FMDV全ORF編碼基因的克隆及其腺病毒載體的構(gòu)建

高 鵬，李志勇，柳紀(jì)省

口蹄疫（foot?and?mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒所引起的豬牛羊等偶蹄動(dòng)物的一種急性熱性傳染病，人也可以感染，屬于一種人畜共患的傳染?。?］。該病傳播途徑廣、速度快，眾多經(jīng)濟(jì)動(dòng)物都是其易感宿主，已經(jīng)多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，給很多國(guó)家造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health，OIE）已將其列為A類(lèi)傳染病之首［2］。目前，有三分之二的OIE成員國(guó)流行FMD，時(shí)刻威脅著無(wú)FMD國(guó)家和地區(qū)的家畜安全和畜產(chǎn)品貿(mào)易。在FMD流行地區(qū)，F(xiàn)MD的預(yù)防和控制主要依賴(lài)常規(guī)FMD滅活疫苗［3］，F(xiàn)MD疫苗在預(yù)防和控制，乃至根除 FMD過(guò)程中發(fā)揮重要作用。商品化的FMD疫苗大多是化學(xué)滅活苗，該疫苗的主要抗原成份為病毒衣殼蛋白（146s），主要依靠體液免疫發(fā)揮其作用，而細(xì)胞免疫和非結(jié)構(gòu)蛋白免疫作用往往被忽視［4］。此外，商品滅活疫苗存在免疫持續(xù)期短的缺點(diǎn)，并且在其生產(chǎn)過(guò)程中存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)［5］，已成為現(xiàn)階段許多科研人員關(guān)注和解決的問(wèn)題。

口蹄疫保護(hù)性免疫中細(xì)胞免疫參與免疫應(yīng)答提高免疫保護(hù)率的機(jī)理仍然不清楚，但是現(xiàn)在已有很多研究間接發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒（foot?and?mouth disease virus，F(xiàn)MDV）非結(jié)構(gòu)蛋白在免疫方面有不可忽視的作用，有可能顯著提高現(xiàn)有口蹄疫疫苗的免疫效果［6，7］。 Moraes 等［8］利用表達(dá)口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）2B的腺病毒載體疫苗免疫牛，發(fā)現(xiàn)FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白2B能夠顯著提高腺病毒載體疫苗誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞應(yīng)答的能力，最終提高腺病毒載體疫苗的保護(hù)率。近年來(lái)在免疫動(dòng)物的血清中也檢測(cè)到3A抗體，其原因可能是在3A蛋白上存在誘導(dǎo)特異性反應(yīng)的抗原位點(diǎn)［9，10］。 鄭海學(xué)等［11］通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建了與野生型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因相同、而非結(jié)構(gòu)蛋白和前導(dǎo)蛋白不同的重組病毒，作為抗原免疫豚鼠后，在抗原劑量相同的條件下，重組含非結(jié)構(gòu)蛋白的病毒抗原更能有效誘導(dǎo)CD8＋T細(xì)胞亞群，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生效果更好并且攻毒后保護(hù)效率更高。此外，在FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白上鑒定出的一系列的T細(xì)胞表位，進(jìn)一步證明非結(jié)構(gòu)蛋白在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫方面具有不可忽視的作用。

諸多研究表明，腺病毒活載體疫苗可以補(bǔ)救滅活苗較多存在的缺陷，以腺病毒載體表達(dá)口蹄疫病毒免疫原性基因具有較好的應(yīng)用前景［12，13］。利用FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因的不同組合以表達(dá)病毒的空衣殼已經(jīng)成為現(xiàn)階段研究的焦點(diǎn)［14］，并且已經(jīng)取得了很多進(jìn)展，比如P1和3C蛋白酶基因在痘病毒、桿狀病毒和腺病毒等表達(dá)系統(tǒng)中可產(chǎn)生少量的空衣殼［15，16］。

研究構(gòu)建含有編碼FMDV全目的基因的腺病毒載體可以將FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞免疫和體液免疫方面的作用發(fā)揮到最大。本研究成功構(gòu)建了以O(shè)型口蹄疫病毒ON毒株的全ORF編碼基因（包括 L、P1、P2、P3基因）為外源基因的重組腺病毒載體，以期提高FMDV空衣殼的組裝效率及其體液免疫和細(xì)胞免疫的整體免疫效力，為FMD復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗的研制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 毒株 ON毒株（O型口蹄疫病毒的當(dāng)今疫苗用毒株），為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所傳染病室保存的牛源O型FMDV毒株。

1.1.2 載體和菌種 pMD＠19?T Simple Vector與大腸桿菌JM109感受態(tài)購(gòu)自TaKaRa公司，腺病毒穿梭載體 pAdTrack?CMV、骨架載體 pAdeasy?2和FMDV培養(yǎng)用細(xì)胞系BHK?21等均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所傳染病室保存，DH10B感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海杰美生物公司。

1.1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit為 QIAGEN公司產(chǎn)品；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、PrimeSTAR＠GXL DNA Polymerase和DNA Marker為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶 NotⅠ、Eco RⅤ、PacⅠ和 PmeⅠ，T4 DNA連接酶和堿性磷酸酶為NEB公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 口蹄疫病毒RNA的獲取 按照經(jīng)典方法在P3等級(jí)實(shí)驗(yàn)室將O型FMDV的ON疫苗毒株接種到BHK?21細(xì)胞中至細(xì)胞病變，收集病毒置－70℃保存待用。然后按QIAGEN公司RNA提取試劑盒的說(shuō)明，從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取口蹄疫病毒RNA。以上涉及口蹄疫病毒的實(shí)驗(yàn)均在蘭州獸醫(yī)研究所P3等級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增與克隆 將提取的病毒總RNA通過(guò)MMLV反轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA。參考GenBank中O型口蹄疫病毒的相關(guān)序列，分別用Primer5.0、Clustal、DNAStar軟件進(jìn)行序列比對(duì)設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。以cDNA為模板，P1、P2為引物通過(guò)高保真性PrimeSTAR＠GXL DNA Polymerase擴(kuò)增ORF基因，以確保整個(gè)ORF遺傳信息的完整無(wú)缺。PCR擴(kuò)增條件為98℃ 2 min；98℃ 30 s，68℃ 7 min，36 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用10 g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定及回收。然后將回收產(chǎn)物與高效克隆載體 pMD＠19?T Simple Vector連接后（本實(shí)驗(yàn)選擇的高保真DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物是平滑末端，與T載體連接前，需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行加脫氧腺嘌呤核苷酸接頭反應(yīng)），用熱激法轉(zhuǎn)化JM109菌株，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、PCR鑒定與酶切鑒定得到陽(yáng)性克隆，命名為pMD＠19?T Simple／ORF。 將陽(yáng)性克隆菌種送蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 目的基因的PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR primer designed for target gene amplification.

1.2.3 目的基因序列測(cè)定結(jié)果的分析 用NCBI中的 Blast、MEGA5、DNAMAN 和 DNAStar等軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列比較和分析。

1.2.4 重組腺病毒穿梭載體的獲得 根據(jù)張興旺等［17］的實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)內(nèi)切酶 NotⅠ和 Eco RⅤ雙酶切將ORF定向插入穿梭載體。轉(zhuǎn)化和篩選陽(yáng)性克隆方法同步驟1.2.2。采用酶切、PCR擴(kuò)增等方法鑒定，得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pAdTrack?CMV／ORF。將陽(yáng)性克隆送蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，以確保所構(gòu)建的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒讀碼框正確。

1.2.5 細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒

先將骨架載體pAdEasy?2電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，制備攜帶腺病毒骨架載體的電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌，電擊條件為：2.5 kV，200 Ω，25 μF。 再將重組穿梭載體 pAdTrack?CMV／ORF經(jīng)限制性內(nèi)切酶PmeⅠ線性化后電擊轉(zhuǎn)化自制感受態(tài)菌中。電轉(zhuǎn)后將感受態(tài)菌在LB培養(yǎng)液中于37℃復(fù)蘇30 min，取適量菌液涂入含50 mg／mL卡那霉素的培養(yǎng)板中，于37℃溫箱培養(yǎng)20 h，挑選單克隆菌落［18］。 用3 mL含有 50 mg／mL卡那霉素的 LB培養(yǎng)液在搖床上37℃培養(yǎng)12 h，小量提取質(zhì)粒DNA，用8 g／L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳遷移率分析，并用PacⅠ進(jìn)行限制性內(nèi)切酶圖譜分析。將所得的陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒以上述同樣條件電擊轉(zhuǎn)化入宿主菌DH10B，在此宿主菌中可獲得大量高質(zhì)量的質(zhì)粒，并且在該菌內(nèi)不會(huì)再發(fā)生同源重組，將此質(zhì)粒命名為pAd?ORF。將陽(yáng)性克隆送蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1 結(jié)果與分析

2.1 FMDV 的細(xì)胞病變

將FMDV接種于BHK?21細(xì)胞上，接毒細(xì)胞在10～11 h出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、變圓，16～20 h則形成FMDV典型的葡萄狀細(xì)胞病變（圖1B，彩圖見(jiàn)封三圖版），未接毒細(xì)胞對(duì)照正常生長(zhǎng)（圖1A）。

圖1 病變BHK?21細(xì)胞的觀察Fig.1 BHK?21 cells infected by FMDV.

2.2 目的基因的擴(kuò)增與克隆載體的鑒定

取病毒cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物ORF大小約為6.9 kb，與ORF的理論大小相同（圖2）。將目的基因克隆到pMD＠19?T Simple載體上，通過(guò)PCR檢測(cè)、酶切鑒定（圖3）和測(cè)序驗(yàn)證，得到含有正確插入片段的重組質(zhì)粒pMD＠19?T Simple／ORF。

2.3 重組腺病毒穿梭載體的的制備和鑒定

通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)后通過(guò)卡那霉素培養(yǎng)板進(jìn)行篩選，挑選16個(gè)最小的單克隆菌落（圖4，彩圖見(jiàn)封三圖版）進(jìn)行培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，選取滯后的條帶進(jìn)行PCR檢測(cè)和酶切鑒定。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增出約6 969 bp的目的條帶，用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和Eco RⅤ酶雙酶切得到約9 194 bp和6 969 bp的條帶（圖5），與理論預(yù)計(jì)相符，說(shuō)明目的基因正確連到了穿梭載體上。再經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，得到含有正確目標(biāo)基因讀碼框的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack?CMV／ORF。

圖2 病毒cDNA的PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification product of virus cDNA.

圖 3 重組質(zhì)粒 pMD＠19?T Simple／ORF 的 PCR檢測(cè)及酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pMD＠ 19?T Simple／ORF by PCR amplification and restriction enzymes digestion.

2.4 重組腺病毒質(zhì)粒的鑒定

圖4 同源重組陽(yáng)性克隆菌的菌落形態(tài)選擇Fig.4 Colony morphology screening of potential adenovirus recombinants after homologous recombination in AdEasier cells.

圖5 重組質(zhì)粒pAdTrack?CMV／ORF的PCR檢測(cè)及酶切鑒定Fig.5 Identification of recombinant plasmid pAdTrack?CMV／ORF by PCR amplification and restriction enzymes digestion.

對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒pAd?ORF使用PacⅠ進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶顯示兩條帶，一條帶是30 kb左右的大帶，另一條是4 500 bp的小帶，與理論重組腺病毒質(zhì)粒大小相符；用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)目的基因，電泳顯示擴(kuò)增出約6 969 bp的條帶（圖6），表明該質(zhì)粒pAd?ORF含有目的基因片段。測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果顯示，重組腺病毒質(zhì)粒pAd?ORF攜帶正確的FMDV毒株全ORF編碼基因，表明含有完整編碼基因表達(dá)盒的重組腺病毒質(zhì)粒pAd?ORF構(gòu)建成功。

2.5 序列比對(duì)結(jié)果

圖6 重組腺病毒質(zhì)粒的PCR檢測(cè)和PacⅠ酶切鑒定Fig.6 Identification of recombinant adenovirus plasmids by PCR amplification and PacⅠdigestion.

每一步測(cè)序之后都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的生物學(xué)軟件分析（Blast、MEGA5、DNAstar和DNAMAN等），NCBI中 Blast分析其與 O／GSLX／2010、O／SKR／2000 和O strain Yangju的相似性都在 99%以上；經(jīng)MEGA5分析，插入目的基因的讀碼框都可以正常翻譯，突變位點(diǎn)不影響目的蛋白的表達(dá)及活性。

3 討論

活載體疫苗是近年來(lái)基因工程疫苗的研究熱點(diǎn)之一，被廣泛地認(rèn)為是一種很具開(kāi)發(fā)前景的基因工程疫苗。而腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因具有高效率、低致病性、高滴度以及在體內(nèi)不整合入宿主細(xì)胞染色體等優(yōu)點(diǎn)，已被認(rèn)為是最有效的轉(zhuǎn)基因載體之一，并廣泛應(yīng)用于各種活載體疫苗的研制［19］。構(gòu)建編碼FMDV抗原的腺病毒載體是研制FMD活載體疫苗的前提。重組腺病毒載體的構(gòu)建方法及腺病毒載體系統(tǒng)有很多種，可以根據(jù)需要采用不同的表達(dá)系統(tǒng)及方法。例如根據(jù)包裝容量大小、根據(jù)啟動(dòng)子和報(bào)告基因的不同等選擇適合的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，具體特點(diǎn)如表2所示［20］。

本研究選擇了pAd?Track CMV作為穿梭質(zhì)粒，其中插入的GFP報(bào)告基因有利于重組腺病毒的檢測(cè)和效價(jià)測(cè)定；使用CMV高效啟動(dòng)子［21］，更有利于目的基因的表達(dá)。由于不同腺病毒表達(dá)系統(tǒng)的包裝能力相差比較大，并且本研究中所插入的片段較大，需要一個(gè)包裝能力較高的系統(tǒng)來(lái)包裝表達(dá)整個(gè)ORF，所以我們選擇了pAdEasy?2作為骨架載體來(lái)提高腺病毒系統(tǒng)包裝能力，以確保本研究所構(gòu)建的含有口蹄疫全長(zhǎng)ORF基因的腺病毒載體能在后續(xù)工作中順利地包裝出帶有口蹄疫全長(zhǎng)ORF基因的復(fù)制缺陷型腺病毒。之前的一些文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)和研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，使用pAdEasy?1作為骨架載體對(duì)于包裝大的基因片段存在包裝能比較弱的問(wèn)題，因此，我們選擇的系統(tǒng)可以較好地彌補(bǔ)這一缺陷。

表2 腺病毒表達(dá)系統(tǒng)特征Table 2 The characteristics of vector systems.

在真核細(xì)胞諸多影響蛋白翻譯表達(dá)的因素中，Kozak序列 GCCACCAUGG的作用尤為重要［22］，本研究為了進(jìn)一步提高目的基因在真核表達(dá)中的表達(dá)效率，研究設(shè)計(jì)引物時(shí)添加了Kozak序列GCCACCATGG以提高外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)，從而為后期FMDV的腺病毒缺陷活載體疫苗免疫水平的提高打下基礎(chǔ)。

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FMDV空衣殼和口蹄疫病毒粒子一樣也存在線性及構(gòu)象位點(diǎn)，抗空衣殼的血清具有血清型特異性［23］，與抗病毒粒子的血清相同，說(shuō)明空衣殼的免疫原性和完整病毒粒子的免疫原性相同，提示FMDV空衣殼可用于模擬病毒粒子的免疫性。并且非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)免疫應(yīng)答的影響已經(jīng)越來(lái)越引起廣大科研者的重視，諸多研究表明完整的非結(jié)構(gòu)蛋白在免疫應(yīng)答中有重要作用［21］，尤其是對(duì)免疫應(yīng)答中的細(xì)胞免疫水平有顯著影響。本研究中考慮到整體非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)免疫應(yīng)答的影響，所以大膽地構(gòu)建了口蹄疫完整的ORF編碼區(qū)的重組腺病毒載體，使后期免疫中能盡可能地表達(dá)所有口蹄疫病毒的抗原表位，從而刺激宿主產(chǎn)生更全面的細(xì)胞免疫和體液免疫。這對(duì)提高FMD常規(guī)疫苗免疫水平、延長(zhǎng)免疫持續(xù)期具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)選擇了當(dāng)前口蹄疫流行的疫苗生產(chǎn)用O型毒株－ON毒株，與之前一些研究中選擇的毒株相比更切合實(shí)際，較好地與現(xiàn)階段的生產(chǎn)實(shí)際相聯(lián)系，可以更好地為目前口蹄疫流行毒株的疫苗研究提供有力幫助，為更好地跟進(jìn)實(shí)際生產(chǎn)做好鋪墊。并且在前人的基礎(chǔ)上改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)方法，選擇了更搭配的包裝載體系統(tǒng)。構(gòu)建了以FMDV ON毒株全ORF編碼的基因（包括 L、P1、P2、P3基因）為外源基因的重組腺病毒載體，為FMDV復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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