基因拆分技術(shù)的理論基礎(chǔ)及其在限控轉(zhuǎn)基因飄流中的應(yīng)用

董玉鳳， 王旭靜， 唐巧玲， 王志興

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的問世給世界帶來了經(jīng)濟(jì)、社會、生態(tài)等多方面的效益，成為新一代綠色革命的利器，是農(nóng)業(yè)近代史上發(fā)展最快的新技術(shù)［1］。國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)2013年報(bào)告指出，全球有27個(gè)國家種植了轉(zhuǎn)基因作物，種植面積比2012年增加了500萬hm2。自1996年種植以來的18年間，從最初的170 萬 hm2增加到 1.75 億 hm2［2］，增長速度驚人。可見，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展呈現(xiàn)不可阻擋的趨勢。但隨著該技術(shù)的發(fā)展，其安全性問題備受矚目，其中花粉介導(dǎo)的基因飄流及其可能引起的環(huán)境后果是人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。研究者們?yōu)榻档娃D(zhuǎn)基因向其他物種的飄流做過許多嘗試，包括物理隔離和眾多生物學(xué)措施，各種措施因物種和基因本身等性質(zhì)有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)［3，4］，目前尚未明確哪種措施最簡單有效，且具有通用性。

基因拆分技術(shù)是建立在內(nèi)含肽intein及其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，將目的基因拆分成兩個(gè)片段，分別與intein兩個(gè)剪接域的基因序列結(jié)合，形成融合基因，翻譯后形成的兩個(gè)融合蛋白通過intein介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接功能，將intein從前體蛋白中切除，同時(shí)將兩個(gè)基因片段編碼的蛋白質(zhì)序列連接起來，形成一個(gè)完整的、有功能的蛋白質(zhì)［4］?；虿鸱旨夹g(shù)的提出為通過生物學(xué)措施控制轉(zhuǎn)基因飄流提供了新的思路和途徑。

1 基因拆分技術(shù)的理論基礎(chǔ)

1.1 Intein的概念及分類

內(nèi)含肽intein是存在于蛋白質(zhì)前體中的一段氨基酸序列，與兩側(cè)的外顯肽(extein)存在于同一個(gè)表達(dá)框中，同時(shí)表達(dá)成前體蛋白，在前體蛋白成熟的過程中，intein通過自剪接的方式將自身從中切除出去，同時(shí)將兩端的外顯肽以肽鍵的形式連接起來，該過程也被稱為蛋白質(zhì)的自我剪接［5］。與RNA內(nèi)含子(intron)類似，蛋白質(zhì)內(nèi)含肽屬于可以移動的遺傳元件，內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)發(fā)生于蛋白質(zhì)水平，而且反應(yīng)過程不需要任何輔助因子的參與(圖1)［6］。

圖1 intein與intron作用方式比較［6］Fig.1 Comparison of function model bewteen intein and intron.

1990年，intein首次在研究釀酒酵母液泡H+-ATPase 基因 TGPl時(shí)被發(fā)現(xiàn)［7，8］。其后的 20幾年里，intein的研究和應(yīng)用發(fā)展非常迅速。截至2010 年，在 Inbase(http://tools.neb.com/inbase/list.php)數(shù)據(jù)庫中注冊的內(nèi)含肽達(dá)585個(gè)，其中112個(gè)在真核生物中，290個(gè)在細(xì)菌中，另外183個(gè)屬于古細(xì)菌。目前僅在單細(xì)胞真核生物中發(fā)現(xiàn)intein，而在高等動、植物，甚至低等多細(xì)胞真核生物中都沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)含肽的存在。

關(guān)于內(nèi)含肽的分類有很多說法，常見的是根據(jù)內(nèi)含肽中間結(jié)構(gòu)域的類型將內(nèi)含肽分為經(jīng)典內(nèi)含肽、微小內(nèi)含肽和斷裂內(nèi)含肽［9］。經(jīng)典內(nèi)含肽的中間結(jié)構(gòu)域?yàn)闅w巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，微小內(nèi)含肽的中間結(jié)構(gòu)域僅為一個(gè)連接結(jié)構(gòu)域，而斷裂內(nèi)含肽在中間結(jié)構(gòu)域的特定位點(diǎn)斷開，在基因組中不同的位置獨(dú)立表達(dá)。經(jīng)典內(nèi)含肽與微小內(nèi)含肽的中間結(jié)構(gòu)域有共價(jià)連接，因此也叫做順式剪接內(nèi)含肽(cis-splicing intein);斷裂內(nèi)含肽的中間結(jié)構(gòu)域無共價(jià)鍵連接，也叫做反式剪接內(nèi)含肽(trans-splicing intein)。Ssp DnaE內(nèi)含肽(Synechocystis sp.PCC6803 DnaE intein)是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)天然存在的斷裂內(nèi)含肽，存在于編碼DNA聚合酶Ⅲ的催化亞基α的DnaE基因中，包括123個(gè)氨基酸殘基的In(Intein N端)和36個(gè)氨基酸殘基的Ic(Intein C端)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，In和Ic在基因組上相距745 kb［10］。與人工合成的 intein相比，DnaE intein催化的蛋白質(zhì)剪接具有反應(yīng)效率高和反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明Ssp DnaE intein在離體、活體條件下均能進(jìn)行蛋白質(zhì)的剪接反應(yīng)［11］，使分開的兩個(gè)基因片段表達(dá)后的蛋白質(zhì)片段重新組裝成有功能的完整蛋白質(zhì)。

眾多研究證明，內(nèi)含肽的自我剪接并不依賴于其兩側(cè)外顯肽的種類［12，13］，也就是說，當(dāng)外顯肽被外源蛋白質(zhì)替換掉時(shí)，該剪接作用依然可以發(fā)生［14］。同時(shí)，內(nèi)含肽自剪接反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的，甚至可以在體外進(jìn)行［5，10，13，15，16］。這給利用intein進(jìn)行更多的蛋白質(zhì)工程和植物基因工程研究提供了嶄新的思路。

1.2 Intein的剪接機(jī)制

根據(jù)內(nèi)含肽的保守性及其特點(diǎn)，多數(shù)內(nèi)含肽被分為10個(gè)模塊，從N端到C端依次是存在于N端的A、N2、B和N4，位于核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的C、D、E和H，以及位于 C端的 F和 G。經(jīng)研究，普遍認(rèn)為A、B、F和G是intein維持結(jié)構(gòu)或進(jìn)行剪接反應(yīng)所必需的［17］。在對眾多intein的保守性氨基酸的研究中發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)高度保守的位點(diǎn)對intein剪接功能有重要作用，包括:A∶1位置的Ser、Thr或Cys;G末端的 Asn;C-extein的第一氨基酸Ser、Thr或Cys，以及intein的倒數(shù)第二個(gè)氨基酸 His［17，18］。后來的研究也認(rèn)為 B∶10 位的 His對剪接過程也有很重要的影響［12，18］。目前對內(nèi)含肽的剪接機(jī)制已經(jīng)研究的非常透徹，普遍認(rèn)為內(nèi)含肽的自我剪接分為四個(gè)階段［12］，分別是:①N-X?；D(zhuǎn)移反應(yīng)(X代表O原子或S原子，后同):這是第一個(gè)?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，A∶1位的S或O原子攻擊其上游肽鍵的C原子，使N端的外顯肽轉(zhuǎn)移到N端剪接域的Ser氧原子或Cys硫原子上，形成帶有酯鍵或硫酯鍵的中間產(chǎn)物。大多數(shù)intein N端的第一個(gè)氨基酸殘基為Cys或Ser。②轉(zhuǎn)酯反應(yīng):C端剪接域的親核殘基攻擊N端在第一步形成的酯鍵或硫酯鍵，進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，至此，N-extein轉(zhuǎn)移到C端剪接域的Ser(Thr)的O原子或Cys的S原子上，C端剪接域的第一個(gè)氨基酸殘基可以是Cys、Ser或Thr。③Asn環(huán)化反應(yīng):C端剪接域的Asn環(huán)化使內(nèi)含肽與C-extein之間發(fā)生斷裂，將內(nèi)含肽剪切下來。④X-N?；D(zhuǎn)移反應(yīng):這是第二個(gè)?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，通過酯鍵或硫酯鍵連接的兩個(gè)extein經(jīng)過重排形成肽鍵，內(nèi)含肽脫離，形成成熟蛋白質(zhì)。

1.3 Intein衍生的新技術(shù)

內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)和研究給蛋白質(zhì)工程研究提供了眾多便利條件。利用內(nèi)含肽的剪接作用，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化［19］、表達(dá)蛋白的連接(EPL)［20，21］、蛋白質(zhì)的環(huán)化［22，23］、毒蛋白的大量合成［24，25］，以及多聚體蛋白合成［26］等。在人們廣泛關(guān)注的轉(zhuǎn)基因安全問題中更是具有巨大的潛力［27］。利用基因拆分技術(shù)將外源基因在植物體內(nèi)拆分表達(dá)后再組裝成有功能的蛋白，在很大程度上限制了該基因向近緣物種的飄流，基因拆分技術(shù)的研究很可能為安全轉(zhuǎn)基因提供強(qiáng)大的技術(shù)支撐。

2 基因拆分技術(shù)在限控轉(zhuǎn)基因飄流中的應(yīng)用

斷裂內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)為利用基因拆分技術(shù)限控轉(zhuǎn)基因飄流提供了有用的工具。但基因拆分技術(shù)能否作為一項(xiàng)有效措施用于限控轉(zhuǎn)基因飄流，這取決于基因拆分后在植物體內(nèi)重新組裝成有功能蛋白質(zhì)的效率及限控轉(zhuǎn)基因飄流的效果。

2.1 基因拆分后在植物體內(nèi)的重新組裝效率

Chin等［28］把耐除草劑基因epsps分成N端和C端兩部分，N端與葉綠體定位信號和Ssp DnaE intein的In融合形成 EPSPSn-In，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將EPSPSn-In整合到煙草核基因組中;C端與 Ssp DnaE intein的Ic融合形成 Ic-EPSPSc，利用基因槍法將Ic-EPSPSc整合到含有EPSPSn-In煙草的葉綠體基因組中。結(jié)果同時(shí)含有EPSPSn-In和Ic-EPSPSc的轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出了抗草甘膦的特性，證明了intein介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)剪接可以在植物葉綠體中發(fā)生。Yang等［29］將β-葡糖醛酸苷酶基因gus的N端和C端分別與Ssp DnaE Intein的In和Ic連接形成融合基因GUSn/In和Ic/GUSc，利用共轉(zhuǎn)化或有性雜交的方法將GUSn/In和Ic/GUSc導(dǎo)入到擬南芥基因組中，同時(shí)含有兩個(gè)基因片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥成功表達(dá)了GUS活性。

Gils等［30］利用 intein介導(dǎo)的 Barnase蛋白重新組裝系統(tǒng)創(chuàng)立了一種全新的制備小麥雄性不育系的方法，首次通過雜交使雜交種中同時(shí)含有N、C兩個(gè)片段，并得到產(chǎn)生不可育花粉的植株。2009年，Kempe等［31］也在小麥中證實(shí) intein可在小麥中恢復(fù)拆分后的Barnase基因的功能，說明intein介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)剪接不僅在模式植物中，在單子葉植物中同樣也能發(fā)揮功能?？共莞熟⒌腉2-aroA在F295/S296位點(diǎn)拆分后，能夠在intein介導(dǎo)的轉(zhuǎn)剪接作用下組裝成有活性的功能蛋白［32］。靳茜等［33］根據(jù)G2-aroA基因的可拆分位點(diǎn)F295/T296，利用PCR方法將G2-aroA基因分成N端和C端兩部分，并分別與Ssp DnaE intein的N端和C端連接，形成融合基因片段EnIn和IcEc，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別導(dǎo)入煙草核基因組中，通過雜交獲得同時(shí)含有2個(gè)片段的轉(zhuǎn)基因煙草，證明G2-aroA基因拆分后在煙草葉綠體中重新組裝成完整有功能的蛋白的效率可達(dá)到100%。

圖2 利用基因拆分技術(shù)限控基因飄流示意圖Fig.2 Gene split technology in limiting gene flow.

2.2 基因拆分技術(shù)限控轉(zhuǎn)基因飄流的效果

基因拆分技術(shù)用于限控基因飄流的優(yōu)勢是它降低了目標(biāo)基因從轉(zhuǎn)基因植株向近緣野生種飄移的概率［9，34］(圖2)。理論上，基因拆分技術(shù)限控轉(zhuǎn)基因飄流的效果與兩個(gè)基因片段的插入位點(diǎn)密切相關(guān)。根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，假如拆分后的兩個(gè)基因片段插入到轉(zhuǎn)基因植物的非同源染色體上，雜交后代產(chǎn)生的花粉中有25% 同時(shí)含有兩個(gè)基因片段;當(dāng)兩個(gè)基因片段插入到同源染色體上時(shí)，如果不考慮染色體交換，雜交后代的花粉中同時(shí)含有兩個(gè)基因片段的概率為0。靳茜等［33］通過有性雜交的方法獲得同時(shí)含有EPSPSn-In或Ic-EPSPSc的轉(zhuǎn)基因煙草，自交試驗(yàn)證明了兩個(gè)基因片段插入在非同源染色體上，回交試驗(yàn)結(jié)果表明后代中有23.61%的植株具有草甘膦抗性，與兩個(gè)基因片段插入非同源染色體上時(shí)25%為抗性苗的假設(shè)相符，證明了利用基因拆分技術(shù)培育的轉(zhuǎn)基因植物中，其外源基因向有性雜交種的基因飄流頻率至少能夠降低75%。

3 問題與展望

糧食發(fā)展的目標(biāo)不僅要讓人們吃得飽，還要吃得好、吃的安全，這為轉(zhuǎn)基因技術(shù)在糧食作物上的應(yīng)用提供了良好的契機(jī)，同時(shí)也讓轉(zhuǎn)基因技術(shù)承受了巨大的挑戰(zhàn)，如何趨利避害，提供安全的、環(huán)境友好的轉(zhuǎn)基因方案是當(dāng)今生物科學(xué)界不得不面對的問題。

為了從根本上杜絕基因飄流，保障轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的環(huán)境和食品安全，研究者們提出了一系列生物學(xué)措施來控制轉(zhuǎn)基因飄流，包括葉綠體轉(zhuǎn)化、可控轉(zhuǎn)基因技術(shù)、閉花受精、基因刪除、轉(zhuǎn)基因削弱和雄性不育等［4］。但每種措施都有其自身的特點(diǎn)和使用范圍。如葉綠體為母系遺傳，利用葉綠體轉(zhuǎn)化培育的轉(zhuǎn)基因植物，其基因飄流的風(fēng)險(xiǎn)大大降低，但有些植物的葉綠體不是母系遺傳，而且葉綠體轉(zhuǎn)化時(shí)同質(zhì)化很困難，這都制約了葉綠體轉(zhuǎn)化的應(yīng)用［35］。雄性不育能有效地控制父本的轉(zhuǎn)基因飄流，但仍能作為母本與其有性可交配種雜交而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雜交種。轉(zhuǎn)基因弱化技術(shù)能控制基因向雜草的飄流，但不能限制轉(zhuǎn)基因向同物種的飄流。2010年，Hüsken等［36］對這些措施各自的優(yōu)缺點(diǎn)和當(dāng)前的研究進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，并指出沒有哪種措施能夠百分百地控制轉(zhuǎn)基因飄流，只有多種措施結(jié)合使用才能獲得理想的限控轉(zhuǎn)基因飄流的效果。

基因拆分技術(shù)為限控轉(zhuǎn)基因飄流上提供了新的思路。如上所述，已有包括gus、G2-aroA、和ALSⅡ等基因在內(nèi)的多個(gè)基因拆分后利用此技術(shù)在擬南芥、煙草和小麥等植物中恢復(fù)目標(biāo)蛋白功能，而且在煙草中也明確了基因拆分后在植株水平上的重新組裝效率可高達(dá)100%，能降低至少75%的轉(zhuǎn)基因飄流頻率，因此，基因拆分技術(shù)可能具有很好的通用性。而且通過篩選，獲得拆分后的基因片段位于同源染色體的轉(zhuǎn)化體，就有可能完全控制轉(zhuǎn)基因植株的基因飄流。但基因拆分技術(shù)的普遍應(yīng)用，還需要解決以下兩個(gè)問題:一是基因有效可拆分位點(diǎn)的篩選，二是建立從分子水平上明確基因拆分后的重新組裝效率的技術(shù)。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相關(guān)新方法、新技術(shù)的涌現(xiàn)，基因拆分技術(shù)在防控轉(zhuǎn)基因飄流中會擁有廣闊的應(yīng)用前景，并將進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的商業(yè)化進(jìn)程。

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