柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的制備、結(jié)構(gòu)分析及特性研究

張亞杰，徐金帥，鄒 波，李思含，李春美,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，教育部環(huán)境食品學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州 510000）

柚皮苷（Naringin）和檸檬苦素（Limonin）廣泛存在于柚皮中，是最主要的黃酮和三萜類(lèi)物質(zhì)。近年來(lái)，眾多研究表明柚皮苷和檸檬苦素具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗腫瘤、抑菌、抗氧化、心血管疾病預(yù)防、干預(yù)骨質(zhì)疏松等活性[1?6]，在食品、醫(yī)藥以及化妝品等領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。但其化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，在加工處理過(guò)程中結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化，甚至失去活性。有研究報(bào)道柚皮苷溶液在放置5 h后吸光值發(fā)生顯著的變化[7]。而檸檬苦素在不同的pH、溫度、與光照和氧氣接觸的時(shí)長(zhǎng)都會(huì)發(fā)生不同程度的變化[8]。在45~90 ℃之間，降解速率會(huì)加快；在外界環(huán)境中暴露時(shí)間越久，生物活性越弱。不僅如此，柚皮苷和檸檬苦素是柚皮中最主要的苦味成分，其中柚皮苷和檸檬苦素的苦味閾值分別為20 mg/L[9]和6 mg/L[10]，導(dǎo)致其很難被人們接受，限制了在食品中的應(yīng)用。

微膠囊技術(shù)一般采用天然或合成的高分子作為包囊材料，通過(guò)各種不同的成膜反應(yīng)形成一種連續(xù)的薄膜，將一些分散成細(xì)小的、具有反應(yīng)活性、敏感或易揮發(fā)的固體小顆粒、小液滴、甚至氣體小分子包覆起來(lái)，形成一種具有半透性或密封性的囊形結(jié)構(gòu)，即微膠囊[11]。在眾多的微膠囊制備方法中，銳孔造粒法因其良好的包埋率、載藥率及操作簡(jiǎn)便而受到廣泛的應(yīng)用及研究[12]。黃酮類(lèi)和三萜類(lèi)物質(zhì)吸收和代謝的場(chǎng)所主要是在小腸[13?14]，這意味著柚皮苷和檸檬苦素必須減少在胃中的釋放，因此，具有pH敏感性的海藻酸凝膠微粒在控制芯材的釋放中發(fā)揮了不可或缺的作用?，F(xiàn)今在微膠囊技術(shù)領(lǐng)域研究最多也是最成熟的微膠囊體系是以海藻酸鈉和聚賴(lài)氨酸為壁材的微膠囊，但其制備工藝復(fù)雜，選用材料中聚賴(lài)氨酸成本高且難獲取，大大局限了該種微膠囊的推廣及應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，海藻酸鹽和殼聚糖之間的結(jié)合比聚賴(lài)氨酸和海藻酸鹽之間的結(jié)合顯著增強(qiáng)，而且殼聚糖與聚賴(lài)氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)較為相近，同時(shí)殼聚糖生物相容性好和易獲取，被認(rèn)為是聚賴(lài)氨酸的理想替代材料[15]。

因此，微膠囊技術(shù)具有保護(hù)芯材，控制芯材釋放的同時(shí)降低或掩蓋不良味道及延長(zhǎng)保質(zhì)期等優(yōu)勢(shì)[16?18]。且目前對(duì)柚皮苷和檸檬苦素微膠囊的研究鮮有報(bào)道。本文擬分別用海藻酸鈉-殼聚糖-氯化鈣作為微膠囊壁材對(duì)柚皮苷和檸檬苦素同時(shí)進(jìn)行包埋，通過(guò)傅里葉紅外光譜儀（FT-IR）和掃描電鏡（SEM）分析、體外模擬胃腸消化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)微膠囊化的柚皮苷和檸檬苦素可有效避開(kāi)胃酸的侵害，在小腸內(nèi)充分釋放，有利于發(fā)揮其生理功能，提高生物利用率和轉(zhuǎn)化率，以期為開(kāi)發(fā)降糖、降脂食品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柚皮苷和檸檬苦素 純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司；海藻酸鈉和殼聚糖 食品級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶（純度為1:15000）、胰酶（純度為1:4000） 上海源葉生物科技有限公司。

Multiskan FC多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司；85-2磁力攪拌器 常州朗越儀器制造有限公司；pH計(jì) 上海捷萊科化工科技有限公司；Nicolet Nexus 470傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；掃描電鏡（JSM-6390LV） 日本NTC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照先前的方法[19]，用70%乙醇配制2 mg/mL柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取0.8、0.6、0.4、0.2、0.1和0.05 mL標(biāo)準(zhǔn)液至6個(gè)4 mL EP管，再分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、0.9和0.95 mL 70%乙醇，配制成1.6、1.2、0.8、0.4、0.2和0.1 mg/mL的柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)液。各取0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)液，5 mL 90%一縮二乙二醇溶液，0.1 mL 4 mol/L NaOH溶液，4.7 mL去離子水，漩渦振蕩5 s后置于40 ℃水浴中保溫10 min，420 nm下測(cè)其吸光值，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定三次并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得柚皮苷的回歸方程y=0.1487x?0.003111，R2=0.9996。

1.2.2 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用無(wú)水乙醇配制0.2 mg/mL檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；顯示劑A液：125 mg對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于100 mL的硫酸和乙醇混合液中（硫酸:無(wú)水乙醇=65:35（V:V）），放冷使用；顯示劑B液：準(zhǔn)確稱(chēng)取FeCl30.9 g，蒸餾水溶解并定容至10 mL；使用時(shí)向A液中加入0.5 mL B液；

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.125、0.25、0.5、1和2 mL檸檬苦素溶液，無(wú)水乙醇定容至2 mL，最后加入5 mL顯色劑，振蕩2 s，靜置，30 min后490 nm下測(cè)其吸光度值，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得檸檬苦素的回歸方程y=4.421x?0.04549，R2=0.9954。

1.2.3 微膠囊的制備 銳孔法制備柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的具體操作步驟：稱(chēng)取一定量海藻酸鈉60 ℃下加入去離子水邊攪拌邊溶解；向攪拌均勻的海藻酸鈉溶液中加入一定量的柚皮苷和檸檬苦素，繼續(xù)用磁力攪拌器攪拌均勻；將一定量的殼聚糖溶解于1%冰醋酸溶液，再加一定量氯化鈣溶液，并用20% NaOH調(diào)pH，攪拌均勻；最后將柚皮苷與海藻酸鈉混懸液用一定規(guī)格的注射器以一定速率加入到殼聚糖-氯化鈣溶液中（300 r/min）攪拌，固化15 min，待微膠囊成形；抽濾收集，將制備成形的微膠囊置于凍干機(jī)中冷凍干燥，得到微膠囊成品。

1.2.4 微膠囊包埋率的測(cè)定 取1.2.3制備的濕囊，加入100 mL 70%乙醇均質(zhì)10 min，抽濾，準(zhǔn)確定容至100 mL，分別對(duì)柚皮苷和檸檬苦素進(jìn)行檢測(cè)，以測(cè)得的檸檬苦素和柚皮苷的總含量（mg/mL）為被包埋芯材的含量，再按照公式得出此微膠囊對(duì)包埋率。

1.2.5 確定適合的檸檬苦素與柚皮苷的比例 固定氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，pH為5.5，芯壁材比為1:2；設(shè)置檸檬苦素和柚皮苷的比例分別為1:1、1:2、2:5、1:5和1:10，總含量為0.15 g，然后測(cè)定包埋率。

1.2.6 確定適合的pH 固定檸檬苦素與柚皮苷的比例為1:5，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，芯壁材比為1:2；柚皮苷和檸檬苦素0.15 g，設(shè)置不同的pH為：3、4、5、6和7，然后測(cè)定包埋率。

1.2.7 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 不同壁芯材比對(duì)柚皮苷和檸檬苦素包埋率的影響 固定檸檬苦素與柚皮苷的比例為1:5，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，pH為6；柚皮苷和檸檬苦素0.15 g，設(shè)置不同海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%，即壁芯材比為2:3、4:3、2:1、8:3和10:3，然后測(cè)定包埋率。

1.2.7.2 不同殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷和檸檬苦素包埋率的影響 固定檸檬苦素與柚皮苷的比例為1:5，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，pH為6，芯壁材比為1:2，柚皮苷和檸檬苦素0.15 g，設(shè)置不同的殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%，然后測(cè)定包埋率。

1.2.7.3 不同氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷和檸檬苦素包埋率的影響 固定檸檬苦素與柚皮苷的比例為1:5，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，pH為6，芯壁材比為1:2，柚皮苷和檸檬苦素0.15 g，設(shè)置不同的氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%和5%，然后測(cè)定包埋率。

1.2.8 響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化微膠囊制備的工藝條件在1.2.7單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)包埋率影響較大的芯壁材比、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氯化鈣分?jǐn)?shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert-8.0.6軟件中的響應(yīng)面設(shè)計(jì)（Box-Behnken Design，BBD）進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Response surface factors and levels

1.2.9 FT-IR分析 將空微膠囊、載柚皮苷和檸檬苦素微膠囊粉末壓片，采用傅立葉紅外光譜儀（FT-IR）分別對(duì)這兩種微膠囊的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。掃描范圍在4000~400 cm?1，記錄樣品的紅外光譜圖。

1.2.10 表面形態(tài)與內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察 采用電子掃描顯微鏡（SEM）觀察柚皮苷/檸檬苦素微膠囊表面形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。先在樣品臺(tái)上貼上一層導(dǎo)電膠，將整個(gè)微膠囊和切成剖面的微膠囊輕輕粘在上面，然后在樣品上噴金，供SEM觀察微膠囊產(chǎn)品表面形態(tài)，加速電壓為20 kV。

1.2.11 微膠囊熱穩(wěn)定性的研究 取5份等量的柚皮苷/檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品和柚皮苷/檸檬苦素微膠囊，分別置于90 ℃下1、2、4、8和12 h，定時(shí)取樣測(cè)定包埋前后柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的保留率，考察溫度等對(duì)柚皮苷/檸檬苦素穩(wěn)定性的影響。

1.2.12 苦味強(qiáng)度測(cè)定 采用ASTREE電子舌儀器的Alphasoft軟件進(jìn)行分析，該系統(tǒng)含有7個(gè)脂膜傳感器，分別是酸味（AHS）、通用（PKS）、咸味（CTS）、鮮味（NMS）、咸味（CTS）、甜味（ANS）和苦味（SCS）傳感器，可以客觀評(píng)價(jià)樣品的苦味等強(qiáng)度值。以柚皮苷/檸檬苦素純品和柚皮苷/檸檬苦素微膠囊為樣品，配制10和20 mg/L的柚皮苷/檸檬苦素（柚皮苷和檸檬苦素之比為5:1）以及相對(duì)應(yīng)的10和20 mg/L的柚皮苷/檸檬苦素微膠囊，取100 mL于電子舌專(zhuān)用測(cè)試燒杯中進(jìn)行測(cè)試。平行測(cè)定4次，從苦味傳感器測(cè)得相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

1.2.13 柚皮苷和檸檬苦素微膠囊在體外累計(jì)釋放率的測(cè)定 人工模擬胃液的配制：取9 mL的濃鹽酸，加約800 mL蒸餾水稀釋?zhuān){(diào)pH約為1.2，然后再加胃蛋白酶10 g，混勻后待用；人工模擬腸液的配制：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL溶解，用0.4 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.8，然后另取胰酶10 g加適量水溶解，最后將兩液混合，定容至1000 mL即得人工腸液，備用。

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g柚皮苷和檸檬苦素微膠囊2份，分別用人工模擬胃液和模擬腸液定容至20 mL，37 °C水浴，攪拌速度為100 r/min。每隔15 min取1 mL上清液，同時(shí)用等量同溫的胃液和腸液補(bǔ)充，用70%乙醇定容至10 mL，用1.2.1和1.2.2中的方法測(cè)定吸光度A，代入柚皮苷回歸方程y=0.1487x?0.003111和檸檬苦素回歸方程y=4.421x?0.04549得到藥物質(zhì)量濃度C，計(jì)算出累計(jì)釋放百分率，繪制釋放曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析試驗(yàn)

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Prism 8軟件進(jìn)行處理以及用one-way ANOVA（P<0.05）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚皮苦味成分微膠囊工藝的研究

2.1.1 柚皮苷與檸檬苦素比例的確定 柚皮苷和檸檬苦素是柚皮中主要的黃酮和三萜類(lèi)物質(zhì)，都具有很強(qiáng)的生物活性，但這兩類(lèi)化合物也是柚皮苦味的主要成分，同時(shí)穩(wěn)定性欠佳，嚴(yán)重影響了其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，因此將柚皮苷和檸檬苦素進(jìn)行微膠囊化有助于解決這些問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)柚皮苷和檸檬苦素的產(chǎn)品化。前期的研究表明，柚皮苷和檸檬苦素均具有調(diào)節(jié)糖脂代謝的活性，復(fù)合使用效果更佳。柚皮苷在水中溶解性較好，而檸檬苦素微溶于水，因此我們首先需確定柚皮苷與檸檬苦素的比例。從圖1中看出，隨著柚皮苷比例的增加，包埋率也隨之增加，可能因?yàn)殍制ぼ盏母咚苄詫?dǎo)致芯材更好的分散在海藻酸鈉溶液中。在檸檬苦素的質(zhì)量過(guò)低時(shí)，溶液黏稠度下降，芯材無(wú)法被完全包埋，出現(xiàn)了包埋率輕微降低的現(xiàn)象。因此，選擇檸檬苦素與柚皮苷質(zhì)量之比為1:5來(lái)進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

圖 1 不同的檸檬苦素與柚皮苷質(zhì)量之比對(duì)微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effects of different mass ratios of limonin to naringin on embedding rate of microcapsules

2.1.2 pH對(duì)微膠囊的影響 pH的變化對(duì)殼聚糖和海藻酸鈉所帶電荷、空間構(gòu)象均有一定影響。從圖2中看出，包埋率隨著pH的增加先增加后減少，這是因?yàn)闅ぞ厶堑膒Ka為6.3，海藻酸鈉中古洛糖醛酸的pKa為3.5，甘露糖醛酸的pKa是4.0[20]，在低pH時(shí)，海藻酸鹽中的-COO?基團(tuán)隨著pH的增加而增加，而殼聚糖中的-NH3+也隨之減少，表面帶電的數(shù)量更多，吸附的殼聚糖量也更多，因而成膜反應(yīng)程度也加深，表現(xiàn)為微膠囊膜厚增加。當(dāng)pH=6時(shí)，包埋率達(dá)到峰值，此時(shí)殼聚糖分子幾乎不帶電，電荷密度較低，分子空間伸展也較小，分子擴(kuò)散系數(shù)較高，能更深入地?cái)U(kuò)散到海藻酸鈣凝膠中，發(fā)生的聚電解質(zhì)絡(luò)合的強(qiáng)度高，膜較為致密，對(duì)芯材的擴(kuò)散限制作用也更強(qiáng)，因此包埋率較高[21]。當(dāng)pH=7時(shí)，包埋率降低，這是由于殼聚糖分子遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，其空間結(jié)構(gòu)改變的程度較小，因此與海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑的匹配程度也變?nèi)?，膜稍微變薄。因此，我們選擇pH=6來(lái)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖 2 不同pH對(duì)柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effects of different pH on embedding rate of naringin/limonin microcapsules

2.1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.3.1 壁芯材比對(duì)微膠囊的影響 壁材和芯材是微膠囊化產(chǎn)品中最主要的物質(zhì)材料，因此壁芯材比是影響其包埋率的一個(gè)重要因素。從圖3中可以看出，包埋率隨著壁芯材比的增加而增加，在壁芯材比2:1時(shí)包埋效果最好。當(dāng)壁芯材比較低時(shí)，制得的微膠囊質(zhì)地柔軟而易變形，芯材容易外露，最終導(dǎo)致破裂，這可能是因?yàn)楹Ｔ逅徕c質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，海藻酸鈉-殼聚糖聚電解質(zhì)膜過(guò)薄，形成的微膠囊機(jī)械強(qiáng)度過(guò)低，導(dǎo)致囊壁不硬實(shí)，故不能進(jìn)行有效的包埋；而當(dāng)壁芯材比較高時(shí)，海藻酸鈉與芯材溶液黏度過(guò)大，針孔堵塞，擠出比較困難，產(chǎn)生嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象[22]，使包埋率降低，藥物利用率也降低。因此選擇壁芯材比4:3、2:1和8:3來(lái)進(jìn)行下一步優(yōu)化。

圖 3 不同壁芯材比對(duì)柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effects of different wall-to-core ratios on the embedding rate of naringin/limonin microcapsules

2.1.3.2 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊的影響 殼聚糖是自然界中少見(jiàn)的直鏈陽(yáng)離子聚合物，在微膠囊囊壁的形成過(guò)程中扮演著不可缺少的角色。從圖4中可知，在0.3%~1.2%范圍內(nèi)，隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，微膠囊的成形效果更好，包埋率更高，這是因?yàn)殡S著壁材中殼聚糖含量增加，壁材包覆更加完全，囊壁變硬、不易破裂，因此包埋率隨之上升。在1.2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)包埋率達(dá)到最大值之后，囊壁逐漸增厚，機(jī)械強(qiáng)度也隨之提高，但過(guò)厚的囊壁會(huì)使表面不平滑，出現(xiàn)一定凹陷，導(dǎo)致芯材外露，降低包埋率。因此選用殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%、1.2%和1.5%來(lái)進(jìn)行制備工藝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖 4 不同殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率的影響Fig.4 Effects of different mass ratio of chitosan on embedding rate of naringin/limonin microcapsules

2.1.3.3 氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊的影響 氯化鈣在微膠囊的形成過(guò)程中為反應(yīng)提供Ca2+，并且發(fā)揮固化劑的作用。從圖5中可以看出，包埋率隨氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大先增大后減小，在3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)處達(dá)到最大值。當(dāng)氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，海藻酸鈉與氯化鈣的結(jié)合不充分，凝膠珠外層的固化膜較薄且結(jié)構(gòu)不夠堅(jiān)硬，使得在制備過(guò)程中隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)而破裂，導(dǎo)致包埋率的降低。氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，外層迅速固化，微膠囊囊壁較厚，但是阻礙了凝膠珠內(nèi)部固化，減少了壁材和芯材的相互接觸，使芯材的附著性能下降，同樣不利于微膠囊包埋率的提高。因此選用氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、3%和4%來(lái)進(jìn)行制備工藝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖 5 不同氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率的影響Fig.5 Effects of different calcium chloride mass fraction ratio on the embedding rate of naringin/limonin microcapsules

2.1.4 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4.1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)2.1.2和2.1.3實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定柚皮苷與檸檬苦素的比例為5:1和pH=6來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。將壁芯材比（A）、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）和氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）作為自變量，對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率（Y）作為響應(yīng)值。共有17個(gè)析因點(diǎn)，其中5個(gè)為中心點(diǎn)，其目的是估計(jì)實(shí)驗(yàn)的純誤差。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表 2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

2.1.4.2 回歸方程的建立與顯著性分析 通過(guò)BBD設(shè)計(jì)Analysis中的ANOVA分析，可得包埋率（Y）與壁芯材比（A）、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）二次多元回歸方程為：

由表3可以看出，該模型顯示為顯著（P<0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05）。R2=0.9587，進(jìn)一步說(shuō)明模型實(shí)際值與方程預(yù)測(cè)值之間有較好的相關(guān)性。根據(jù)BBD設(shè)計(jì)Optimization中的Numerical得出最優(yōu)試驗(yàn)方案為壁芯材比2.67、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.92%，微膠囊包埋率可達(dá)88.68%。

表 3 回歸方程系數(shù)及顯著性分析Table 3 Regression equation coefficient and significance analysis

2.1.4.3 柚皮苷/檸檬苦素微膠囊制備工藝驗(yàn)證 綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到壁芯材比2:1，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，包埋率達(dá)到最大，使用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合考慮這3個(gè)因素，以柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的包埋率最大值為目標(biāo)值，經(jīng)過(guò)響應(yīng)曲面試驗(yàn)，對(duì)構(gòu)建的二次回歸方程進(jìn)行優(yōu)化后得到當(dāng)壁芯材比8:3、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%和氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%時(shí)，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率約為88.2%，與理論值相對(duì)誤差小于5%。說(shuō)明該工藝準(zhǔn)確可靠，可以用于柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的生產(chǎn)加工。

2.2 柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)表征和體外釋放特性

2.2.1 柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的FT-IR 分析柚皮苷和檸檬苦素在4000~400 cm?1內(nèi)有明顯的特征峰，柚皮苷的特征峰有：3545、3478、2919、1648、1607、1520、1445、1357、1301、1227、1206、1183、1133、1096、1070 cm?1，檸檬苦素的特征峰有：1756、1710、1602、1505、1387、1370、1352、1285、1263、1210、1187、1122、1020、875、647 cm?1[23]。從圖6可以看出，載柚皮苷和檸檬苦素微膠囊的吸收峰中均出現(xiàn)了柚皮苷和檸檬苦素的特征峰，以上都能有效證明微膠囊中成功載入柚皮苷和檸檬苦素藥物。我們還可以從光譜中看出載藥微膠囊和空微膠囊的基團(tuán)保持一致，充分說(shuō)明了在包埋過(guò)程中未改變?cè)形⒛z囊的分子結(jié)構(gòu)。

2.2.2 微膠囊的結(jié)構(gòu)形態(tài)特征 微膠囊的結(jié)構(gòu)形態(tài)特征影響著微膠囊的性質(zhì)，比如芯材的緩釋速率、微膠囊產(chǎn)品的流動(dòng)特性等。微膠囊表面完整性和內(nèi)部的結(jié)構(gòu)特征影響著芯材的釋放，同時(shí)微膠囊顆粒外部表面形態(tài)與微膠囊產(chǎn)品的流動(dòng)性密切相關(guān)，因此有必要研究微膠囊產(chǎn)品的表面以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。從圖7a和7b中可以看出，微膠囊主要分為三層：最外層為殼聚糖覆膜，沒(méi)有芯材；中間層為混合芯材的海藻酸鈉-殼聚糖聚電解質(zhì)膜；而中心為含有芯材的海藻酸鈣囊芯。這與之前證明海藻酸鈣是以“蛋盒”結(jié)構(gòu)形式存在，藥物鑲嵌在這種“蛋盒”中，從而實(shí)現(xiàn)包埋的結(jié)果相一致[24]。相比于空微膠囊，載柚皮苷和檸檬苦素微膠囊在中間層和中心更為飽滿(mǎn)，分布比較均勻，說(shuō)明柚皮苷和檸檬苦素已被完全包覆。從圖7c中可以看出，微膠囊表面結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)較為均一，表面有皺褶，未見(jiàn)裂縫、孔洞和凹陷現(xiàn)象，表明有較高的微膠囊化效率。其表面的典型皺褶是因銳孔法而存在的，微膠囊干燥后，水分脫去而發(fā)生縮聚，體積與濕微膠囊相比顯著減少，從而導(dǎo)致表面出現(xiàn)皺褶。因此，以上結(jié)果表明，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)可較好地保護(hù)芯材，解決柚皮苷和檸檬苦素的不穩(wěn)定性等問(wèn)題。

圖 6 載柚皮苷和檸檬苦素/空微膠囊的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of naringin and limonin/empty microcapsules

圖 7 掃描電鏡下干微膠囊的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面形態(tài)圖Fig.7 Internal structure and surface morphology of the dry microcapsule under the scanning electron microscope

2.2.3 包埋前后柚皮苷/檸檬苦素微膠囊熱穩(wěn)定性為了驗(yàn)證柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的熱穩(wěn)定性，測(cè)定了包埋前后柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的保留率，由圖8可見(jiàn)，柚皮苷和檸檬苦素具有熱不穩(wěn)定性，樣品加熱12 h后，柚皮苷和檸檬苦素保留率降為28.5%，而將其制成微膠囊產(chǎn)品，則在相同的熱環(huán)境下，其保留率高達(dá)86.7%，這表明柚皮苷/檸檬苦素微膠囊在高溫條件下的穩(wěn)定性明顯高于柚皮苷/檸檬苦素純品，證實(shí)微膠囊化的產(chǎn)品可以改善柚皮苷和檸檬苦素的熱不穩(wěn)定性，與廖霞等[25]研究的海藻酸鈉-殼聚糖制備的微膠囊可提高槲皮素穩(wěn)定性的結(jié)果一致。

圖 8 加熱對(duì)柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的影響Fig.8 Effects of heating on naringin/limonin microcapsules

2.2.4 包埋前后柚皮苷/檸檬苦素的苦味對(duì)比 柚皮苷和檸檬苦素經(jīng)過(guò)微膠囊化，與壁材間存在包埋或者聚合作用，降低了與舌根或軟顎的接觸能力。為了驗(yàn)證微膠囊化降低了柚皮苷和檸檬苦素的苦味，電子舌檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，相比于柚皮苷/檸檬苦素純品，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊在10和20 mg/L的苦味強(qiáng)度都顯著（P<0.05）降低，可見(jiàn)微膠囊化可有效降低柚皮苷和檸檬苦素的苦味。

表 4 含相同濃度的柚皮苷/檸檬苦素溶液和微膠囊溶液苦味的電子舌測(cè)定值Table 4 The relations of sensory value on biterness of Nar/Lim and microcapsule (contain the equal Lim/NAr)

2.2.5 柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的體外釋放特性 從圖9（A）中可以看出，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊在模擬胃液中的釋放不呈線性關(guān)系，在0~90 min，微膠囊內(nèi)柚皮苷和檸檬苦素的釋放較為緩慢；90~200 min柚皮苷和檸檬苦素的釋放較快。說(shuō)明在模擬胃液中90 min后，壁材開(kāi)始逐漸溶解，控制速率的障礙輕微減少，因此柚皮苷和檸檬苦素穿過(guò)囊壁向外擴(kuò)散的速率稍微增大。而在圖9（B）中，可以發(fā)現(xiàn)在45 min時(shí)微膠囊在人工模擬腸液中的累計(jì)釋放率已經(jīng)超過(guò)75%?？傮w來(lái)看，微膠囊在人工模擬胃液中釋放非常緩慢，經(jīng)過(guò)6 h后總體釋放率才達(dá)31%左右，而在人工模擬腸液中的釋放迅速。這可能是由于微膠囊囊壁的構(gòu)成與pH有很大的相關(guān)性[26]：在pH約為1.2的模擬胃液中，最外層的殼聚糖與H+結(jié)合成聚陽(yáng)離子，從而開(kāi)始溶解；而囊壁內(nèi)層的海藻酸凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，幾乎不發(fā)生溶脹，阻止了芯材的釋放；在pH較高、偏堿性的模擬腸液中，海藻酸凝膠發(fā)生溶脹，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，堅(jiān)固的海藻酸鈣溶脹破裂，釋放出芯材[27]。此外，黃酮類(lèi)和三萜類(lèi)物質(zhì)吸收和代謝的場(chǎng)所主要是在小腸[28?29]，這就意味著柚皮苷和檸檬苦素必須減少在胃中的釋放，增加在腸道中的釋放才能提高其生物利用率，因此具有pH敏感性的海藻酸凝膠微粒在芯材的釋放中發(fā)揮了不可或缺的作用。

圖 9 柚皮苷/檸檬苦素微膠囊在模擬胃液（A）和腸液（B）的釋放速率Fig.9 Release rate of naringin/limonin microcapsules in simulated gastric juice（A）and intestinal juice（B）

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化制備柚皮苷/檸檬苦素微膠囊工藝，確定最優(yōu)工藝參數(shù)為：壁芯材比：2.67、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)：0.9%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)：2.92%，此時(shí)包埋率可達(dá)88.68%。對(duì)構(gòu)建的二次回歸方程進(jìn)行優(yōu)化后得到，當(dāng)壁芯材比8:3、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%和氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%時(shí)，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率為88.2%，與理論值相對(duì)誤差小于5%，說(shuō)明該工藝準(zhǔn)確可靠，可以用于柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的生產(chǎn)加工。熱穩(wěn)定性和電子舌結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)海藻酸鈉-殼聚糖-氯化鈣微膠囊包埋后，柚皮苷/檸檬苦素苦味強(qiáng)度得到有效降低，且顯著提高了其穩(wěn)定性。SEM結(jié)果可以直觀觀察到柚皮苷/檸檬苦素被完整有效的包裹在微膠囊中，F(xiàn)TIR從分子結(jié)構(gòu)上驗(yàn)證了這一結(jié)果。此外，微膠囊化的柚皮苷/檸檬苦素有效減少其在胃液中的破壞，提高其在腸液中的緩釋能力，促進(jìn)其在腸道內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化與吸收。表現(xiàn)為在模擬胃液中消化6 h后總體釋放率才達(dá)31%左右，在模擬腸液中消化45 min時(shí)累計(jì)釋放率已經(jīng)超過(guò)75%。以上研究結(jié)論為柚皮苷/檸檬苦素的高值化利用以及在相關(guān)食品加工中的穩(wěn)定性與生物利用提供了理論基礎(chǔ)。