中甸牦牛HIF-1α基因表達差異分析

唐 嘉， 楊 宇， 楊 凱， 和占星， 金顯棟， 亐開興*， 王 昕*

(1. 陜西省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.云南省草地動物科學研究院，昆明 650212)

中甸牦牛是云南省迪慶州高原藏區(qū)獨有的牦牛品種，是高寒地區(qū)的役、乳、肉兼用型地方優(yōu)良品種[1-2]。中甸牦牛適應高山自然氣候環(huán)境，主要生活在海拔3 000～4 300 m高原和高山垂直帶，具有耐嚴寒、耐低氧、耐放牧、耐粗飼、采食能力強等優(yōu)良特點[3-4]。牦牛養(yǎng)殖業(yè)是高度適應高寒生態(tài)條件的特定生態(tài)養(yǎng)殖模式，是廣大農牧民世代經(jīng)營并賴以生存和發(fā)展的基礎產(chǎn)業(yè)，發(fā)展牦牛業(yè)對提高藏區(qū)人民生活水平、繁榮藏區(qū)經(jīng)濟和文化傳承等具有重要作用。但其目前仍存在生產(chǎn)性能低、牧場載畜力下降、新技術推廣遲緩等問題[3,5]，中甸牦牛的基礎研究薄弱。

低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白，由α和β兩種蛋白質的異質體組成，是在研究低氧誘導的EPO(促紅細胞生成素，erythropoietin)基因表達時被發(fā)現(xiàn)的[6]。HIF-1α基因受缺氧信號的調控，是HIF-1的活性亞基；HIF-1β亞基在細胞內穩(wěn)定表達，起結構性作用。HIF-1α亞基在翻譯后會被降解，因而在正常氧飽和度下的細胞中基本檢測不到HIF-1α亞基的表達；而在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α亞基的降解被抑制，α和β亞基形成有活性的HIF-1，轉移到細胞核內調節(jié)多種基因的轉錄[7-9]。通過氧分壓對HIF-1活性的控制是通過改變HIF-1α亞基的水平來實現(xiàn)的[8,10]。HIF-1缺氧誘導的特異性和敏感性在哺乳動物轉錄因子中獨一無二，作為急、慢性缺氧生理反應的重要介導因子，HIF-1是介導這些反應的包括心臟和血管的系統(tǒng)發(fā)育所必需的。無論是在細胞還是在機體的局部水平，HIF-1都是低氧信號傳遞的重要樞紐，而HIF-1α被認為是細胞低氧感應所必需的核心轉錄因子[8,10-12]。

牦牛具有很多生理學特征使它們適應高海拔地區(qū)的生活，包括心肺體積大、覓食能力強、對外界環(huán)境敏感和能量代謝高等，在天然的低氧環(huán)境經(jīng)過長期的進化也形成了特有的耐低氧適應機制，牦牛對低氧環(huán)境在分子層面上做出的適應性和調控是極其復雜多樣的[13-14]。然而高原地區(qū)常年缺草缺料，牦牛產(chǎn)業(yè)處于傳統(tǒng)“夏肥-秋壯-冬困-春乏”的惡性循環(huán)中，尋求草料豐富的農區(qū)進行異地育肥勢在必行，可大幅度提高牦牛生產(chǎn)力，縮短飼養(yǎng)周期，同時改善牛肉品質，獲取較高的養(yǎng)殖效益[5,15]。本試驗為了比較中甸牦牛HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、背脂、胰臟和眼肌等組織器官中的差異表達水平，以揭示牦牛這一高原土著哺乳動物的耐低氧、高海拔及對不同飼養(yǎng)條件下的分子適應機制，為探討異地馴養(yǎng)牦牛的生產(chǎn)問題提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 樣本采自于高山放牧海拔>3 200 m云南省香格里拉市(年均氣溫5.8 ℃)的成年中甸牦牛7頭(>5歲，年均氣溫5.8 ℃)和異地圈養(yǎng)于1 910 m昆明小哨示范牧場1.5年以上(年均氣溫14.92 ℃)育肥的中甸牦牛2頭(>3.5歲)。屠宰后取其心臟、肝臟、肺臟、腎臟、背脂、胰臟和眼肌等組織器官，剪碎后放入凍存管進液氮罐保存，帶回實驗室-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus購自寶生物工程(大連)有限公司(Cat. No.9109)；DEPC水購自Sigma公司(Cat. No.V900882)。熒光定量PCR相關試劑：反轉錄試劑iScriptTM cDNA Synthesis Kit購自BIO-RAD公司(Cat. No.170-8891)；熒光染料SsoFastTMEvaGreen Supermix購自BIO-RAD公司(Cat. No.172-5201AP)。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(SW-CJ-1FD)購自蘇州凈化設備有限公司；高速冷凍離心機(75005440)購自Thermo Fisher Scientific公司；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-1600)購自天能科技有限公司；電泳儀(DYY-7C)購自北京六一儀器廠；移液器(KA0052521)購自DRAGON公司；熒光定量PCR儀(580BR 12007)購自BIO-RAD公司、恒溫水浴鍋(HWS12)購自上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)NCBI GenBank中公布的HIF-1α基因序列(NC_037337.1)和以GAPDH基因(NM_001034034)為內參設計引物(表1)用于PCR檢測，引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成。

表1 引物信息表

1.2.2 RNA提取及反轉錄 剪取100 mg左右解凍組織樣品加入到研磨器中，待組織樣品研碎后加入1 mL RNAiso Plus(TRIZOL)，震蕩使其緩沖液與樣本均勻混合。將離心管橫放在架子上，4 ℃靜置20 min后，12 000 r/min離心10 min。取上清(600～800 μL)，取上清過程中盡量不要吸到組織碎片，加入200 μL氯仿，在震蕩器上震蕩混勻后，4℃靜置10 min，12 000 r/min離心15 min。離心結束后，用移液器小心吸取上層無色溶液(400～600 μL)于無RNase的1.5 mL離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，上下顛倒充分搖勻，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，使RNA沉淀于離心管底部。小心倒去上清，向離心管內加1 mL 75%乙醇進行洗滌，顛倒混勻后4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min。棄去上清，輕甩，用吸水紙吸干離心管壁上的液體，可以在底部看到RNA沉淀，根據(jù)沉淀的大小，用不同體積的DEPC水(50～100 μL)溶解。將溶解后的RNA分裝到PCR管后凍存于-80 ℃。按照反轉錄試劑盒(iScriptTM cDNA Synthesis Kit)說明書，將提取的RNA反轉錄為cDNA，反應體系如表2所示。

表2 反轉錄反應體系

1.2.3 實時熒光定量PCR反應 反應體系如下：SYBR 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，cDNA 1.5 μL，DEPC水6.9 μL，反應總體系為20 μL。熒光定量PCR反應程序：95 ℃預變性90 s；95 ℃變性15 s，95 ℃～55 ℃梯度退火20 s；循環(huán)35次；收集溶解曲線65 ℃升高到95 ℃，每5 s升高0.5 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

首先計算HIF-1α基因的相對表達量，再采用SAS 9.2軟件的GLM程序分析不同器官組織和不同飼養(yǎng)條件對中甸牦牛HIF-1α基因相對表達量的影響，模型如下：

Yijkl=μ+ti+aj+tak+eijkl

其中：Yijkl為HIF-1α基因相對表達量；μ為總體均值效應；ti為不同組織器官效應；aj為不同飼養(yǎng)條件效應；tak為不同組織器官和不同飼養(yǎng)條件的互作效應；eijkl為隨機殘差效應。結果用“最小二乘均值±標準差”表示，并進行多重比較；P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下及不同組織器官中的表達分析

由表3可看出，HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下的中甸牦牛不同組織器官相對表達量的最小二乘方差分析結果表明，不同組織器官的HIF-1α基因相對表達量有極顯著的差異(P<0.01)，異地飼養(yǎng)對HIF-1α基因相對表達量有顯著影響(P<0.05)。

表3 不同飼養(yǎng)條件下中甸牦牛不同組織器官HIF-1α基因相對表達量的最小二乘分析

由圖1可見，通過比較HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下及不同組織器官中的相對表達量，HIF-1α基因的相對表達量在高山放牧的中甸牦牛肝臟中顯著高于圈養(yǎng)育肥的(P<0.05)，其余組間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 中甸牦牛HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下及不同組織器官中的表達量

2.2 HIF-1α基因在不同組織器官中的表達分析

由表4看出，HIF-1α基因在中甸牦牛不同組織器官中相對表達量的最小二乘均值(LSM)及多重比較結果表明，HIF-1α基因在中甸牦牛的肝臟、腎臟、心臟和背脂中表達量較其它組織器官的高(P<0.05)，肝臟中的相對表達量極顯著高于腹脂、眼肌、肺臟、胰臟中(P<0.01)，腎臟、心臟中的表達量極顯著高于肺臟、胰臟中(P<0.01)，顯著高于腹脂、眼肌中(P<0.05)；在肺臟、胰臟、眼肌和腹脂之間的表達量無顯著差異(P>0.05)，以胰臟、肺臟和眼肌的表達量最少。

表4 中甸牦牛不同組織器官HIF-1α基因相對表達量的最小二乘分析

2.3 HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下的表達分析

由表5看出，HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件的中甸牦牛中相對表達量的LSM及多重比較結果表明，HIF-1α基因在高山放牧的中甸牦牛中的相對表達量顯著高于圈養(yǎng)育肥的中甸牦牛，是異地圈養(yǎng)表達量的1.7倍(P<0.05)。

表5 不同飼養(yǎng)條件下中甸牦牛HIF-1α基因相對表達量的最小二乘分析

3 討論

HIF-1α是作為低氧應答信號通路中的關鍵基因，通過調節(jié)下游基因的表達水平，還能介導能量代謝、細胞生長和凋亡、血管新生、氧的攝取和運輸?shù)缺磉_，以及氧平衡狀態(tài)的調節(jié)。常氧狀態(tài)下，HIF-1α經(jīng)泛素化后迅速被蛋白酶降解，而在低氧高寒條件下HIF-1α在核內迅速積累，與HIF-1β結合形成功能性轉錄因子復合體HIF-1，呈高度表達，是維持低氧條件下氧平衡的關鍵性轉錄因子[10-11,16-18]。通過研究高原動物對環(huán)境的適應性機制，有人發(fā)現(xiàn)機體并不依賴某些器官功能的變化，更主要的是通過調整細胞代謝、低氧誘導因子HIF-1α信號通路的基因表達等分子水平的改變而適應高原環(huán)境，所進化的適應性機制主要有肌紅蛋白(Mb)及血紅蛋白(Hb)含量增加、血紅蛋白氧親和力增加、血管內皮生長因子(VEGF)及舒張因子(EDRF)含量增加、細胞代謝及內呼吸適應等[11,16-18]。研究發(fā)現(xiàn)，低氧應答信號通路中的重要基因HIF-1α在牦牛以及藏族人群中都受到劇烈的正向選擇，表明該基因在高海拔適應性中具有重要作用[19-20]。高原地區(qū)地理位置獨特、自然環(huán)境惡劣，因而牦牛需要克服低氧、低溫、高紫外線輻射等惡劣因素，除了生理形態(tài)上適應，其基因組也發(fā)生了極大的變化[21]。

HIF-1α基因mRNA表達為揭示高原土著哺乳動物的適應性機制提供了分子基礎，在各種哺乳動物如藏羚羊、高原鼠兔、鼴鼠、牦牛等的不同組織中廣泛表達，具有組織特異性[22-31]。在各種組織中的HIF-1α基因表達水平不一，對于藏羚羊，HIF-1α基因表達以肺臟最高，顯著高于藏綿羊和平原綿羊，而通過馴化的藏綿羊的基因表達水平也顯著低于藏羚羊[23]，馬崗鵝HIF-1α基因表達以肺臟和胰腺較高[24]。而在牦牛的報道中，HIF-1α基因在麥洼牦牛肝臟和腦中高度表達[25]，在青海家牦牛睪丸和脾臟中的表達量高于其他組織器官[26]，而在甘南牦牛中其在心臟中表達量高于骨骼肌和肝臟，肝臟中的表達量在三者中最低[27]。本研究首次建立中甸牦牛HIF-1α基因表達差異的檢測方法，高山放牧和異地飼養(yǎng)的中甸牦牛在不同組織器官中均有表達，在肝臟、腎臟、心臟中顯著高表達，在眼肌、胰臟和肺臟中的表達量較少。因此，推測不同高原土著動物的HIF-1α基因在組織中表達的特異性可能對于維持體內HIF-1α高水平有一定的調節(jié)作用，而且不同高原土著動物中HIF-1α基因的組織差異性較大，其遺傳機制需進一步研究。

本研究通過將原本在海拔>3 200 m、年均氣溫5.8℃的迪慶州高山放牧的中甸牦牛異地圈養(yǎng)于海拔1 910 m、平均氣溫14.9 ℃小哨示范牧場，通過比較二者HIF-1α基因的相對表達量，首次發(fā)現(xiàn)高山放牧的中甸牦牛中顯著高于圈養(yǎng)育肥(昆明飼養(yǎng)時間>1.5年)的表達水平，相差1.7倍多，跟鼴鼠的低氧調節(jié)機制接近[31]；同時，發(fā)現(xiàn)高山放牧的中甸牦牛HIF-1α基因在肝臟的相對表達量顯著高于圈養(yǎng)育肥的水平。本研究結果與藏雞胚胎的表達模式不一樣[32]，與短時間(7 d)飼喂的高原鼠兔的表達水平也相去甚遠[33]。本研究結果可能從一個側面反應了中甸牦牛適應異地飼養(yǎng)的分子變化水平，但要全面綜合探討高原動物不同組織器官中HIF-1α基因表達差異，有待考慮更多基因的表達水平。

4 結論

作為低氧應答信號通路中的關鍵基因，HIF-1α基因在中甸牦牛不同組織器官中廣泛表達且具有組織特異性，其在不同海拔飼養(yǎng)條件的相對表達量具有顯著差異。