全基因組拷貝數(shù)測序在頸項透明層增厚胎兒遺傳學(xué)檢查中的應(yīng)用價值

羅穎花， 劉百靈， 黃際衛(wèi)， 王遠(yuǎn)流， 曾定元， 唐 寧

[1.柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科，廣西 柳州 545001；2.柳州市婦幼保健院圍產(chǎn)保健科，廣西 柳州 545001；3.柳州市婦幼保健院中心實驗室（生物樣本庫），廣西 柳州 545001；4.柳州市婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣西 柳州 545001]

頸項透明層（nuchal translucency，NT）指胎兒頸后冠狀切面皮膚至皮下軟組織之間的最大厚度，超聲表現(xiàn)為胎兒正中矢狀切頸項后的帶狀無回聲。NT增厚與胎兒異常的關(guān)系十分密切，這些異常包括染色體非整倍體異常、非染色體異常的嚴(yán)重畸形及各類罕見的綜合征等[1]。染色體核型分析技術(shù)是產(chǎn)前染色體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于該技術(shù)分辨率較低，傳統(tǒng)核型分析技術(shù)不能檢測出5 Mb以下片段的染色體異常，也不能判斷某些異常染色體，如額外小標(biāo)記染色體（small supernumerary marker chromosome，sSMC）的來源，因此限制了傳統(tǒng)核型分析技術(shù)對染色體亞微結(jié)構(gòu)異常的檢出[2]。近年來，基于高通量測序的低深度全基因組拷貝數(shù)測序（whole-genome copy number variation sequencing，CNV-seq）技術(shù)發(fā)展迅速，已逐步被應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。CNV-seq技術(shù)具有分辨率高、通量高、成本低的特點，可以解決現(xiàn)階段產(chǎn)前診斷中傳統(tǒng)核型分析技術(shù)操作復(fù)雜、分辨率低的問題，有效彌補(bǔ)了傳統(tǒng)染色體核型分析的不足[3]。本研究擬通過CNV-seq技術(shù)對NT≥3.0 mm的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，在染色體核型分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行CNV-seq檢測，探討CNV-seq在NT增厚胎兒產(chǎn)前診斷中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1—12月柳州市婦幼保健院圍產(chǎn)保健門診就診，早孕期超聲篩查顯示胎兒NT≥3.0 mm的孕婦110例，進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷（絨毛或羊水取樣活檢術(shù)），同時進(jìn)行染色體核型分析及CNV-seq檢測。納入孕婦均簽署知情同意書。對所有納入孕婦進(jìn)行隨訪，記錄其妊娠結(jié)局。

1.2 超聲篩查NT

超聲檢查前告知孕婦早孕期胎兒超聲篩查的重要性與局限性，并遵循自愿原則，由孕婦自行簽署知情同意書。NT測量在正中矢狀切面上進(jìn)行，測量胎兒頸后皮膚內(nèi)緣至脊柱外軟組織的外緣間的最大距離。多次測量后，取測量最大值，以≥3.0 mm為NT增厚。介入性產(chǎn)前診斷穿刺術(shù)嚴(yán)格按產(chǎn)前診斷管理辦法[4]中的規(guī)定進(jìn)行。

1.3 染色體核型分析

絨毛或羊水取樣操作均嚴(yán)格按產(chǎn)前診斷管理辦法[4]中的規(guī)定進(jìn)行，所獲取的絨毛或羊水進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，以G顯帶染色（必要時加做C顯帶或N顯帶染色）制備染色體樣本，每例標(biāo)本按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（the International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）2016年標(biāo)準(zhǔn)，油鏡下分析20個分散程度好、中等長度的中期分裂相，發(fā)現(xiàn)嵌合體或異常核型時加數(shù)到100個分裂相[5]。

1.4 CNV-seq檢測

1.4.1 提取絨毛或羊水基因組DNA 采用基因組DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取基因組 DNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.2 DNA文庫構(gòu)建 采用Bioruptor NGS UCD-600非接觸式超聲波破碎儀（比利時Diagenode公司）將提取的基因組DNA打斷成小片段核酸。以打斷后的基因組DNA為起始模板，構(gòu)建文庫，采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增的方法進(jìn)行富集。采用磁珠純化方法對PCR擴(kuò)增后的DNA文庫進(jìn)行純化，從而得到DNA小片段文庫。

1.4.3 測序 將構(gòu)建好的DNA文庫通過NextSeq500測序平臺（美國Illumina公司）進(jìn)行測序，最小精度為100 kb，測序深度為1×。

1.4.4 生物信息學(xué)分析 將高通量測序結(jié)果經(jīng)信息分析，以hg19為參考序列，用Burrows-Wheel算法（英國劍橋桑格研究院）過濾無比對結(jié)果或比對評分低于參考基因組的讀序和重復(fù)讀序，保留比對質(zhì)量高且唯一的讀序（2.8～3.2 Mb）。基因組拷貝數(shù)為2.9～3.1判定為重復(fù)，基因組拷貝數(shù)為0.9～1.1判定為缺失。通過檢索基因組拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）國際數(shù)據(jù)庫（UCSC、DECIPHER、OMIM、ClinVar）、正常人基因組變異數(shù)據(jù)庫（DGV）、PubMed數(shù)據(jù)庫及查閱文獻(xiàn)，根據(jù)中國遺傳協(xié)會遺傳咨詢分會及美國醫(yī)學(xué)遺傳協(xié)會對CNV的推薦指南進(jìn)行CNV臨床意義的判定[3，6]。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果

110例胎兒NT增厚的孕婦樣本中，NT厚度為3.0～11.7 mm，檢出染色體核型異常26例，檢出率為23.6%（26/110），其中25例染色體非整倍體異常，包括21三體14例、18三體5例、13三體1例，45，X 4例{嵌合體2例[45，X（30）/46，XY（6）、45，X（4）/46，XY（32）]、47，XN，+2[18]/46，XN[82] 1例、47，XN，+mar[84]/46，XN，[21] 1例}。

2.2 CNV-seq檢測結(jié)果

CNV-seq檢出異常36例，檢出率為32.7%（36/110），包含染色體核型異常26例。CNV-seq檢出了染色體核型分析未能檢出的3例染色體微缺失及7例微重復(fù)，其中7例為臨床意義未明變異，3例為可疑致病性變異。見表1、表2。

表1 不同NT厚度核型分析及CNV-seq檢測結(jié)果

表2 10例染色體微缺失/重復(fù)的CNV-seq檢測結(jié)果及孕婦妊娠結(jié)局

通過C N V-seq檢測明確定位染色體核型分析發(fā)現(xiàn)的1例胎兒攜帶的sSMC來源于12 p13.33-p11.1，重復(fù)片段長度為34.66 Mb，具體區(qū)域為seq[hg19]dup（12）（p13.33p11.1）（mos） chr12：g.160001_34820000dup，嵌合比例達(dá)20%，嵌合比例與核型分析基本一致，見圖1。對此例胎兒的父母進(jìn)行了染色體核型檢查，均未見異常。

圖1 異常核型47，XN，+mar[84]/46，XN[21]及CNV-seq檢測結(jié)果

續(xù)表2

3 討論

NT檢查是早期發(fā)現(xiàn)胎兒異常的一種有效的影像學(xué)方法，NT增厚提示胎兒發(fā)生異常的可能性升高。WESTIN等[7]的研究結(jié)果顯示，當(dāng)NT≥3 mm時，胎兒發(fā)生嚴(yán)重或致死性畸形的可能性是NT正常者的15倍，胎兒染色體異常的風(fēng)險隨NT厚度的增加而升高。當(dāng)NT厚度為3.0～3.4、3.5～4.4、4.5～6.4、>8.5 mm時，染色體異常的發(fā)生率分別為7%、20%、50%、75%[8]。

本研究結(jié)果顯示，在110例胎兒NT增厚的孕婦中，CNV-seq檢出異常36例，檢出率為32.7%。胎兒NT厚度為3.0～3.4、3.5～4.4、4.5～6.4、>6.4 mm時，染色體異常率分別為27.3%（12/44）、32.4%（12/37）、35%（7/20）和55.6%（5/9），提示NT厚度的增加與胎兒染色體異常的發(fā)生率有關(guān)。對于26例染色體核型分析異常的孕婦，CNV-seq及染色體核型分析的檢出率均為100%，但其中1例胎兒的sSMC采用染色體核型分析只能發(fā)現(xiàn)數(shù)目增加，無法判斷標(biāo)記染色體的來源及片段長度；而采用 CNV-seq檢測可確定該異常核型47，XN，+mar[84]/46，XN[21] 中sSMC來源于12 p13.33-p11.1（34.66Mb，嵌合比例為20%），父母既往身體健康，無特殊面容，無家族性遺傳病史，染色體核型未見異常，此sSMC可能為新發(fā)變異。12p重復(fù)綜合征可引起面部異常、不同程度的發(fā)育遲緩和智力障礙、張力減退、聽力喪失及其他系統(tǒng)性異常，在新生兒中的發(fā)生率為1/50 000[9-10]。孕婦經(jīng)遺傳咨詢后于孕13+2周終止妊娠。雖然sSMC在產(chǎn)前診斷中的檢出率較低，但一旦發(fā)生，需要結(jié)合夫妻雙方染色體核型、胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常和不良孕產(chǎn)史，通過細(xì)胞遺傳學(xué)及CNV-seq或基因芯片檢測結(jié)果進(jìn)行明確診斷，準(zhǔn)確判斷sSMC的性質(zhì)、來源和致病性對sSMC的產(chǎn)前遺傳咨詢和妊娠結(jié)局選擇具有非常重要的臨床意義[11]。

本研究結(jié)果顯示，CNV-seq檢出了染色體核型分析未能檢出的3例染色體微缺失及7例微重復(fù)，由表1可見，1號樣本CNV-seq檢測結(jié)果為seq[hg19]del（12）（q21.1q21.2） chr12：g.73240001_76520000del，包含11個基因。RAJAKULENDRAN等[12]在一個家系中檢測到3例12q21.1缺失患者，先證者主要的臨床表征為運(yùn)動功能發(fā)育遲緩、認(rèn)知障礙、短頭畸形、特殊面容、語言缺乏、髓鞘形成延遲等，先證者兄弟主要的臨床表征為語言功能發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)困難、平衡力差、眼球震顫、輕度肢體共濟(jì)失調(diào)等，先證者母親主要的臨床表征為發(fā)育遲緩、語言功能發(fā)育遲緩、眼球震顫、輕度肢體畸形等。DECIPHER數(shù)據(jù)庫收錄了2例該缺失片段患者，其中1例患者（Patient 290009）的主要臨床表征為智力障礙、身材矮??；另1例患者（Patient 261582）的主要臨床表征為自閉癥、球形鼻、聽覺過敏、牙齒發(fā)育不全、上腭狹窄、女性性早熟等。12q21.1q21.2微缺失與認(rèn)知、語言、運(yùn)動、學(xué)習(xí)等發(fā)育密切相關(guān)，此類影響無法通過產(chǎn)前影像學(xué)檢查進(jìn)行判斷，通過CNV-seq分析可以對胎兒出生后的生長發(fā)育情況進(jìn)行預(yù)判，克服影像學(xué)檢查在認(rèn)知、語言等發(fā)育方面的局限性，從而對胎兒父母進(jìn)行優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)。本研究表1中的1號樣本經(jīng)CNV-seq分析后，胎兒父母在了解胎兒生長發(fā)育的風(fēng)險后選擇終止妊娠。表1中的2號樣本CNV-seq檢測結(jié)果為seq[hg19]del（15）（q11.2） chr15：g.22760000_23100000del缺失0.34Mb，包含基因有TUBGCP5、NIPA1、LOC283683、CYFIP1、NIPA2。COX等[13]發(fā)現(xiàn)的1例15q11.2（chr15：22821537-23085400，hg19）缺失患者的主要臨床表征為動脈導(dǎo)管未閉、卵圓孔未閉、近端食管閉鎖、遠(yuǎn)端氣管食道瘺（C 型）、輕度漏斗胸、母親孕期羊水過多等，該區(qū)域缺失患者臨床表型多樣，且存在外顯不全的情況。本研究中的2號樣本對應(yīng)的胎兒產(chǎn)前未觀察到與文獻(xiàn)報道[13]類似的癥狀，查詢OMIM數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)該胎兒缺失區(qū)域包含痙攣性截癱6（OMIM 600363）的致病基因NIPA1。NIPA1的點突變可導(dǎo)致痙攣性截癱6，為常染色體顯性遺傳，胎兒出生后存在患此病的風(fēng)險，建議胎兒父母進(jìn)行CNV檢測，以明確胎兒此變異的來源，進(jìn)一步明確其致病性，但胎兒父母不同意檢測，并堅持繼續(xù)妊娠，孕婦于孕38+4周時剖宮產(chǎn)娩出1名男嬰，體質(zhì)量為2.9 kg，出生后亦未發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報道[13]類似的癥狀及痙攣性截癱，其后期生長發(fā)育情況有待進(jìn)一步追蹤。表1中3號樣本的CNV-seq檢測結(jié)果為seq[hg19]dup（22）（q11.21）chr22：g.18940001_21800000dup，重復(fù)2.86 Mb區(qū)域，覆蓋了22q11微重復(fù)綜合征的全部區(qū)域，22q11微重復(fù)綜合征存在外顯不全的情況，患者臨床表型從正?；蜉p微異常到嚴(yán)重，變化幅度較大；最常見的臨床癥狀有：智力障礙（97%）、精神運(yùn)動發(fā)育遲滯（67%）、生長受限（63%）、肌張力低下（43%）、說話鼻音重（44.4%）等[14]。盡管存在外顯不全的情況，大部分22q11微重復(fù)還是存在輕重不一的表型，與其相關(guān)的智力、精神、運(yùn)動發(fā)育問題在出生后才逐步顯現(xiàn)。本研究中3號樣本對應(yīng)的孕婦經(jīng)CNV-seq分析和遺傳咨詢，在了解胎兒生長發(fā)育的風(fēng)險后選擇終止妊娠。

本研究表1中的4～10號樣本采用CNV-seq檢測，發(fā)現(xiàn)存在染色體微缺失/重復(fù)，其中4號樣本8q21.12q21.13缺失4.58 Mb，包含21個基因，其中PMP2是腓骨肌萎縮征（OMIM：618279）的致病基因，為常染色體顯性遺傳，胎兒出生后存在患此病的風(fēng)險，建議胎兒父母進(jìn)行CNV檢測以明確胎兒此變異的來源，進(jìn)一步明確其致病性，但胎兒父母不同意檢測并堅持繼續(xù)妊娠，于孕38+3周順產(chǎn)1名男嬰，體質(zhì)量3.0 kg，其后期生長發(fā)育情況有待進(jìn)一步追蹤。5號樣本8q12.1q12.3重復(fù)1.66 Mb，包含6個基因，其中包含CHD7基因（OMIM 608892）的全部，該基因的突變與CHARGE綜合征相關(guān)，為常染色體顯性遺傳，目前尚無CHD7基因重復(fù)導(dǎo)致CHARGE綜合征的報道，該變異致病性未明，建議胎兒父母進(jìn)行CNV檢測以明確胎兒此變異的來源，進(jìn)一步明確其致病性，孕婦選擇終止妊娠，但未進(jìn)一步檢測。6號樣本5q23.2重復(fù)1.4 Mb，包含6個基因，其中ALDH7A1是常染色體隱性遺傳癲癇的致病基因，其余5個基因的功能不明確，該變異致病性未明，建議胎兒父母進(jìn)行CNV檢測以明確胎兒此變異的來源，進(jìn)一步明確其致病性，孕婦選擇終止妊娠，但未行進(jìn)一步檢測。

對于本研究表1中7～10號樣本的CNV，通過檢索UCSC、DECIPHER、ClinVar、DGV、PubMed等數(shù)據(jù)庫及查閱文獻(xiàn)，均未見相關(guān)報道。在包含的基因中未發(fā)現(xiàn)與疾病密切相關(guān)的基因，因胎兒父母未同意進(jìn)行CNV檢測，胎兒的CNV來源不明。胎兒出生后的生長發(fā)育情況是否與CNV有關(guān)還有待進(jìn)一步追蹤，其臨床意義有待進(jìn)一步明確。

綜上所述，NT檢測是早期產(chǎn)前篩查發(fā)現(xiàn)胎兒異常的一種有效方法[15]，結(jié)合染色體核型分析及CNV檢測能有效提高染色體異常的檢出效率。染色體核型分析及CNV檢測能覆蓋大部分染色體的異常。CNV-seq檢測雖然不能檢測染色體平衡易位、倒位，但可檢測染色體微缺失/重復(fù)、sSMC，提高了對染色體異常的檢測水平，可獲得更多的遺傳學(xué)信息，為NT增厚評估及遺傳咨詢提供更優(yōu)的參考。