約為42.06 mIU/mL。所有入組患者在治療期間均使用Peg-IFNα-2b治療，劑量為180 μg，每周1次，皮下注射，并堅(jiān)持每月門診隨訪。部分患者合并使用NA，如恩替卡韋、替諾福韋等。當(dāng)入組患者出現(xiàn)肝功能異常時(shí)，合并使用保肝藥，如甘草酸二銨、水飛薊素等；當(dāng)入組患者出現(xiàn)白細(xì)胞或血小板降低時(shí)，合并使用地榆升白片、益血生膠囊等藥物，嚴(yán)重時(shí)給予皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液等對(duì)癥措施。

2.2 影響Peg-IFNα-2b治療CHB實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答的臨床因素分析

根據(jù)患者的治療情況，將其分為早期應(yīng)答組（early response group， ERG）和早期不應(yīng)答組（early non-response group， NERG），并對(duì)兩組患者的性別、年齡、抗病毒治療史、基線時(shí)的HBsAg、HBV DNA、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TB）、直接膽紅素（DB）以及治療12周時(shí)的ALT、AST、TB、DB進(jìn)行單因素分析。

結(jié)果顯示ERG （女51例，男69例）與NERG （女20例，男64例）患者的性別分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ERG女性占比高于NERG（P=0.006）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩組患者的年齡、治療12周時(shí)的ALT、AST和DB的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ERG患者的年齡小于NERG（P=0.019），治療12周時(shí)的ALT （P=0.001）、AST （P=0.001） 和DB（P=0.043）高于NERG。其余指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 Peg-IFNα-2b治療CHB實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答的單因素分析Table 1 Univariate analysis of predictors for early response of Peg-IFNα-2b in the treatment of chronic hepatitis B

以單因素分析P＜0.05且專業(yè)上有意義的因素，如性別（1=男，2=女）、年齡、治療12周時(shí)的ALT、AST和DB為自變量，早期應(yīng)答（1=有，0=無）為因變量，進(jìn)行多因素logistic回歸分析，方法選擇逐步回歸法，進(jìn)入和排除標(biāo)準(zhǔn)分別為0.05和0.10。結(jié)果顯示性別、年齡以及治療12周時(shí)的AST是早期應(yīng)答的獨(dú)立影響因素。女性、年齡越小及治療12周時(shí)AST越高，其早期應(yīng)答發(fā)生的可能性越大（P＜0.05）。尚不能認(rèn)為治療12周時(shí)的ALT和DB對(duì)早期應(yīng)答的發(fā)生有影響（P＞0.10）。見表2。

2005年，紐約南區(qū)的聯(lián)邦檢察長發(fā)出傳票，指稱美國國會(huì)多數(shù)黨領(lǐng)袖比爾·傅利斯特 (Bill Frist)因涉嫌股票內(nèi)線交易而遭調(diào)查。傅利斯特出身心臟外科醫(yī)生，潔身自好，在朝野上下一度口碑甚佳，從政后也面臨著如何出污泥而不染的考驗(yàn)。盡管長達(dá)18個(gè)月的外查內(nèi)調(diào)后來無疾而終，這一事件對(duì)國會(huì)參、眾兩院的議員們都是一記不容忽視的警鐘。

表2 接受Peg-IFNα-2b治療CHB實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答的多因素logistic回歸分析Table 2 Multivariate logistic regression analysis of predictors for early response of Peg-IFNα-2b in the treatment of chronic hepatitis B

2.3 Peg-IFNα-2b治療早期外周血T淋巴細(xì)胞的分布及動(dòng)態(tài)變化

對(duì)采集的樣本進(jìn)行分組：健康對(duì)照（healthy control，HC，n=10） 組、CHB基 線 組（CHB/CHB 0周組，n=13）、實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答的患者標(biāo)本為ERG （不包括HBsAg清除時(shí)的血標(biāo)本，因?yàn)镠BsAg對(duì)于免疫功能存在抑制的作用[12]）以及未實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答的患者標(biāo)本為NERG；再根據(jù)已完成的療程分為：ERG 0周（n=8）和NERG 0周（n=5）、ERG 12周（n=16）和NERG 12周（n=12）、ERG 24周（n=8）和 NERG 24周（n=5）。通過流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)PBMC中的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞等進(jìn)行分析。見圖1。

圖1 外周血PBMC 流式分析圖Figure 1 Flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells

2.3.1 CD4+T細(xì)胞在治療早期外周血中的分布CD4+T細(xì)胞占總T細(xì)胞的百分比（CD4+T細(xì)胞百分比）在CHB組與HC組、ERG 0周與NERG 0周、ERG 12周與NERG 12周、ERG 0周與ERG 24周中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：CHB組高于HC組（P=0.025），ERG 0周高于NERG 0周（P=0.007），ERG 12周高于NERG 12周（P=0.006），ERG 0周同樣高于ERG 24周（P=0.012）。在整個(gè)治療早期（療程在24周內(nèi)），CD4+T細(xì)胞百分比在ERG中明顯下降，在NERG中緩慢上升，在其他各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 CD4+ T細(xì)胞在治療早期外周血中的分布Figure 2 The distribution of CD4+ T cells in peripheral blood at early stage of treatment

2.3.2 CD8+T細(xì)胞在治療早期外周血中的分布 CD8+T細(xì)胞占總T細(xì)胞的百分比（CD8+T細(xì)胞百分比）在CHB組與HC組、ERG 12周與NERG 12周、ERG 24周 與 NERG 24周、ERG 0周與ERG 24周中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：CHB組低 于 HC組（P=0.015），ERG 12周 低 于 NERG 12周（P=0.034），ERG 24周 高 于 NERG 24周（P=0.042），ERG 0周低于 ERG 24周（P=0.002）。在整個(gè)治療早期，CD8+T細(xì)胞百分比在ERG中明顯上升，在NERG中平緩或緩慢下降 。CD8+T細(xì)胞百分比在其他各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 CD8+ T細(xì)胞在治療早期外周血中的分布Figure 3 The distribution of CD8+ T cells in peripheral blood at early stage of treatment

2.3.3 CD4+/CD8+T細(xì)胞比值在治療早期的變化 CD4/CD8比值在CHB組與HC組、ERG 0周與NERG 0周、ERG 12周與NERG 12周、ERG 0周與ERG 24周中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：CHB組高于HC組（P=0.016），ERG 0周高于NERG 0周（P=0.030），ERG 12周同樣高于NERG 12周（P=0.026），ERG 0周 明 顯 高 于 ERG 24周（P=0.006）。在整個(gè)治療早期，CD4/CD8比值在ERG中呈明顯下降，在NERG中緩慢上升。但是CD4/CD8比值在其他各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 CD4/CD8比值在治療早期的變化Figure 4 The change of CD4+/CD8+ ratio at early stage of treatment

2.3.4 Treg細(xì)胞在治療早期外周血中的分布 Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比（Treg細(xì)胞百分比）在HC組與CHB組、ERG 24周與NERG 24周、NERG 0周與NERG 24周中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：CHB組高于HC組（P=0.025）、ERG 24周高于NERG 24周（P=0.002）、NERG 0周高于 NERG 24周（P=0.033）。在整個(gè)治療早期，Treg細(xì)胞百分比在ERG呈平緩或緩慢上升趨勢，在NERG則先平穩(wěn)后明顯下降，尤其是在治療12～24周時(shí)。Treg細(xì)胞百分比在其他各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 Treg細(xì)胞在治療早期外周血中的分布Figure 5 Distribution of Treg cells in peripheral blood at early stage of treatment

3 討論

要實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答，Peg-IFNα-2b的免疫調(diào)節(jié)功能也發(fā)揮著重要的作用。Fletcher等[16]通過在具有完全免疫能力的CHB動(dòng)物模型中研究重組IFNα確定了其免疫調(diào)節(jié)作用，而非直接的抗病毒活性，與治療反應(yīng)最密切相關(guān)，表明NK/T細(xì)胞的細(xì)胞溶解和非細(xì)胞溶解機(jī)制介導(dǎo)了對(duì)重組IFNα治療的抗病毒應(yīng)答。可見，T淋巴細(xì)胞在Peg-IFNα-2b抗HBV治療中的重要性。

然而，持續(xù)刺激引起的T細(xì)胞功能障礙或T細(xì)胞衰竭是多種慢性感染（如CHB）和癌癥中的一種免疫狀態(tài)[17]。CD8+T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起著核心作用，其特征在于大量擴(kuò)增并分化為細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞，以清除異常細(xì)胞或外來因子。耗盡的CD8+T細(xì)胞與其功能的逐漸受損有關(guān)，尤其是在細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和抗原消除中。本研究中CHB組CD4+T細(xì)胞百分比、CD4/CD8比值高于HC組，CD8+T細(xì)胞百分比低于HC組的結(jié)果反映出CHB患者CD8+T細(xì)胞的嚴(yán)重耗竭。

在Peg-IFN治療的早期（24周），CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4/CD8比值以及Treg細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化與早期應(yīng)答的實(shí)現(xiàn)密切相關(guān)。其中，CD8+T細(xì)胞占主導(dǎo)地位，在實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答的過程中其耗竭程度有所減輕，且與HBsAg的快速下降有關(guān)。CD8+T細(xì)胞在治療早期的上升趨勢以及因其上升而引起的CD4/CD8比值的下降預(yù)示著HBsAg快速下降的可能性，進(jìn)而預(yù)示著實(shí)現(xiàn)功能性治愈的可能性。Thimme等[18]也通過大猩猩模型證明了CD8+T細(xì)胞在控制HBV感染中的重要性。而治療前較高的CD4+T細(xì)胞百分比也是預(yù)測HBsAg快速下降的影響因素之一，雖然在隨后的治療中出現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于CD8+T細(xì)胞升高而導(dǎo)致的相對(duì)下降。至于Treg細(xì)胞百分比在ERG 24周中高于NERG 24周以及在NERG中出現(xiàn)下降趨勢（12～24周）可能的原因是負(fù)反饋調(diào)節(jié)。由于早期應(yīng)答的免疫活動(dòng)較不應(yīng)答活躍，反射性地引起免疫抑制細(xì)胞Treg細(xì)胞百分比的升高。同時(shí)，這也提示治療24周時(shí)Treg細(xì)胞的百分比對(duì)于預(yù)測Peg-IFN的療效有一定作用。總之，分析Peg-IFNα-2b治療期間宿主免疫功能的狀態(tài)，不能以單個(gè)指標(biāo)來做出判斷與決策，只有多指標(biāo)結(jié)合，分析整個(gè)治療過程中的動(dòng)態(tài)變化，才能更加準(zhǔn)確地判斷患者的免疫狀態(tài)并預(yù)測療效。本研究的不足在于重點(diǎn)關(guān)注了免疫細(xì)胞，卻未涉及相應(yīng)的細(xì)胞因子，對(duì)于免疫細(xì)胞功能的研究不夠徹底，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，女性、年齡越小、治療12周時(shí)的AST越高，則在Peg-IFN治療CHB早期實(shí)現(xiàn)HBV DNA及HBsAg快速下降的可能性越大。外周血T淋巴細(xì)胞的分布以及治療早期的動(dòng)態(tài)變化與CHB實(shí)現(xiàn)早期應(yīng)答密切相關(guān)。其中，CD8+T細(xì)胞占主導(dǎo)地位。治療早期CD8+T細(xì)胞百分比的升高以及因其升高而導(dǎo)致的CD4/CD8比值的下降可用來預(yù)測Peg-IFNα-2b的療效。本研究也在免疫學(xué)角度為后期對(duì)于實(shí)現(xiàn)功能性治愈的研究提供了理論依據(jù)。