黑果枸杞化學(xué)成分的UPLC-Triple TOF/MS分析及其總花色苷類含量測(cè)定

甘小娜，王輝俊，李廷釗，李 波,*

（1.安利（中國(guó)）研發(fā)中心，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurry）為茄科枸杞屬植物，主要產(chǎn)區(qū)分布在我國(guó)青海、甘肅、新疆等地，因其果實(shí)具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能而廣為人知。黑果枸杞含有多糖、黃酮、生物堿、類胡蘿卜素及微量元素[1-4]等，在西北地區(qū)是一種著名的藥用漿果，多年來一直被用于民間傳統(tǒng)醫(yī)藥；據(jù)藏藥經(jīng)典《晶珠本草》記載，黑果枸杞可用于治療心臟病、月經(jīng)不調(diào)及更年期等疾病[5]；現(xiàn)代科學(xué)研究表明，黑果枸杞具有抗氧化、抗疲勞、抗輻射、抗痛風(fēng)、改善記憶[6-10]等功能。

花色苷是一類廣泛分布于植物花瓣、果實(shí)中的水溶性色素，具有良好的抗氧化能力[11]，其清除自由基的能力甚至大于常見的抗氧化劑如VE、兒茶素、槲皮素和丁基羥基茴香醚[12]。另外花色苷還具有抗腫瘤、抗心血管疾病等多種生物活性，已被建議應(yīng)用于植物產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)[13]。黑果枸杞因含有豐富的花色苷類成分，民間稱之為“花色苷之王”。目前黑果枸杞中活性成分的定量分析主要集中在多酚類和花色苷類成分上，主要采用pH示差法、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和高效液相色譜法[14-18]。pH示差法操作簡(jiǎn)單，但只能用于總花色苷的評(píng)價(jià)，無(wú)法評(píng)估單個(gè)化合物的含量；定量質(zhì)譜靈敏度高、選擇性好，但其對(duì)流動(dòng)相的選擇范圍相對(duì)較窄，且對(duì)植物提取物的分析來講，定量質(zhì)譜的使用和維護(hù)成本較高；超高效液相色譜分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣，已被廣泛運(yùn)用于不同的領(lǐng)域[19-20]。本研究采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)黑果枸杞中化合物進(jìn)行推斷；使用超高效液相色譜，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品，采用半定量的方式，建立黑果枸杞干果中總花色苷類成分的定量分析方法，并收集23 批市場(chǎng)上不同來源的樣品進(jìn)行測(cè)定分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品由安利（中國(guó)）研發(fā)中心提供，由安利（中國(guó)）研發(fā)中心李波博士鑒定，編號(hào)分別為HGQ-1～HGQ-23，存放于安利（中國(guó)）研發(fā)中心樣品庫(kù)。全部樣品經(jīng)鑒定為茄科植物黑果枸杞Lycium ruthenicumMurray的果實(shí)，詳細(xì)信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Information about samples tested in this study

甲酸（色譜純） 美國(guó)Honeywell公司；甲醇、乙腈、甲酸、磷酸、三氟乙酸（均為色譜純） 美國(guó)Fisher公司；鹽酸（分析純） 上海泰坦科技股份有限公司；超純水由美國(guó)密理博Milli-Q超純水儀制備；其他試劑均為分析純。對(duì)照品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（純度≥98%） 上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜配二極管陣列檢測(cè)器、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）美國(guó)Waters公司；1290 UPLC超高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；Triple TOF?4600高分辨質(zhì)譜美國(guó)AB SCIEX公司；WF-600EHT型超聲波清洗機(jī)寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司；XS2051/10電子天平梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果枸杞中化學(xué)成分分析

1.3.1.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A為10%甲酸溶液，流動(dòng)相B為甲酸-水-甲醇-乙腈（1∶5∶2∶2，V/V）；流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～9 min，85%～80% A，15%～20% B；9～20.5 min，80%～65% A，20%～35% B；20.5～25 min，65%～85% A，35%～15% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)為質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 700；霧化氣壓力50 psi；氣簾氣壓力35 psi；離子源電壓5 000 V；離子源溫度500 ℃；去簇電壓100 V；碰撞能量10 eV。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)為質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 250；去簇電壓100 V；碰撞能量40 eV；碰撞能量擺幅20 eV。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

取黑果枸杞干果適量，于液氮中速凍2 min，快速轉(zhuǎn)移至打粉機(jī)中進(jìn)行粉碎，取粉末于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)一步脫水，得疏松干燥的黑果枸杞粉末。

精密稱取黑果枸杞粉末約200 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加入2%甲酸-甲醇溶液10 mL，冰浴超聲20 min，靜置15 min，加10%甲酸溶液定容，搖勻，溶液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，待用。

1.3.2 黑果枸杞中花色苷類成分的含量測(cè)定

黑果枸杞花色苷類成分的色譜定量分析大多采用半定量方法，標(biāo)準(zhǔn)品主要有氯化錦葵素-3,5-O-二葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[15-16]。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[16]，選擇矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，考察其在本實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在4 ℃條件下11 d內(nèi)穩(wěn)定性良好，Y=kX+b為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷質(zhì)量濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；黑果枸杞的總花色苷含量以該化合物為參考，按下式計(jì)算：

式中：A總為供試品中所有花色苷的峰面積之和；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的截距；V為供試品的體積/mL；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率；M為供試品的質(zhì)量/mg。

1.3.2.1 色譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)530 nm。流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸-10%甲酸溶液，流動(dòng)相B為甲酸-水-甲醇-乙腈（1∶5∶2∶2，V/V），洗脫梯度程序同1.3.1.1節(jié)。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷適量，置于5 mL棕色容量瓶，加2%鹽酸-甲醇溶液定容，搖勻，待用。

1.3.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取黑果枸杞粉末200 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加入2%鹽酸-甲醇溶液10 mL，冰浴超聲20 min，靜置15 min，加10%磷酸溶液定容，搖勻，溶液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，待用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采集和分析軟件分別為Analyst 1.7.1、Peakview 1.2.0.3、Empower 3FR4和Excel 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)方法的優(yōu)化

2.1.1 樣品干燥方法的選擇

花色苷類成分化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，高溫對(duì)其穩(wěn)定性影響顯著[21-22]。本實(shí)驗(yàn)采用液氮速凍即時(shí)粉碎及冷凍干燥的方法，實(shí)現(xiàn)黑果枸杞樣品的低溫粉碎和干燥，得到疏松干燥、流動(dòng)性好的粉末，避免了長(zhǎng)時(shí)間粉碎產(chǎn)生的熱量對(duì)樣本可能造成的影響，也減小了在普通粉碎后樣品易粘的狀態(tài)對(duì)稱樣造成的誤差。

2.1.2 提取方法的選擇

花色苷類化合物在酸性條件下比較穩(wěn)定[23-24]，因此，本實(shí)驗(yàn)采用高濃度的鹽酸-甲醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行提取。前期比較使用同體積2%甲酸-甲醇溶液與2%鹽酸-甲醇溶液對(duì)黑果枸杞粉末進(jìn)行提取，前者的提取率約為后者的90%，見圖1；另外，為避免超聲發(fā)熱對(duì)化合物穩(wěn)定性的影響，在提取時(shí)采用冰浴超聲的方式。

圖1 黑果枸杞不同溶劑提取物色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of different solvent extracts of LRM

2.1.3 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相中添加三氟乙酸，對(duì)花色苷類成分的分離度有明顯改善，因此本實(shí)驗(yàn)在用液相色譜定量分析黑果枸杞花色苷類成分時(shí)加入了三氟乙酸；然而為避免不揮發(fā)性試劑對(duì)質(zhì)譜儀造成損耗，在定性鑒別實(shí)驗(yàn)中，樣品制備時(shí)將定量分析前處理中的鹽酸及磷酸替換為甲酸，并去掉了流動(dòng)相A中的三氟乙酸。

2.2 黑果枸杞化學(xué)成分的鑒定

取供試品溶液按上述條件進(jìn)行分析，得到黑果枸杞樣品的質(zhì)譜圖（圖2）。分別對(duì)其中的質(zhì)譜峰進(jìn)行分析，根據(jù)樣品多級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合天然產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)黑果枸杞中的化合物進(jìn)行推斷，共鑒定出30 個(gè)化合物，其中花色苷類成分13 個(gè)，生物堿類成分13 個(gè)，結(jié)果見表2。

表2 黑果枸杞化學(xué)成分質(zhì)譜鑒定信息Table 2 Mass spectral data of identified compounds in LRM

圖2 黑果枸杞化學(xué)成分的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of chemical constituents in LRM

2.3 總花色苷含量測(cè)定的方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加10%磷酸溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.005、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按1.3.2.1節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=16 663 335.9X-11 190.0，R=0.999 9。表明矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在0.005～0.08 mg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

吸取質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，如表3所示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.20%，說明儀器精密度良好。

表3 精密度結(jié)果Table 3 Results of precision test

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取同一批次樣品粉末（HGQ-1）6 份，每份200 mg。按1.3.2.3節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.2.1節(jié)方法進(jìn)樣。采用外標(biāo)法，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品，以樣品色譜圖中各峰的峰面積總值計(jì)算總花色苷含量。如表4所示，平均值為2.82%，RSD為1.49%，表明方法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性結(jié)果Table 4 Results of repeatability test

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取供試品溶液，分別于0、2、4、8、20、24、48 h及8 d（192 h）進(jìn)樣，每次2 μL，結(jié)果花色苷峰面積總值變化很小，RSD為0.95%，表明供試品在4 ℃、8 d內(nèi)穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表5。同時(shí)考察室溫下的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，室溫放置48 h，花色苷峰面積值與初始值相當(dāng)，8 d后，峰面積值降為初始值的90.4%。

表5 穩(wěn)定性結(jié)果Table 5 Results of stability test

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精密稱取黑果枸杞樣品粉末適量于100 mL棕色容量瓶中，按表6加入標(biāo)準(zhǔn)品粉末，按1.3.2.3節(jié)方法制備黑果枸杞樣品并進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見表6。

2.4 樣品的花色苷含量測(cè)定

精密稱取23 批次來源不同的黑果枸杞粉末各200 mg，按1.3.2.3節(jié)方法制備供試品溶液，再按1.3.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣并分析，結(jié)果見圖3、表7。

圖3 黑果枸杞樣品提取物色譜圖Fig.3 UPLC chromatograms of LRM samples extracts

表7 樣品中花色苷的含量測(cè)定結(jié)果Table 7 Contents of anthocyanins in LRM samples determined by UPLC

2.5 不同產(chǎn)地樣品對(duì)比

對(duì)不同產(chǎn)地即青海、新疆和寧夏之間黑果枸杞中總花色苷的含量進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示，并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P=0.084）。

圖4 不同產(chǎn)地黑果枸杞樣品中總花色苷含量的顯著性分析Fig.4 Significance analysis of differences in total anthocyanin contents in LRM from different habitats

3 結(jié) 論

黑果枸杞中的花色苷類成分具有較高的抗氧化活性[29]。本研究通過超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，從黑果枸杞中共鑒定出13 個(gè)花色苷，質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息顯示，其中的花色苷類成分大多出現(xiàn)m/z317.06的離子碎片，提示其苷元大多為矮牽牛素，該結(jié)果與之前報(bào)道的數(shù)據(jù)吻合[30]。色譜分析結(jié)果顯示，不同地區(qū)的花色苷類成分指紋圖譜相似度比較高；本研究可為黑果枸杞的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考，為黑果枸杞的進(jìn)一步開發(fā)利用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。