川芎及土壤中毒死蜱殘留檢測提取方法

穆向榮， 馬逾英， 袁茂華， 馬 羚， 蔣桂華， 曹 赟

成都中醫(yī)藥大學藥學院，國家中醫(yī)藥管理局中藥品種質(zhì)量鑒定科研三級實驗室，成都611137

川芎為常用中藥，來源于傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，具有活血祛瘀、行氣開郁、止痛等功效［1］。川芎除供藥用外，還可用作食品、美白護膚品、洗頭液、飼料和煙用香料添加劑等［2］，應用范圍廣泛，需求量大。川芎目前均為人工栽培，在生長過程中，易遭受多種蟲害，特別是蠐螬、川芎莖節(jié)蛾咬食川芎莖干和根莖，對川芎產(chǎn)量和質(zhì)量造成極大威脅。據(jù)調(diào)查，目前在川芎生產(chǎn)過程中，產(chǎn)地藥農(nóng)多使用毒死蜱來防治蟲害。

毒死蜱(chlorpyrifos)，化學名稱為O，O-二乙基-O-(3，5，6，-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，是一種廣譜殺蟲劑，具有胃毒、觸殺作用。據(jù)報道，毒死蜱已在世界100多個國家登記應用［3］。但毒死蜱能明顯引起人和動物紅細胞膽堿酯酶的抑制［4］，蓄積于神經(jīng)系統(tǒng)后導致人出現(xiàn)惡心、頭暈，甚至神志不清等癥狀，高濃度暴露可造成呼吸麻痹和死亡［5］。因此國內(nèi)外越來越重視毒死蜱殘留問題及其影響:日本肯定列表制度中規(guī)定了毒死蜱在蔬菜中的最高殘留限量值為0.01 ～0.05 mg/kg，我國規(guī)定的無公害蔬菜中的最高殘留限量值為l mg/kg［6］。農(nóng)藥殘留的測定屬于痕量分析，樣品的處理方法至關重要。有關水果、蔬菜等作物中的毒死蜱殘留提取及檢測方法已有較多研究［7～12］，但川芎及其土壤中毒死蜱殘留提取方法的研究尚未見報道。本文建立了川芎植株和土壤中農(nóng)藥毒死蜱殘留檢測的最佳提取方法，為探討毒死蜱在川芎及土壤中的殘留動態(tài)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)，傘形科植物，由成都中醫(yī)藥大學馬逾英教授鑒定。

川芎和土壤樣品采集于彭州市敖平鎮(zhèn)川芎GAP基地，未使用農(nóng)藥毒死蜱，作為空白樣品。

田間試驗小區(qū)按推薦劑量100g/667m2噴施農(nóng)藥毒死蜱，2 d后采集川芎和土壤樣品，作為測定樣品。

1.2 標準品與試劑

毒死蜱標準品，純度＞98%，購于北京上立方聯(lián)合化工技術研究院;正十八烷，購自Accustandard Inc.;無水硫酸鈉、弗羅里硅土、乙腈、丙酮、乙酸乙酯均為分析純。

1.3 儀器與主要設備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975C)，配有DB-5MS 色譜柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);RE-5203型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);TD6001型電子天平(天津天與儀器廠);HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(河南金博儀器制造有限公司);DCY-12G型氮吹儀(青島?？苾x器有限公司);KQ3200B型數(shù)控超聲波清洗器(上海越眾儀器設備有限公司);層析柱(成都大法玻璃加工有限公司)，規(guī)格為20cm×1cm(內(nèi)徑)。

1.4 質(zhì)譜條件

進樣口溫度為230℃，檢測器溫度為300℃;載氣為高純氮氣(純度99.999%)，流速15mL/min。升溫程序:初始溫度為100℃，保持 1min;以20℃/min升至 200℃，保持 1min;以 0.5℃/min升至201℃，保持1min;以10℃/min升至210℃，以20℃/min升至240℃，保持2min。進樣方式為10∶1分流進樣。進樣體積:1 μL。電離方式EI，電離能量70 eV;離子源溫度230℃;質(zhì)量掃描范圍40～400 amu;選擇離子(SIM)時毒死蜱的特征離子質(zhì)量數(shù):197、258、314;正十八烷的特征離子質(zhì)量數(shù):57、71、254;溶劑延遲:6min。

1.5 標準溶液配制

1.5.1 內(nèi)標物溶液的配制 精密稱取正十八烷4.16 mg置10mL容量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻。

1.5.2 毒死蜱標準品溶液的配制 精密稱取毒死蜱標準品5.39 mg置25mL容量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻。制成0.215 6 mg/mL的標準品貯備液。分別精密吸取標準品貯備液0.05mL、0.1mL、0.5mL、1mL、5mL和 10mL 于100mL容量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取不同濃度的標準品溶液4.80mL，再準確加入0.20mL的內(nèi)標物溶液，混勻，配制成毒死蜱標準品系列溶液。

1.6 正交試驗

為確定用于川芎地上部分、根莖及其栽培土壤中的毒死蜱殘留檢測的最佳提取方法，以提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)和溶劑量為四因素，設計四因素三水平正交試驗(見表1、表2)。分別用毒死蜱處理空白川芎樣品和空白土壤樣品，按正交試驗設計的提取方法分組提取后，GC-MS法檢測，分析毒死蜱回收率并得出最佳提取方法。

表1 川芎地上部分和根莖中毒死蜱殘留提取正交試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design for chlorpyrifos residue extraction test in aerial parts and rhizome of Ligusticum chuanxiong.

表2 土壤中毒死蜱殘留提取正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal design for chlorpyrifos residue extraction test in soil.

1.7 正交試驗樣品制備

1.7.1 川芎樣品溶液的制備 分別準確稱取10 g搗碎的空白川芎樣品的地上部分和根莖，按質(zhì)量分數(shù)1.01 mg/kg加入毒死蜱標準品貯備液。靜置0.5 h后，以正交試驗設計分組進行提取。將各組提取液用無水硫酸鈉去水后，減壓濃縮至近干。用5mL正己烷－乙酸乙酯(體積比1∶1)溶解殘渣，轉入20cm×1cm的Florisil柱(自制:從下至上分別為4 g弗羅里硅土、0.5 g活性炭)中后用40mL正己烷－乙酸乙酯(體1∶1)洗脫，收集流出液。收集的洗脫液經(jīng)減壓濃縮、氮吹至近干，用2mL丙酮溶解殘渣，過膜后用于GC-MS進樣檢測。

1.7.2 土壤樣品溶液的制備 將采取的空白土壤樣品風干，粉碎過1號篩。準確稱取10 g后，按質(zhì)量分數(shù)1.01 mg/kg加入毒死蜱標準品貯備液。靜置0.5 h后，以正交試驗設計分組進行提取。將各組提取液減壓濃縮至近干后，用5mL丙酮溶解殘渣，氮吹至近干，用2mL丙酮溶解，過膜后用于GC-MS進樣檢測。

1.8 最佳提取條件用于實際樣品的測定

根據(jù)正交試驗結果，確定川芎和土壤中毒死蜱殘留的最佳提取方法。按最佳提取方法提取1.2中的待測樣品。采用1.7中的濃縮凈化方法制備供試品溶液，按1.4中的GC-MS條件測定。

1.9 方法學驗證

1.9.1 重復性實驗 取施藥處理2 d后的川芎和土壤樣品各6份，按正交試驗確定的最佳提取條件提取毒死蜱，制備供試樣品，GC-MS測定。

1.9.2 加標回收率實驗 準確稱取川芎和土壤樣品各 10 g，按低(0.1 mg/kg)、中(0.5 mg/kg)、高(1 mg/kg)水平加入毒死蜱農(nóng)藥標準品溶液，按最佳提取條件，制備供試樣品，GC-MS測定，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

毒死蜱標準品質(zhì)量色譜圖如圖1所示。

以毒死蜱與正十八烷的峰面積之比為縱坐標Y，以毒死蜱與正十八烷的濃度之比為橫坐標X進行線性回歸分析?；貧w方程為Y=2.409X－0.001 86，R2=0.999 3，結果顯示，在 0.215 6 ～21.56 mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系(圖2)。

圖1 毒死蜱標準品質(zhì)量色譜圖Fig.1 The EIC of chlorpyrifos.

圖2 毒死蜱標準曲線圖Fig.2 Standard curve of chlorpyrifos.

2.2 川芎地上部分毒死蜱殘留提取方法的正交試驗

川芎地上部分毒死蜱殘留提取與提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)和溶劑量有關。由表3、表4可知，各因素對毒死蜱回收率均有極顯著影響。雖然丙酮提取效果較乙腈好，但采用丙酮提取時，提取雜質(zhì)多，提取液中水分不易除去導致實驗耗時長，方差分析顯示兩者無顯著差異，故確定提取溶劑為乙腈。提取3次較提取2次的毒死蜱回收率高，但二者無顯著性差異，為簡化提取步驟，故確定提取次數(shù)為2次。最佳提取條件為A1B1C2D2，即:提取溶劑為乙腈、提取時間為15min、提取次數(shù)為2次、溶劑加入量為30mL。

表3 川芎地上部分毒死蜱殘留提取正交試驗結果Table 3 Orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in the aerial parts of Ligusticum chuanxiong.

表4 川芎地上部分毒死蜱殘留提取正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in the aerial parts of Ligusticum chuanxiong.

2.3 川芎根莖毒死蜱殘留提取方法的正交試驗

實驗考察提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)和溶劑量對川芎根莖中毒死蜱殘留提取的影響。表5、表6實驗結果及方差分析顯示，除提取次數(shù)對毒死蜱回收率有顯著差異外，其余因素均有極顯著差異，且D(溶劑量)影響最大。多重比較后確定最佳提取條件同2.2。

2.4 川芎土壤中毒死蜱殘留提取方法的正交實驗

川芎土壤中毒死蜱殘留提取效果與提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)和溶劑量有關。表7、表8結果說明，除提取溶劑對毒死蜱回收率有極顯著差異外，其余各因素均無顯著性差異，以提取時間的影響作用最小。最終確定最佳提取條件為E3F1G2H2，即:提取溶劑為乙酸乙酯、提取時間為30min、提取次數(shù)為 2次、溶劑加入量為100mL。

表5 川芎根莖毒死蜱殘留提取正交試驗結果Table 5 Orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in rhizome of Ligusticum chuanxiong.

表6 川芎根莖毒死蜱殘留提取正交試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in rhizome of Ligusticum chuanxiong.

2.5 實際樣品測定效果

通過正交實驗建立了川芎地上部分、根莖以及栽培土壤樣品中的毒死蜱的最佳提取方法，用于GC-MS法檢測毒死蜱殘留。該提取方法應用于實際采集樣品的檢測的效果加以測試。GC-MS檢測結果如圖3、表9所示。

表7 土壤中毒死蜱殘留提取正交試驗結果Table 7 Orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in soil.

表8 土壤中毒死蜱殘留正交試驗結果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in soil.

表9 川芎植株和土壤中的毒死蜱殘留量Table 9 Residues of chlorpyrifos in Ligusticum chuanxiong plant and soil.

圖3 實際樣品中毒死蜱殘留的質(zhì)量色譜圖Fig.3 The EIC of chlorpyrifos extracted in actual samples.

2.6 方法學驗證

2.6.1 重復性 川芎及土壤中毒死蜱殘留檢測提取方法的重復性結果見表10。川芎地上部分、根莖和土壤中毒死蜱的平均殘留量分別為10.73 mg/kg、7.40 mg/kg 和 1.18 mg/kg;相對標準偏差 RSD 分別為 4.08%、5.80% 和 3.45%(n=6)，符合實際農(nóng)藥殘留分析要求［13］。

表10 重復性實驗結果Table 10 Result of repeatability experiments.

2.6.2 加標回收率 川芎及土壤中毒死蜱殘留檢測提取方法的回收率結果見表11。川芎地上部分毒死 蜱回收率分 別 為 99.48%、84.03% 和101.99%，RSD 分別為5.43%、3.65%和3.44%;根莖分別為88.25%、86.68%和 102.17%，RSD 分別為5.81%、0.68%和 2.03%;土壤分別為 72.86%、95.89%和104.01%，RSD 分別為4.97%、4.58%和4.69%(n=3)。結果符合農(nóng)藥殘留分析要求［13］。

表11 加標回收率實驗Table 11 Recovery experiments.

2.7 毒死蜱殘留提取方法的確定

2.7.1 川芎地上部分及根莖中毒死蜱殘留檢測的提取方法 準確稱取10 g搗碎的川芎樣品的地上部分和根莖于50mL錐形瓶中，加入30mL乙腈，超聲提取15min，提取2次。將提取液轉入裝有無水硫酸鈉的分液漏斗中，充分振蕩，靜置分層，棄去水層。有機相待濃縮后凈化。

2.7.2 土壤中毒死蜱殘留檢測的提取方法 準確稱取風干過篩后的土壤10 g于250mL錐形瓶中，加入100mL乙酸乙酯震蕩提取30min，重復上述過程一次。將提取液濾過至250mL圓底燒瓶后，減壓濃縮后過膜待檢測。

3 討論

川芎植株中的干擾物質(zhì)復雜多樣，合理的提取方法及凈化方法等前處理技術是準確測定毒死蜱殘留量的重要前提。本實驗前期，比較了超聲波提取法和振蕩提取法提取毒死蜱的效率。超聲波提取法耗時短，所需溶劑量小，且對川芎地上部分和根莖中毒死蜱的提取回收率分別為93.61%和89.20%，均達到農(nóng)藥殘留分析要求。但采用超聲波提取土壤中的毒死蜱時，其回收率(77.03%)遠低于振蕩法(86.72%)。因此，最終以超聲波提取法提取川芎植株中的毒死蜱，以振蕩法提取土壤中的毒死蜱。

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)川芎植株中提取雜質(zhì)較多，為滿足毒死蜱定量分析的需要，考察了丙酮∶正己烷(1∶9)、乙酸乙酯∶正己烷(1∶1)兩種淋洗劑的凈化回收率。比較結果發(fā)現(xiàn):40mL乙酸乙酯∶正己烷(1∶1)淋洗后，川芎地上部分和根莖中的毒死蜱凈化回收率均達到90%以上，表明該凈化方法切實可行。

在此基礎上，本文通過考察提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)和溶劑量的不同水平下毒死蜱的回收率，篩選出川芎地上部分、根莖和土壤中毒死蜱殘留檢測的最佳提取條件，并建立了相應的提取方法，經(jīng)方法學驗證，所確定的提取方法均達到農(nóng)藥殘留分析要求，方法簡單實用，可用于中藥川芎中以及土壤中毒死蜱殘留的GC-MS檢測，以動態(tài)分析毒死蜱在川芎植株和土壤中的殘留情況。

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