青海省同德牦牛的母系遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

李廣禎，馬志杰*，趙學(xué)軍，陳生梅，劉書(shū)杰，林 元，李文浩

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海省高原家畜遺傳資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016；2.青海省同德縣農(nóng)牧和水利局，青海同德 813200)

牦牛是生活在以青藏高原為中心及其毗鄰高山、亞高山高寒地區(qū)的特有珍稀牛種，其能在氣候寒冷、空氣稀薄和牧草生長(zhǎng)期短的高寒生態(tài)環(huán)境中自如地生長(zhǎng)繁殖，并為牧民提供肉、奶、皮等生活生產(chǎn)必需品[1]。同德縣隸屬于青海省海南藏族自治州，地處海南、黃南和果洛3個(gè)青海藏族自治州的交接處，是一個(gè)以牧為主，農(nóng)牧結(jié)合的少數(shù)民族地區(qū)，位于三江源自然保護(hù)區(qū)青海省東南部九曲黃河第二曲，氣候?yàn)榈湫偷母咴箨懶詺夂?，縣內(nèi)平均海拔3 660 m。畜牧業(yè)是該縣的主要產(chǎn)業(yè)之一，全縣擁有天然草場(chǎng)面積約4,489,000 hm2，可利用草場(chǎng)面積約4,308,100 hm2。牦牛和藏綿羊是同德縣的優(yōu)勢(shì)種畜和寶貴動(dòng)物遺傳資源，當(dāng)前，其牦牛存欄量達(dá)15.6萬(wàn)頭，藏綿羊68萬(wàn)只[2]。線(xiàn)粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)D-loop區(qū)具有母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于豬、羊、牛等家畜的母系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化歷史等研究[3-7]。先前基于D-loop序列已對(duì)我國(guó)多個(gè)省(區(qū))牦牛品種(群體)的遺傳多樣性、分化和分類(lèi)等問(wèn)題進(jìn)行了研究[8]。在青海牦牛的母系遺傳研究中，郭松長(zhǎng)等[9]對(duì)包括青海省環(huán)湖、高原和大通牦牛在內(nèi)的10個(gè)我國(guó)家牦牛品種(群體)的D-loop區(qū)作了測(cè)序分析，表明我國(guó)家牦牛擁有豐富的遺傳多樣性，青海牦牛單倍型多樣度最高，其中環(huán)湖、高原和大通牦牛的單倍型多樣度分別為0.985±0.040、0.909±0.019和0.942±0.030，推測(cè)青海省可能為家牦牛的馴化中心。Wang等[10]對(duì)包括180頭青海牦牛在內(nèi)的共計(jì)405頭我國(guó)家牦牛與47頭野牦牛D-loop區(qū)進(jìn)行綜合分析，其中在青海牦牛中共檢測(cè)到55種單倍型，包括特有單倍型33種，主要分布于A、B、C、D和E 5種單倍型組中，單倍型多樣度為0.892±0.017。王興東等[11]對(duì)155頭青海高原牦牛Cytb基因和D-loop區(qū)全序列進(jìn)行分析，表明高原牦牛單倍型多樣度和核苷酸多樣度分別為0.881和0.012，研究支持家牦牛和野牦牛劃為牛亞科牦牛屬的觀點(diǎn)。侯孟典等[12]通過(guò)64頭玉樹(shù)牦牛與4個(gè)西藏牦牛品種(群體)(即類(lèi)烏齊、申扎、帕里和斯布牦牛)D-loop區(qū)遺傳多樣性比較分析，表明玉樹(shù)牦牛單倍型多樣度最低(0.885±0.034)，而申扎牦牛單倍型多樣度最高(0.956)；玉樹(shù)牦牛與類(lèi)烏齊牦牛、帕里牦牛的遺傳距離最近，與斯布牦牛和申扎牦牛的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，5個(gè)牦牛類(lèi)群聚類(lèi)可分為2個(gè)分支。Yue等[13]對(duì)大通、環(huán)湖和高原牦牛以及其他10個(gè)家、野牦牛品種(群體)共742條D-loop序列進(jìn)行綜合分析，表明在家牦牛中大通牦牛單倍型多樣度最高(0.945±0.025)，高原牦牛單倍型多樣度較高(0.914±0.015)，而環(huán)湖牦牛單倍型多樣度最低(0.785±0.048)。李瑞哲等[14]基于D-loop區(qū)序列變異對(duì)33頭雪多牦牛母系遺傳多樣性及遺傳背景進(jìn)行分析，表明雪多牦牛單倍型多樣度為0.900±0.043，具有2個(gè)母系起源。李廣禎等[15]對(duì)34頭曲麻萊牦牛D-loop區(qū)部分序列進(jìn)行測(cè)定分析，表明其單倍型多樣度為0.952±0.021，由2個(gè)母系支系組成。綜上所述，除對(duì)其他我國(guó)省(區(qū))牦牛品種(群體)的母系遺傳研究外[8]，當(dāng)前研究者已對(duì)青海省內(nèi)部分牦牛品種(群體)如環(huán)湖、玉樹(shù)、曲麻萊、高原、雪多和大通牦牛品種(群體)進(jìn)行了母系遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)組成及遺傳背景等分析[9,11-15]。然而，目前尚未見(jiàn)對(duì)青海省同德縣牦牛群體的母系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析的研究報(bào)道。鑒于此，本研究基于mtDNA D-loop區(qū)遺傳變異對(duì)同德牦牛群體進(jìn)行母系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育探析，以便明確其遺傳多樣性水平、群體結(jié)構(gòu)組成及遺傳背景，為后續(xù)同德牦牛遺傳資源的合理保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

采用頸靜脈采血法，在青海省同德縣秀麻鄉(xiāng)和河北鄉(xiāng)共采集60頭(32♂，28♀)牦牛頸靜脈血樣，使用血液基因組DNA提取試劑盒(艾德萊生物科技有限公司，北京)提取基因組DNA，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)合成和PCR擴(kuò)增

使用Ma等[16]在野牦牛研究中運(yùn)用的引物擴(kuò)增同德牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列，其上游引物(PF)為5'-CTACAGTCTCACCGTCAACC-3'，下游引物(PR)為5'-GGGGTGTAGATGCTTGC-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為：2× Prime STAR Max Premix (上海寶生物公司) 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，基因組DNA為1 μL，超純水9.5 μL，共計(jì)25 μL。其中PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性1 min，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；后72 ℃延伸10 min。后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，后送至北京擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將測(cè)序數(shù)據(jù)使用Chromas 2.3軟件進(jìn)行人工核對(duì)，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，再用BioEdit 7.2.5軟件進(jìn)行多序列比對(duì)(ClustalW Multiple alignment)分析，后采用DnaSP 5.10.01軟件確定同德牦牛的多態(tài)位點(diǎn)和單倍型數(shù)目，并使用Arlequin 3.11軟件計(jì)算同德牦牛群體的單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)大小，后用Network 10.1軟件基于單倍型間的核苷酸變異繪制網(wǎng)絡(luò)中介圖(Median-Joining, MJ)以揭示單倍型(組)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 同德牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列變異分析

通過(guò)測(cè)定60頭同德牦牛的D-loop區(qū)序列，所測(cè)序列長(zhǎng)度在890-894 bp之間，排除12處插入/缺失后共檢測(cè)到59處多態(tài)位點(diǎn)，占所分析序列長(zhǎng)度的6.63 %。在59處多態(tài)位點(diǎn)中，有17處為單一多態(tài)位點(diǎn)，即123、164、230、255、311、650、709、758、777、797、808、814、816、818、851、868和872位點(diǎn)，占總序列長(zhǎng)度的1.91%；其余42處為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，分別為109、116、134、141、173、188、194、221、248、249、250、256、257、267、276、285、293、296、309、310、314、315、317、326、329、334、356、391、392、398、501、539、694、697、720、731、798、800、810、813、884和885位點(diǎn)，約占總序列長(zhǎng)度的4.72 %(圖1)。

2.2 同德牦牛的母系遺傳多樣性分析

對(duì)60頭同德牦牛D-loop區(qū)序列進(jìn)行分析，共確定了31種單倍型，其中單倍型H8由14個(gè)個(gè)體共享，為優(yōu)勢(shì)單倍型，單倍型H9和H10均由4個(gè)個(gè)體共享，H3和H29均由3個(gè)個(gè)體共享，單倍型H5、H15、H17、H19、H22和H28均由2個(gè)個(gè)體共享，其余的單倍型均由1個(gè)個(gè)體所擁有(圖1)。計(jì)算后群體單倍型多樣度為0.935±0.023，核苷酸多樣度為0.012±0.006，序列平均核苷酸差異K值為7.48。

注：“.”代表與H1單倍型序列中的核苷酸相同；N代表分享同一種單倍型的個(gè)體數(shù)；Hg代表單倍型組類(lèi)型。

將同德牦牛的遺傳多樣性指數(shù)值大小與已報(bào)道的6個(gè)其他青海省牦牛品種(群體)相應(yīng)數(shù)值進(jìn)行比較分析(表1)，結(jié)果表明：在青海省牦牛品種(群體)中，曲麻萊牦牛群體的單倍型多樣度值(0.952)最高，環(huán)湖牦牛品種的單倍型多樣度(0.785)值最低。相比而言，同德牦牛群體單倍型多樣度值(0.935)也較高，表明其具有豐富的母系遺傳多樣性。

表1 同德牦牛與6個(gè)青海省其他牦牛品種(群體)母系遺傳多樣性指數(shù)值大小比較

2.3 同德牦牛的系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中下載美洲野牛(Bison bison)(GenBank No：EU177871)的D-loop序列作為外群，與同德牦牛31種D-loop序列單倍型構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖2)，結(jié)果顯示：31種單倍型聚為2個(gè)支系，其中H3和H11單倍型為1支(即支系Ⅱ)，占總單倍型數(shù)的7%(2/31)；剩余的29種單倍型聚為另1支(即支系Ⅰ)，占總單倍型數(shù)的93%(29/31)。同德牦牛31種單倍型隸屬于A、B、C、D和E 5種單倍型組，所占比例分別為58%(18/31)、26%(8/31)、3%(1/31)、3%(1/31)和10%(3/31)。

注：圓圈大小與擁有各單倍型的個(gè)體數(shù)目大小成正比。

3 討論

遺傳多樣性是生態(tài)系統(tǒng)多樣性和物種多樣性的基礎(chǔ)和核心，物種或居群的遺傳多樣性大小是長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物，是其生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提。家畜遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，與人類(lèi)未來(lái)的生存與發(fā)展密切相關(guān)。家畜群體遺傳變異的高低與遺傳結(jié)構(gòu)的差異是其遺傳多樣性的重要體現(xiàn)。先前對(duì)我國(guó)野牦牛母系遺傳多樣性的研究得出，野牦牛擁有2～3個(gè)母系遺傳分支，且擁有豐富的遺傳多樣性，其單倍型多樣度在0.920～1.000之間[10,13,16-17]。而我國(guó)家牦牛母系遺傳多樣性、分化與系統(tǒng)發(fā)育的分析表明：家牦牛品種(群體)間存在較為顯著的遺傳分化，無(wú)明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)，遺傳多樣性豐富，其單倍型多樣度在0.785～0.983之間，由2個(gè)母系遺傳分支組成[8-15,17-18]。在青海省牦牛品種(群體)的母系遺傳多樣性研究中，已報(bào)道的高原、環(huán)湖、大通、玉樹(shù)、雪多和曲麻萊牦牛品種(群體)的單倍型多樣度在0.785～0.952之間，核苷酸多樣度在0.020～0.016之間[9,11-15]。而在本研究中，同德牦牛群體的單倍型多樣度為0.935±0.023，核苷酸多樣度為0.012±0.006，其值與青海省其他6個(gè)牦牛品種(群體)母系遺傳多樣性指數(shù)值大小相比較高，表明同德牦牛群體擁有較高的母系遺傳變異，具有豐富的母系遺傳多樣性。

在對(duì)同德牦牛的系統(tǒng)發(fā)育分析中，31種單倍型可以分為2個(gè)大的支系，說(shuō)明同德牦牛具有2個(gè)母系起源，這與先前對(duì)家牦牛其他品種(群體)的母系遺傳背景的研究結(jié)果一致[8-15,16-18]。在單倍型組網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析中，同德牦牛單倍型分布在A、B、C、D和E單倍型組中，可以看出A單倍型組在同德牦牛中占主導(dǎo)地位，所占比例為58%，而C與D單倍型組所占比例較少，僅為6%，這與Yue等[13]和Guo等[17]對(duì)其他家牦牛品種(群體)的研究結(jié)果一致，說(shuō)明同德牦牛具有與其他家牦牛品種(群體)相似的母系群體遺傳結(jié)構(gòu)組成。

4 結(jié)論

同德牦牛單倍型多樣度為0.935±0.023，核苷酸多樣度為0.012±0.006，具有豐富的母系遺傳多樣性，其中H8為優(yōu)勢(shì)單倍型，31種單倍型分布在A、B、C、D和E 5種單倍型組中，擁有2個(gè)母系支系，具有2個(gè)母系起源。