OPO酶法合成和其在嬰幼兒配方乳粉中的檢測研究進(jìn)展

安雪征 呂林燚 祁娜 杜曠 張雙 杜鑒 齊原 田云翼

母乳是嬰兒最理想的食物，母乳中含有3%-4%的脂肪，這些脂肪可為嬰兒提供60%左右的能量，并對嬰幼兒的生長發(fā)育起到非常重要的作用。但因社會環(huán)境等原因，我國母乳喂養(yǎng)率較低，于是很多家庭便選擇母乳替代物——嬰幼兒配方乳粉來喂養(yǎng)嬰兒。但由于普通的嬰幼兒配方乳粉多以牛乳脂肪和植物油為油脂配料，其2位棕櫚酸酯（Sn-2棕櫚酸酯）含量與其在母乳中的含量存在較大差異，從而導(dǎo)致嬰幼兒對普通配方乳粉的營養(yǎng)吸收和消化能力不及母乳。為了更好地順應(yīng)寶寶自然的營養(yǎng)需求，在配方乳粉中添加1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（又稱OPO結(jié)構(gòu)脂）可以使配方乳粉中的Sn-2位棕櫚酸酯的含量更接近母乳，有益于嬰幼兒的生長發(fā)育。因此，研究如何生產(chǎn)OPO并將其作為人乳脂肪替代品應(yīng)用于嬰兒配方奶粉的生產(chǎn)中有著十分重要的意義。目前，酶促合成法因其溫和的反應(yīng)條件和較低的成本，成為合成OPO的主要方法。本文回顧了近年來使用酶促合成法生產(chǎn)OPO的研究，并著重討論了OPO的結(jié)構(gòu)與對嬰兒的益處、OPO的合成工藝和影響因素，以及OPO的檢測方法。

一、 OPO的結(jié)構(gòu)與功能

母乳脂肪中98%為甘油三酯，這些甘油三酯多以Sn-USU形存在，其中U代表不飽和脂肪酸（多為油酸和亞油酸），S代表飽和脂肪酸（多為棕櫚酸）。母乳中約80%的棕櫚酸在Sn-2位點(diǎn)。在消化吸收甘油三脂的過程中，Sn1，3位點(diǎn)的脂肪酸會經(jīng)酶水解后以游離脂肪酸的形式被吸收，Sn-2位點(diǎn)的脂肪酸則以甘油單酯的形式通過淋巴系統(tǒng)被人體吸收。普通配方乳粉中的脂肪結(jié)構(gòu)與母乳中的脂肪結(jié)構(gòu)存在差異，棕櫚酸主要位于Sn1，3位點(diǎn)，這對嬰兒對營養(yǎng)的消化吸收有負(fù)面影響。在消化過程中，Sn1，3位的棕櫚酸經(jīng)酶水解變?yōu)橛坞x棕櫚酸，游離的棕櫚酸與鈣離子等在小腸的酸性條件下會發(fā)生皂化反應(yīng)，產(chǎn)生高熔點(diǎn)的不溶性物質(zhì)，從而降低人體對脂肪酸的吸收率。這不僅會造成能量和鈣的雙重流失，還會形成不溶性物質(zhì)，增加嬰兒糞便的硬度，導(dǎo)致嬰兒在生長過程中出現(xiàn)便秘等腸道疾病問題。圖1為母乳和普通嬰幼兒配方乳粉中脂肪代謝過程。

OPO為USU型酯的代表，其中Sn-1和Sn-3位為油酸，Sn-2位為棕櫚酸。通過在乳粉中添加OPO，使配方乳粉中的Sn-2位棕櫚酸的含量更接近母乳，能達(dá)到提高嬰幼兒對營養(yǎng)和能量吸收率的效果，并能通過降低體內(nèi)游離棕櫚酸含量減少體內(nèi)的鈣、鎂等骨骼礦物質(zhì)的流失，在支持骨骼生長發(fā)育的同時有效降低不溶性物質(zhì)的形成。研究表明，與喂養(yǎng)普通配方乳粉的嬰兒相比，喂養(yǎng)添加OPO的嬰兒配方乳粉可以降低嬰兒糞便中的鈣皂含量，降低嬰兒糞便硬度，改善嬰兒腸道菌群，減少嬰兒的哭鬧次數(shù)和時間。

二、OPO的合成工藝

OPO可以通過化學(xué)催化和酶催化兩種方式生產(chǎn)。比起化學(xué)催化合成法，酶促合成法具有更高的選擇性并可以在更溫和的反應(yīng)條件下進(jìn)行，且由于化學(xué)催化合成法中額外的純化步驟和更高的反應(yīng)溫度會提高生產(chǎn)OPO的成本，因此目前應(yīng)用較廣的OPO合成方法主要為酶促合成法。

sn-1，3特異性脂肪酶是用于酶促生產(chǎn)OPO的催化劑。已經(jīng)有很多種類的sn-1，3特異性脂肪酶被研究用于以各種富含棕櫚酸的脂肪或富含油酸的油脂為原料生產(chǎn)OPO，包括Lipozyme IM-60，Lipozyme TL IM，Lipozyme RM IM，Candida sp. 99∶125脂肪酶，Aspergillus oryzae脂肪酶等。酶促合成OPO涉及到的反應(yīng)類型包括酸解、酯交換和醇解。

1.OPO酶促合成法的不同類型及反應(yīng)特點(diǎn)。（1）酶促酸解法。酶促酸解法主要是以富含Sn-2位棕櫚酸的油脂和游離脂肪酸油酸為底物，在脂肪酶的作用下生成OPO的過程，合成路線如圖2所示。在此工藝中，以富含Sn-2位棕櫚酸的油脂作為反應(yīng)底物，較為常見的是棕櫚酸硬脂、棕櫚油、巴沙鯰魚油、豬油等。李昕倩等使用豬油和油酸為反應(yīng)底物，通過正交試驗，使用Candida sp.99-125脂肪酶進(jìn)行酸解反應(yīng)合成OPO。在最優(yōu)條件下，即底物質(zhì)量比為1∶2（豬油∶油酸）、酶用量為10%，在40℃反應(yīng)4h，得到的產(chǎn)物中OPO含量在43%以上。鄒碩等以分提后富含三棕櫚酸甘油酯的棕櫚酸硬脂和油酸為反應(yīng)底物，在脂肪酶 NS40086的作用下進(jìn)行酸解合成OPO，在最優(yōu)條件下，即底物摩爾比1∶10（分提后富含三棕櫚酸甘油酯的棕櫚酸硬脂∶油酸）、酶用量12%，在60℃反應(yīng)4h，得到的產(chǎn)物中OPO含量為72.53%。李世磊等使用棕櫚硬脂和油酸為反應(yīng)底物，使用Lipozyme RM IM脂肪酶進(jìn)行酸解合成OPO，在最優(yōu)條件下，即底物摩爾比1∶10（棕櫚硬脂：油酸）、酶用量10%，在56℃反應(yīng)4h，得到的產(chǎn)物中OPO含量為45.23%。

（2）酶促酯-酯交換法。酶促酯-酯交換法以兩種甘油三脂或者一種甘油三脂和?；瑸樵?，在脂肪酶的作用下生成OPO，合成路線如圖3所示。雖然此方法可使用的底物來源廣泛且反應(yīng)成本較低，但會得到較復(fù)雜的產(chǎn)物，增加了分離OPO的難度。Lee等以含有三棕櫚酸甘油酯純度為92%的油脂和油酸乙酯為底物，在優(yōu)化條件下，即底物摩爾比為5.5∶1（油酸乙酯：含有三棕櫚酸甘油酯純度為92%的油脂），在50℃下反應(yīng)3h，得到OPO含量為31.43%的產(chǎn)物，?；D(zhuǎn)移率最低為6.07%。張仁偉等以三棕櫚酸甘油酯和不同的油酸酰基供體為底物，摩爾比1∶6（三棕櫚酸甘油酯：油酸?；w）經(jīng)Novozym 40086脂肪酶催化，在50℃下反應(yīng)24h，得到了使用不同酰基生產(chǎn)OPO的產(chǎn)率，油酸乙酯作為供體時OPO的產(chǎn)率（37.54%）大于油酸甲酯作為供體時OPO的產(chǎn)率（34.56%），大于游離油酸作為供體時OPO的產(chǎn)率（32.11%）。這與Srivastava等以三棕櫚酸甘油酯和油酸或油酸甲酯為底物，經(jīng)脂肪酶Lipozyme RM IM作用下合成OPO的結(jié)果一致，即與油酸相比，油酸甲酯更適合作為?；w。宗蕾等以油酸乙酯和棕櫚硬脂為底物經(jīng)Novozym 40086脂肪酶催化，在最優(yōu)條件下，即底物摩爾比1∶6（棕櫚硬脂：油酸乙酯）、加酶量為8%，在60℃下反應(yīng)1h，得到OPO含量為46.30%的產(chǎn)物。

（3）酶促醇解法。酶促醇解法以富含Sn-2位棕櫚酸較多的油脂和乙醇為反應(yīng)底物，在Sn-1，3特異性脂肪酶作用下醇解，得到含有較多棕櫚酸在Sn-2位的甘油單酯，所得中間產(chǎn)物再和游離脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)生成OPO，合成路線如圖4所示。與酸解法和酯-酯交換法相比，醇解法制備OPO會得到較少的副產(chǎn)物，并且可以提升OPO的純度和產(chǎn)率，但是因為需要對醇解反應(yīng)后得到的棕櫚酸單甘酯進(jìn)行分離純化，因此合成成本較高。Pfeffre等在脂肪酶CalB的催化下，通過三棕櫚酸甘油酯和乙醇醇解得到2-棕櫚酸單甘酯，經(jīng)溶劑結(jié)晶法獲得純度較高的Sn-2棕櫚酸單甘脂，再將其與油酸進(jìn)行酯化反應(yīng)最終得到OPO（產(chǎn)率90%，純度為95%）。張艷以三棕櫚酸甘油酯和無水乙醇作為底物，摩爾比為1∶10，Candida sp.99-125脂肪酶添加量為15%，在45℃下醇解22h，再將純化的棕櫚酸單甘酯與油酸作為酯化底物，摩爾比為1∶4，Candida sp.99-125脂肪酶用量9%，在38℃反應(yīng)下反應(yīng)2h（反應(yīng)到1.5h時補(bǔ)加油酸），得到OPO含量占甘油三酯的88.75%。

2.OPO酶促合成的影響因素。在合成OPO的過程中，脂肪酶的選擇及活性、反應(yīng)底物及配比、生物反應(yīng)器等多方面因素都會對OPO的合成效率、產(chǎn)率和純度造成影響。

（1）反應(yīng)參數(shù)。反應(yīng)過程中許多參數(shù)會影響OPO的產(chǎn)率和純度，其中比較重要的包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH、反應(yīng)時間和底物摩爾比。OPO的產(chǎn)率是多種反應(yīng)參數(shù)共同決定的，現(xiàn)有的文獻(xiàn)中也很少有單一反應(yīng)參數(shù)對OPO產(chǎn)率影響的研究。根據(jù)使用的脂肪酶和反應(yīng)系統(tǒng)的不同，獲得最大的OPO產(chǎn)率所需要的反應(yīng)參數(shù)的組合也不同。Chen等使用lipase Novozym 435作為催化劑，發(fā)現(xiàn)OPO計算產(chǎn)率在反應(yīng)溫度為50℃時最高，反應(yīng)溫度為40℃時次高，反應(yīng)溫度為30℃時最低，且OPO的產(chǎn)率隨反應(yīng)時間增長而增加。Gu等使用響應(yīng)面分析法發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以Aspergillus oryzae lipase為催化劑使用填充床合成富含OPO的甘油三酯時，最佳的反應(yīng)參數(shù)組合為：停留時間3小時、溫度62.09℃、底物摩爾比7.13∶1（油酸∶棕櫚硬脂）。Esteban等使用Lipase DF催化合成OPO，發(fā)現(xiàn)底物摩爾比為6∶1（富含油酸的游離脂肪酸混合物∶富含棕櫚酸的甘油三酯）時OPO的產(chǎn)率高于底物摩爾比為4∶1和3∶1時OPO的產(chǎn)率。當(dāng)反應(yīng)在溶液中進(jìn)行時，反應(yīng)的溫度為37℃，而沒有溶劑時反應(yīng)需要在50℃下進(jìn)行才能達(dá)到同樣的產(chǎn)率，且脂肪酶的用量更高。

合成OPO的反應(yīng)體系是否包含溶劑也會影響反應(yīng)中適合使用的脂肪酶的類型和最佳底物比。Wei等在研究中發(fā)現(xiàn)Lipozyme TL IM更適合有溶劑的反應(yīng)體系，而Lipozyme RM IM更適合無溶劑的反應(yīng)體系。有溶劑時最佳底物摩爾比為8∶1（油酸∶三棕櫚酸甘油酯），而無溶劑時最佳底物摩爾比是6∶1（油酸∶三棕櫚酸甘油酯）。

Zheng等使用Candida lipolytica lipase合成OPO并探究了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、底物摩爾比等反應(yīng)參數(shù)對OPO產(chǎn)率的影響，最終優(yōu)化了反應(yīng)條件，使產(chǎn)品中OPO含量達(dá)到了46.5%。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時間2h、底物摩爾比6∶1（油酸∶三棕櫚酸甘油酯）、反應(yīng)體系含水量2%、酶用量20mg/mL。其中，合成OPO的反應(yīng)時間需要嚴(yán)格控制。過短的反應(yīng)時間會使油酸的摻入率過低，而過長的反應(yīng)時間與?；D(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)，進(jìn)而影響產(chǎn)物的純度。Lee等使用響應(yīng)面分析法發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時間為3h以及底物摩爾比為5.5∶1（油酸乙酯：含有三棕櫚酸甘油酯純度為92%的油脂）時可以在最大化提高OPO含量的同時發(fā)生最少的?；D(zhuǎn)移。

合成OPO時，反應(yīng)體系的pH也會對產(chǎn)率產(chǎn)生影響，因為不同脂肪酶表現(xiàn)出最大活性的pH不同。真菌來源的脂肪酶表現(xiàn)出最大活性的pH范圍為中性或者微酸性，而細(xì)菌來源的脂肪酶表現(xiàn)出最大活性的pH范圍為中性或者微堿性。

（2）酶固定化載體材料。在研究和工業(yè)生產(chǎn)中很少將游離酶作為催化劑使用，因為比起固定化酶，游離酶更易變性、壽命短、穩(wěn)定性低，且難以從反應(yīng)系統(tǒng)中回收并再利用。目前已經(jīng)有很多材料被用作酶的固定化載體，例如硅膠顆粒、大孔樹脂、二氧化硅納米顆粒、磁性碳納米管等。

不同的材料對酶活性有不同的影響。比起固定在親水性載體上，固定在疏水性載體材料上能讓脂肪酶更好地發(fā)揮催化作用。Tecelao等探究了Accurel? MP 1000， Lewatit? VP OC 1600和Eupergit? C三種固定載體材料對Rhizopus oryzae lipase的影響。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶固定在Accurel? MP 1000和Lewatit? VP OC 1600上時，油酸的摻入率最高，且固定在Lewatit? VP OC 1600上的酶擁有更長的半衰期。

（3）生物反應(yīng)器。利用酶促反應(yīng)生產(chǎn)目標(biāo)結(jié)構(gòu)的甘油三酯可以采用批處理和連續(xù)處理兩種方式進(jìn)行。批處理主要是在試管、燒杯或者攪拌釜式反應(yīng)器等容器中分批次對樣品進(jìn)行處理。由于其設(shè)計比較簡單，批處理過程中方便收集數(shù)據(jù)，所以在實驗室生產(chǎn)中較為常見。連續(xù)處理中使用的生物反應(yīng)器主要為填充床反應(yīng)器，更適合工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。比起在填充床反應(yīng)器中，酶促反應(yīng)的速率在批處理中更快。但在填充床反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)時，酶可以更好地被保護(hù)從而受到更少的機(jī)械損傷，而在攪拌釜式反應(yīng)器中，酶會受到更多的機(jī)械損傷從而導(dǎo)致每個批次反應(yīng)中酶活性的下降。Gu等在使用A. oryzae lipase合成OPO的研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪酶在填充床反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)時半衰期更長，為140h，而在反應(yīng)釜式反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)時，脂肪酶的半衰期只有24h。

三、乳粉中OPO的檢測

近年來，我國陸續(xù)發(fā)布有關(guān)OPO作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑的相關(guān)文件，強(qiáng)調(diào)了適用范圍及用量。同時，隨著OPO的生產(chǎn)制備工藝逐漸成熟，已有許多添加OPO的配方乳粉在市場上流通，但我國目前還未發(fā)布嬰幼兒配方乳粉中OPO含量的國標(biāo)檢測方法，不過已經(jīng)有很多研究人員嘗試使用高效液相色譜法、氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法檢測乳粉中的OPO，這些方法可以對未來國標(biāo)方法的建立提供技術(shù)支持。

張雪通過氣相色譜法使用十七烷酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，使用DB-1HT色譜柱、氫火焰離子化檢測器對已知OPO含量的嬰幼兒配方乳粉中的OPO含量進(jìn)行檢測。首先對樣品進(jìn)行水解（65℃-70℃，15min），然后使用乙醇、乙醚和石油醚對乳粉中的脂肪進(jìn)行三次提取。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑后，使用正己烷溶液定容樣品。該方法的線性范圍為0.1-0.5g/100g（r2=0.9999）;加標(biāo)回收率在87.89%-98.65%之間;重復(fù)性試驗得到的RSD為2.57%;檢出限為0.041g/100g，定量限為0.136g/100g。木其爾等通過氣相色譜法，以十七碳甘油三酯為內(nèi)標(biāo)，使用DB-1HT色譜柱、氫火焰離子化檢測器對乳粉中OPO的含量進(jìn)行測定。先對乳粉進(jìn)行水解（65±1℃，15min），然后使用無水乙醚和石油醚對乳粉中脂肪進(jìn)行兩次提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)醚溶液后，使用正己烷溶液定容樣品。此研究中的線性范圍為1-100 μg/mL（r2=0.997）;加標(biāo)回收率在90.0%-96.12%之間（RSD<5%）;方法檢出限為20μg/mg;定量限為70μg/mg;重復(fù)性試驗得到的RSD為1.52%。陸雪龍等通過氣相色譜法使用DB-1HT色譜柱、氫火焰離子化檢測器對嬰幼兒配方乳粉中的OPO含量進(jìn)行檢測。首先對樣品進(jìn)行水解（60℃，15min），然后使用無水乙醇、石油醚和乙醚通過離心法對脂肪進(jìn)行兩次提取。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑后，使用正己烷溶液定容樣品。該實驗中，使用離心機(jī)對樣品進(jìn)行提取，與毛氏抽脂法和分液漏斗法相比，離心法在更好地分離醚溶液的同時也縮短了提取時間，提高了檢測效率。此方法的線性范圍為0.10-5.00mg/mL（r2=0.99955），加標(biāo)回收率在90%-104%之間（RSD<5%）。

尚東洋等通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（使用毛細(xì)管色譜柱HP-5MS），使用外標(biāo)法對嬰幼兒配方乳粉中的OPO進(jìn)行了檢測。先對樣品進(jìn)行水解（60℃，15-20min），然后對脂肪進(jìn)行兩次提取。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑后，使用正己烷溶液定容樣品。該實驗的加標(biāo)回收率為86.0%-94.7%（RSD<5%），準(zhǔn)確度為1.73%。

經(jīng)魏婷婷等實驗證實，通過銀離子色譜柱-液相色譜法配合蒸發(fā)光散射檢測器可對甘油三脂的同分異構(gòu)體進(jìn)行分離并定量。楊貴芝通過此方法以正己烷-乙腈為流動相，對嬰幼兒配方乳粉中的OPO含量進(jìn)行了測定。首先按照準(zhǔn)GB 5413.3-2010中的第一法對乳粉中的脂肪進(jìn)行提取。設(shè)定漂移管溫度為60℃、氮?dú)饬魉贋?.6L/min。該方法的線性線性范圍為1.25-12.5g/kg （r2=0.9998）;回收率為82.8%-117%（RSD<10%）;檢出限為0.35g/kg;定量限為1.2g/kg。宋戈等通過此方法以二氯甲烷-丙酮為流動相，對嬰幼兒配方乳粉中的OPO進(jìn)行了測定。先對乳粉進(jìn)行水解（65 ±5℃，15-20min），然后使用乙醇、乙醚和石油醚通過離心對脂肪進(jìn)行三次提取，隨后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，使用二氯甲烷定容。該方法設(shè)定漂移管溫度為60℃、載氣流速為1.6L/min。此方法的線性范圍為1-1000mg/L（r2=0. 9998）;回收率為93.0%-101.5% （RSD<5%）;檢出限為20mg/kg。與氣相色譜法相比，銀離子色譜柱-液相色譜法可對OPO和OPP這一類同分異構(gòu)體進(jìn)行有效分離并準(zhǔn)確定量，但目前該方法所使用的銀離子色譜柱的穩(wěn)定性和使用率較低，對流動相的穩(wěn)定性要求較高，檢測所需時間較長。因此，對于液相色譜，如何在有效檢測OPO含量的前提下，對銀離子色譜柱的使用進(jìn)行優(yōu)化仍待研究。

四、結(jié)論與展望

嬰幼兒配方乳粉作為母乳的替代品，目前已在市場廣泛流通。OPO作為嬰幼兒配方乳粉中的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，可通過優(yōu)化配方乳粉的脂肪構(gòu)成，促進(jìn)嬰幼兒對配方乳粉營養(yǎng)的吸收和消化。因此，添加OPO的嬰幼兒乳粉具有巨大的市場潛力并將會成為未來母乳替代品中的主流產(chǎn)品。

目前OPO的主要制備方法是酶促合成法，但已有的大部分文獻(xiàn)所描述的方法只局限于實驗室中OPO的生產(chǎn)，因此如何擴(kuò)大OPO的生產(chǎn)規(guī)模并建立適合商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的反應(yīng)體系還有待進(jìn)一步探究。同時，開發(fā)催化效率更高的脂肪酶以縮短反應(yīng)的時間以及如何延長酶的使用壽命也有待更多的研究。

在乳粉中OPO的檢測技術(shù)中，氣相色譜法（氣相色譜儀-DB-1HT色譜柱-氫火焰離子化檢測器）和液相色譜法（液相色譜儀器-銀離子色譜柱-蒸發(fā)光散射檢測）均可準(zhǔn)確檢測出乳粉中OPO的含量，且均具有較高的穩(wěn)定性。但還未有研究者對乳粉中OPO的各種檢測技術(shù)以實驗的方式進(jìn)行過比對分析，因此，想要建立一個最佳的乳粉中OPO的檢測方法并建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，還需要在該領(lǐng)域進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

作者簡介：安雪征（1985-），男，本科，中級工程師，研究方向為食品檢驗檢測。

*通信作者：田云翼（1989-），男，碩士，中級工程師，研究方向為食品添加劑及配料。