結(jié)核分枝桿菌來源翻譯延伸因子EF-G的蛋白純化、表征分析及蛋白晶體學研究*

楊 妍 張彥生 姚中達 何潤嘉 葛春坡 楊 赟

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學系 河南新鄉(xiāng) 453003）

蛋白質(zhì)合成途徑中存在著許多潛在的抗生素靶點，其中包括翻譯延伸因子（elongation factor，EF-G）[1-2]。作為GTPases 翻譯因子家族中的一員，EF-G 具有常見的GTP 酶激活機制及核糖體結(jié)合模式[3-4]。 結(jié)核病（tuberculosis，TB）是一種由結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的世界性傳染性疾病[5]。結(jié)核分支桿菌主要攻擊人體肺部，同時也會損害身體的其他部位。此外，攜帶人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的人群患結(jié)核病的可能性要高出15～22 倍。

夫西地酸（fusidic acid，F(xiàn)A）是一種應(yīng)用于臨床的抗生素。GTP 水解和易位后，夫西地酸將性糖反應(yīng)，產(chǎn)生磚紅色沉淀。本尼迪特試劑在儲藏方面優(yōu)于斐林試劑，在本實驗中也可體現(xiàn)。觀察比較未加葡萄糖的斐林試劑組1 號管和本尼迪特試劑組1 號管顏色變化。斐林試劑組1 號管實驗開始時含Cu（OH）2藍色絮狀沉淀，之后在高溫下逐漸分解產(chǎn)生黑色的CuO 沉淀。而本尼迪特試劑組1 號管在整個實驗過程中均呈現(xiàn)藍色澄清溶液，未發(fā)生明顯變化。從側(cè)面證明，斐林試劑不耐儲藏，EF-G 固定在核糖體復(fù)合物上[6]。已有研究表明，夫西地酸對結(jié)核病具有抑制作用[5]。因此，結(jié)核分支桿菌對夫西地酸的敏感性一直是研究熱點。

來源于結(jié)核分支桿菌的EF-G 基因與大腸桿菌（Escherichia coli）、嗜熱桿菌（Thermus thermcphilus）和金黃色葡萄球菌（Staphylcoccus aureus）的同源物的序列一致性較高，分別為59.2%、61.2%和61.3%。目前已對大腸桿菌（PDB：1JQM）、嗜熱菌（PDB：1PN6）和金黃色葡萄球菌（PDB：3ZZ0）來源的EF-G 進行了相應(yīng)的結(jié)構(gòu)分析。然而，有關(guān)結(jié)核分枝桿菌來源于EF-G 的結(jié)構(gòu)研究報道卻很少。對結(jié)核分枝桿菌來源的EF-G 的結(jié)構(gòu)分析將有助于在FA 的基礎(chǔ)上研發(fā)治療結(jié)核病的新型藥物。

在本研究中，報道了EF-G 的蛋白純化、結(jié)晶和表征分析，為利用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計開發(fā)新型抗結(jié)核藥物提供幫助，并闡明分離出的耐FA結(jié)核分枝桿菌中關(guān)鍵氨基酸的精確定位。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建、蛋白表達及純化 利用Genewiz密碼子優(yōu)化技術(shù)合成編碼結(jié)核分枝桿菌EF-G 的核苷酸序列（UniProt Access Number P9WNM7），并將其插入到pSMT28 載體（改良的6×His-SUMO pET28b+載體）中構(gòu)建成質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 中。使用含50 μg/mL 氯霉素、100 μg/mL 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基，37°C、200 r/min 培養(yǎng)細胞。在37℃培養(yǎng)條件下，待LB 培養(yǎng)基中細胞培養(yǎng)物的OD600達到0.6～0.8 時，加入IPTG 使其終濃度為0.5 mmol/L，在20 ℃條件下作用20 h 以誘導蛋白表達。

以8 000 r/min、離心15 min 后收集細胞。隨后加入裂解液30 mL 重懸細胞，該裂解液含有：50 mmol/L Tris（pH=8.0）、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、2 mmol/L BME。使用高壓勻漿機（1 000 bar）破碎細胞壁后，在4℃、18 000 r/min 條件下離心1 h 以清除細胞碎片。將上清液裝入HisTrap HP柱上，分別添加50 mmol/L 咪唑和250 mmol/L 咪唑的裂解緩沖液中洗脫蛋白。經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析后，使用Ulp1 酶對洗脫蛋白進行酶切，去除6×His-SUMO 標簽。

使用Superdex 200 16/600 色譜柱濃縮樣品后，將樣品再次裝入HisTrap HP 柱，用分別添加50 mmol/L 咪唑和250 mmol/L 咪唑的裂解緩沖液洗脫蛋白后，采用分子篩純化后用超濾管對蛋白進行濃縮。使用Bradford 法測定蛋白濃度，并利用12% SDS-PAGE 分析樣品純度。

1.2 蛋白結(jié)晶 將蛋白質(zhì)濃縮至約20 mg/mL。在晶體篩選實驗前，將樣品在4℃、12 000 r/min，條件下離心10 min 澄清樣品。采用坐滴式蒸汽擴散法在96 孔板上進行初篩，通過蛋白質(zhì)濃度、pH 值或沉淀劑濃度的變化對初始條件進行修正。

1.3 X 射線衍射數(shù)據(jù)采集與處理 通過上海同步輻射裝置（Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF）的BL17U 光束線采集得到X 射線衍射數(shù)據(jù)，波長為0.09793 nm。晶體到探測器的距離為350 mm，曝光時間為1 s/幀，振蕩范圍為1.0°。晶體采集分辨率為0.32 nm。使用HKL-2000 對原始衍射數(shù)據(jù)進行索引、整合、縮放和合并。

1.4 小角X 射線散射數(shù)據(jù)采集與處理 在4℃、12 000 r/min 條件下離心10 min 以澄清樣品。在上海同步輻射裝置（SSRF）的BL19U2 光束線上采集得到小角X 射線散射（small-angle X-ray scattering，SAXS）數(shù)據(jù)。在20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.4）、100 mmol/L NaCl 緩沖液中制備樣品，濃度為0.75～3 mg/mL。從3 組20 張圖像中整合并平均得到結(jié)果數(shù)據(jù)，并使用緩沖幀以消除背景。采用間接傅里葉變換方法估算顆粒的回轉(zhuǎn)半徑（Rg），由最大維數(shù)Dmax計算顆粒P（r）的對分布。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 重組EF-G 的純化 使用SUMO 標簽蛋白增加蛋白質(zhì)的可溶性表達[7-8]。將EF-G 基因插入到pSMT28 載體中。隨后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）細胞內(nèi)，以獲得高表達的6×His-SUMO標簽融合蛋白，分子量約為91 kDa（圖1A）。

圖1 蛋白表達及純化

經(jīng)鎳親和層析獲得大量的可溶性重組蛋白。使用SUMO 特異性蛋白酶Ulp1，去除6×His-SUMO 標簽[9]。經(jīng)第2次Ni-NTA 層析得到的無標記蛋白的分子量約為77 kDa，與理論分子一致（圖1B）。然后，用凝膠滲透色譜法對純度較高的EF-G 進行純化，在79 mL 處出現(xiàn)一個峰洗脫（圖1C）。所有純化步驟用12 % SDS-PAGE 檢測。

2.2 結(jié)晶和X 射線的初步分析 在不同的結(jié)晶條件下（表1），EF-G 在3～4 周內(nèi)出現(xiàn)小晶體（圖2）。

表1 結(jié)晶條件

圖2 蛋白結(jié)晶

通過改變沉淀劑濃度、蛋白質(zhì)濃度、緩沖液pH 值和添加劑，對結(jié)晶條件進行了優(yōu)化。在JCSG+A3［0.2 mol/L 檸檬酸三銨，22%（W/W）PEG3350］的優(yōu)化條件下，可得到較大的晶體。X 射線衍射數(shù)據(jù)是從單晶中進行收集，最高分辨率為0.383 nm（圖3B）。EF-G的數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計處理如表2所示。空間群屬于P61，晶胞參數(shù)a=26.079 nm，b=26.079 nm，c=6.28 nm；α=β=90.00°，γ=120.00°。

圖3 X-射線衍射數(shù)據(jù)采集與處理

表2 初步x 射線晶體學研究

2.3 SAXS 分析 使用SAXS 方法檢索EF-G 在溶液中的分子形狀。根據(jù)吉尼耶圖（Guinier plot）計算得到回轉(zhuǎn)半徑（Rg）為3.649 nm。而距離分布函數(shù)P（r），則由最大距離計算得出為13.03 nm。根據(jù)P（r）確定的回轉(zhuǎn)半徑（Rg）為3.667 nm，與Guinier分析計算的Rg相近似（圖4A～4C）。SAXS 實驗結(jié)果表明，EF-G 在溶液中形成了相對剛性的結(jié)構(gòu)。

圖4 SAXS 分析

3 討論

來源于大腸桿菌[10]、嗜熱鏈球菌[11]及金黃色葡萄球菌[12]EF-G 的結(jié)構(gòu)揭示了其在蛋白質(zhì)合成中的作用機制。雖然結(jié)核分枝桿菌來源的EF-G與其同源物的序列一致性很高，但有關(guān)結(jié)核分枝桿菌來源EF-G 的結(jié)構(gòu)尚未見報道。本研究收集了EF-G 的X 射線散射數(shù)據(jù)。目前，正在嘗試以金黃色葡萄球菌來源的EF-G（PDB：2xex）的結(jié)構(gòu)作為搜索模型[12]，采用分子置換（molecular replacement，MR）方法進行測定。

此外，關(guān)于目標蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)尚未明確，其相關(guān)檢測目前也正在進行。本實驗室將在這方面進行進一步的研究。SAXS 實驗是一種提取溶液中蛋白質(zhì)分子形狀的方法[13-14]。經(jīng)SAXS 分析表明，EF-G 在溶液中為致密結(jié)構(gòu)蛋白。除此之外，EF-G 還可作為一個藥物靶點[1]。因此，對EFG 結(jié)構(gòu)的分析將為抗結(jié)核病新藥的開發(fā)奠定重要的理論基礎(chǔ)。