威尼克何德霉感染14例

鄭文愛， 徐和平， 喬 鳳， 吳偉偉， 楊先旭， 唐小正， 林昌炎

威尼克何德霉（Hortaea werneckii）可引起皮膚角質(zhì)層感染，是傳統(tǒng)意義上的掌黑癬（tinea nigra）的致病菌。掌黑癬臨床表現(xiàn)為表面棕色到黑色無鱗片和不突起的斑疹，一般無自覺癥狀，主要影響手掌表面，也見其他部位感染的報(bào)道，包括足底、頸部和胸部，尚未發(fā)現(xiàn)感染指（趾）甲的文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 臨床資料來源

回顧性調(diào)查2016—2020年海南省第五人民醫(yī)院診斷為威尼克何德霉感染患者的診治經(jīng)過，對(duì)其人口學(xué)資料、臨床表現(xiàn)、治療和預(yù)后進(jìn)行分析。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)+實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。根據(jù)文獻(xiàn)[1]，掌黑癬患者臨床表現(xiàn)為發(fā)生于手掌、足跖或其他皮膚淺表、棕或黑色無鱗屑的斑疹。實(shí)驗(yàn)室檢查以皮屑組織檢測(cè)出威尼克何德霉即可確診。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.2.1 真菌鏡檢 取皮損處皮屑滴加10%氫氧化鉀溶液涂片和鈣白熒光染色鏡檢。

1.2.2 真菌培養(yǎng) 取皮損處皮屑或病甲屑接種于沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基上，25～28℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況和鏡下特點(diǎn)。見圖1。

圖1 威尼克何德霉的鏡下特征Figure 1 Microscopic morphology of Hortaea werneckii

1.3 藥敏試驗(yàn)

復(fù)蘇上述培養(yǎng)分離到的威尼克何德霉，經(jīng)分子生物學(xué)復(fù)核鑒定后作藥物敏感性試驗(yàn)。

1.3.1 分子生物學(xué)鑒定 菌株轉(zhuǎn)種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)5～7 d后，提取DNA進(jìn)行基因測(cè)序。引物ITS1：5'-CGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4 ：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，由北京睿博興科生物技術(shù)公司合成。擴(kuò)增體系：2×Taq Mix 15 μL，ITS1、ITS4（3.2×10-5mol/L）各 0.5 μL，模板 2 μL。PCR 參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。用 3730x1DNA analyzer 測(cè)序儀（ABI公司） 進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果經(jīng)基因庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比對(duì)。

1.3.2 藥物敏感試驗(yàn) 菌株于PDA培養(yǎng)5～7 d后，用肉湯微量稀釋法測(cè)定特比萘芬、伊曲康唑、伏立康唑、氟康唑、酮康唑MIC值，操作方法按CLSI M38-A2 和M27-A3標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料

2.1.1 人口學(xué)資料 共14例威尼克何德霉感染患者，男8例，女6例。其中8例為1～12歲的兒童，6例為成人，年齡在28～58歲。所有患者均否認(rèn)家族中有類似患者。

2.1.2 臨床表現(xiàn) 8例為掌黑癬患者，1例為大腿皮膚感染，5例為甲真菌病患者。掌黑癬患者單側(cè)手掌有單個(gè)或多個(gè)綠豆至黃豆大不規(guī)則黑褐色斑，顏色不均，部分融合成片，邊界較清楚，表面無鱗屑，不高出皮面，其后黑斑逐漸增大成片（見圖2）。甲真菌病患者均有不同程度的甲損壞和色素沉著，甲損壞均屬于遠(yuǎn)端（側(cè)緣）甲下型（distal lateral subungual onychomycosis，DLSO）， 甲 板遠(yuǎn)端脆裂、分離，呈棕黑色，甲下大量碎屑。

圖2 掌黑癬的臨床表現(xiàn)Figure 2 Clinical manifestations of tinea nigra

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.2.1 分子生物學(xué)鑒定 14株菌株經(jīng)測(cè)序，結(jié)果比對(duì)均為威尼克何德霉，鑒定符合率為100%。

2.2.2 藥物敏感試驗(yàn) 菌株按CLSI M38-A2和M27-A3標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)MIC值，見表1。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示5種抗真菌藥物的MIC幾何均值為：伊曲康唑0.065 7 mg/L，伏立康唑0.036 3 mg/L，特比萘芬0.038 1 mg/L，酮康唑0.048 8 mg/L，氟康唑3.281 3 mg/L。

表1 14株威尼克何德霉對(duì)5種抗真菌藥物的敏感性Table 1 Susceptibility of 14 strains of Hortaea werneckii to 5 antifungal agents

2.3 治療和轉(zhuǎn)歸

掌黑癬患者外用萘替芬酮康唑乳膏或鹽酸特比萘芬乳膏，每日2次，5～7 d后皮損完全消退。甲真菌病患者口服伊曲康唑，每日1粒，連服7 d，停藥三周，重復(fù)執(zhí)行三個(gè)療程，同時(shí)萘替芬酮康唑乳膏和鹽酸阿莫羅芬擦劑交替外用，每日1次。5例甲真菌病患者只有1例痊愈，另外4例癥狀有一定改善，但在觀察的3個(gè)療程內(nèi)療效不明顯。14株威尼克何德霉感染者的臨床特征和治療情況見表2。

表2 14株威尼克何德霉感染的臨床特征和治療情況Table 2 Summary of clinical characteristics and treatment of 14 cases of Hortaea werneckii infection

3 討論

威尼克何德霉過去曾歸屬于枝孢霉，1984年，Nishimura和 Miyaji提 議 將Cladosporium wetneckii歸為何德菌屬（Hortaea），因其同時(shí)存在合軸產(chǎn)孢和環(huán)痕產(chǎn)孢。1992年，教科書所列名為威尼克外瓶霉（Exophiala werneckii）[2]。但最近真菌分類引入分子分類和系統(tǒng)進(jìn)化等手段，國(guó)際權(quán)威的真菌分類mycobank網(wǎng)站將其分類地位重新定位為子囊菌門 （Ascomycota）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、煤炱目 （Capnodiales）、畸球腔菌科（Teratosphaeriaceae）、何德菌屬（Hortaea）[2]。威尼克何爾德霉生長(zhǎng)緩慢，初為酵母樣菌落，表面光滑黏稠，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)（超過1周），菌落表面氣生菌絲逐漸豐富，顏色變?yōu)殚蠙旌谏３墒旌缶z暗色有隔、厚壁，產(chǎn)孢細(xì)胞在菌絲間生或頂生，分生孢子常為單或雙細(xì)胞，有明顯分隔，圓柱形或紡錘形，初為透明，后逐漸轉(zhuǎn)化成為淺橄欖色，合軸方式排列，可出芽最后轉(zhuǎn)化成厚壁孢子團(tuán)。

威尼克何德霉是嗜鹽的暗色真菌[3]。環(huán)境中廣泛存在，包括土壤、下水道、腐爛的植物、腐殖土、木棍、咸味發(fā)霉的魚等，主要出現(xiàn)在富含鹽分的海灘上[4]。國(guó)外報(bào)道中，從海水、潛水裝置、游泳池、植物、住宅及寵物中分離出威尼克何德霉[5-6]。該菌是引起掌黑癬的經(jīng)典病原菌，國(guó)內(nèi)外都有病例報(bào)道，海南島也報(bào)道過該菌引起的兒童掌黑癬[7]。此病主要流行于熱帶、亞熱帶，如南美洲、非洲等，中國(guó)以長(zhǎng)江以南為主要發(fā)病地域[8]。而中國(guó)海南島熱帶、亞熱帶的氣候，和四面環(huán)海的地理位置正是威尼克何德霉生存的溫床。何德霉所引起的手掌病變是色素沉著，邊緣不齊，通常單側(cè)。其損害似乎與免疫系統(tǒng)和遺傳易感性無關(guān)。大多數(shù)患者都有多汗癥條件[4]，家庭成員之間一般不會(huì)互相傳染。本文所報(bào)道的14株威尼克何德霉中有8株分離自掌黑癬患者的皮損處，其中7株分離自7例1～6歲患兒，均居住在靠海岸的城市，孩子有沙灘或其他地方玩沙土的經(jīng)歷，否認(rèn)有外傷史；另1株分離自1名海南島女導(dǎo)游，也經(jīng)常接觸沙灘、海水。

威尼克何德霉除了引起掌黑癬外，也可以引起身體其他部位的病變，如胸部、足底、手指等[9-11]。本文有1株菌分離自左大腿根部有褐色皮損處；另有5株菌分離自甲真菌病患者，其中2例真菌直接鏡檢陰性。與掌黑癬患者不同之處是，甲真菌病的患者多數(shù)是29～58歲的成年人。因未檢索到國(guó)內(nèi)外關(guān)于威尼克何德霉致甲真菌病的病例報(bào)道，本研究的5例甲真菌病患者均進(jìn)行甲病理活檢以確證，成年人活動(dòng)范圍廣，有甲損壞的人員有可能因接觸或是寄生于病甲的污染菌引起的繼發(fā)感染。而甲真菌病常見的致病真菌是皮膚癬菌和酵母，加之療效觀察時(shí)間較長(zhǎng)，所以單憑真菌直接鏡檢和培養(yǎng)（尤其是直接鏡檢陰性結(jié)果）不能完全肯定或排除為威尼克何德霉引起的甲真菌病，必要時(shí)需行甲病理檢查。

對(duì)于威尼克何德霉導(dǎo)致的淺部真菌感染，常見的抗真菌藥物大部分均有效，可以經(jīng)驗(yàn)使用，臨床工作中不必等待藥敏試驗(yàn)來指導(dǎo)臨床用藥。但對(duì)于威尼克何德霉感染而療效不明顯的患者，建議臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)。威尼克何德霉早期表現(xiàn)為黑酵母的菌落，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸變?yōu)榻z狀真菌，對(duì)于該菌的藥敏試驗(yàn)?zāi)壳吧袩o統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有用CLSI M27-A3酵母類的試驗(yàn)方法[12-13]，也有用CLSI M38-A2 絲狀真菌類的肉湯稀釋法[14]，測(cè)定抗真菌藥物的MIC值，本研究為了對(duì)比不同的藥敏試驗(yàn)方法對(duì)測(cè)定的MIC是否存在差異，特意對(duì)所有的菌株均同時(shí)使用CLSI M27-A3和CLSI M38-A2的方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的結(jié)果顯示，除了少數(shù)菌株對(duì)個(gè)別抗真菌藥物的MIC值有1～2個(gè)倍比的差異外，絕大部分均相同。由于菌株數(shù)少，暫看不出兩種方法測(cè)定威尼克何德霉對(duì)常用抗真菌藥物MIC值方面的差異，鑒于威尼克何德霉在人體致病狀態(tài)是菌絲相，所以應(yīng)該采用絲狀真菌的藥敏試驗(yàn)方法來測(cè)定抗真菌藥物的MIC值。本研究在參照CLSI M38-A2肉湯微量稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)，威尼克何德霉在藥敏板中生長(zhǎng)終點(diǎn)十分清晰，未見明顯的拖尾現(xiàn)象，容易判斷結(jié)果，是適合臨床使用的方法。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬對(duì)威尼克何德霉的MIC值均較低，氟康唑?qū)€(gè)別菌株的體外活性低（Z-0497患者分離菌株，64 mg/L），結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道相符[12,14-15]。威尼克何德霉所致掌黑癬或軀干部位的皮損治療一般比較簡(jiǎn)單，首選外用抗真菌制劑，如酮康唑軟膏、特比萘芬乳膏，可聯(lián)合角質(zhì)剝脫劑，無需系統(tǒng)治療[16]。但如果引起甲損壞等局部用藥不能解決的問題時(shí)，應(yīng)該系統(tǒng)用藥。本研究中皮膚感染的患者外用以上藥物乳膏，效果顯著，說明這五種抗真菌藥物目前仍適用于本地威尼克何德霉感染的治療。