響應(yīng)面法優(yōu)化洋紫荊花瓣花色苷提取工藝及其抗氧化活性

楊曉娜 陳自宏 姜龍?jiān)?徐 玲 謝雯穎 趙海云

（1 保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院 云南保山 678000 2 大理州食品檢驗(yàn)檢測(cè)院 云南大理 67100）

洋紫荊（Bauhinia variegata）為蘇木科羊蹄甲屬半落葉喬木，是一種良好的觀賞和蜜源植物[1]。在中國(guó)主要分布在福建、廣東、廣西、云南等地，同時(shí)還分布于越南、印度、古巴等地，且世界各國(guó)均有栽培[2]。洋紫荊花瓣較大，顏色鮮艷，略微帶芳香味，花期為每年11月至次年4月，常作為行道樹(shù)種植在道路旁，其自然飄落的花瓣，經(jīng)常作為垃圾廢棄，浪費(fèi)了寶貴的天然色素資源。因此，挖掘洋紫荊花色苷的提取工藝，探究其抗氧化活性，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型染料，提高洋紫荊的綜合利用具有重要意義。

花色苷屬于黃酮類物質(zhì)，存在于植物的果實(shí)、根、莖、葉、花等器官中。其作為一種天然食用色素，安全、無(wú)毒、資源豐富，具有一定的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用，在食品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著巨大應(yīng)用潛力[3]?；ㄉ諏?duì)人體具有許多保健功能，例如，清除體內(nèi)自由基、抗腫瘤、抗癌、抗炎、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和血小板凝集、預(yù)防糖尿病、減肥、保護(hù)視力等[4]。國(guó)內(nèi)、外對(duì)洋紫荊的研究主要集中在生物學(xué)特性[5]、種子繁殖[6-8]、無(wú)性繁殖[9-10]、觀賞價(jià)值及藥用價(jià)值[11-14]等方面。羊蹄甲屬的紅花羊蹄甲花瓣中的花色苷的提取方法包括有機(jī)溶劑法、微波法及超聲波法，均以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)。而以洋紫荊為實(shí)驗(yàn)材料，以花色苷含量為指標(biāo)，且運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化花色苷提取工藝及抗氧化活性的研究鮮有報(bào)道。本研究采用有機(jī)溶劑法提取洋紫荊花瓣中的花色苷，討論乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響，通過(guò)單因素方差分析建立花色苷含量與單因素之間的關(guān)系，通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)洋紫荊花色苷進(jìn)行體外抗氧化能力分析。既能豐富和完善響應(yīng)面法優(yōu)化植物花色苷提取工藝的研究，又能促進(jìn)天然色素的開(kāi)發(fā)和利用，為實(shí)現(xiàn)洋紫荊綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用品

材料：洋紫荊（花期為11月至次年4月）花瓣，材料來(lái)源于保山市潞江壩。將洋紫荊花瓣置于室內(nèi)陰涼處自然晾干，粉碎機(jī)粉碎，分別過(guò)100 目、80 目、60 目、40 目、20 目篩，裝袋封存，避光備用。

主要試劑：無(wú)水乙醇、醋酸鈉、氯化鉀、鹽酸、乙酸、蒸餾水、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、雙氧水等均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：XBLL-25Ak 快樂(lè)小貝食品料理機(jī)（上海帥佳電子科技有限公司）、標(biāo)準(zhǔn)篩（浙江上虞市道墟五四儀器廠）、CP114 電子分析天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］、UV-5100 紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（安徽皖儀科技股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 洋紫荊花色苷最大吸收波長(zhǎng)的確定方法單因素的固定條件為浸泡時(shí)間2 h、提取劑的濃度為0.1%鹽酸-乙醇溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)60%）、提取時(shí)間40 min、提取溫度40℃、篩目60 目、料液比1∶30 g/mL。準(zhǔn)確稱取篩目為60 目的洋紫荊花瓣粉末樣品1 g，按照料液比為1∶30 g/mL 浸沒(méi)洋紫荊花瓣粉末，浸泡2 h。2 h 后轉(zhuǎn)移至溫度為40℃的水浴鍋中提取40 min，將提取液抽濾，得到花色苷粗提液。用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)可見(jiàn)光區(qū)花色苷的最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.2 洋紫荊花色苷含量的測(cè)定方法 采用pH示差法測(cè)定花色苷含量[15]。取1 mL 的洋紫荊花色苷提取液，分別用0.025 mol/L 鹽酸-氯化鉀緩沖液（pH=1.0）和0.4 mol/L 醋酸鈉緩沖液（pH=4.5）稀釋至50 mL，避光放置20 min 后，在λmax（λ536 nm）和λ700 nm處測(cè)定吸光度值（A）。并按以下公式計(jì)算花色苷的含量。

花色苷含量：X=（ΔAVnM）/（εmL）

式中，ΔA=[Aλmax(pH=1.0)-Aλ700nm(pH=1.0)]-[Aλmax(pH=4.5)-Aλ700nm(pH=4.5)]；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量449 g/mol；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)26 900 L/（mol·cm）；V為稀釋后的總體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)（5 倍）；m為紅花樣體積花瓣粉末質(zhì)量（g）；L為比色皿厚度1 cm。

1.2.3 浸泡時(shí)間對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響準(zhǔn)確稱取5 份篩目為60 目的洋紫荊花瓣粉末各1 g，提取劑的濃度為0.1%鹽酸-乙醇溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%），料液比為1∶30 g/mL，浸泡時(shí)間梯度分別設(shè)置為0 h、1 h、2 h、3 h、4 h，提取溫度40℃，提取時(shí)間40 min。提取液抽濾并用pH 示差法計(jì)算花色苷的含量。按上述方法，重復(fù)3 次。

1.2.4 篩目對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響 分別稱取篩目為100 目、80 目、60 目、40 目、20 目的洋紫荊花瓣粉末各1 g，提取劑的濃度為0.1%鹽酸-乙醇溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%），料液比為1∶30 g/mL，浸泡2 h，提取溫度40℃，提取時(shí)間為40 min。提取液抽濾并用pH 示差法計(jì)算花色苷的含量。按以上所描述的方法，重復(fù)3 次。

1.2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響 準(zhǔn)確稱取5 份篩目為60 目的洋紫荊花瓣粉末各1 g，提取劑的濃度為0.1%鹽酸-乙醇溶液，提取劑中乙醇的濃度配比分別設(shè)置為20%、40%、60%、80%、100%，料液比為1∶30 g/mL，浸泡2 h，提取溫度40℃，提取時(shí)間40 min。提取液抽濾并用pH 示差法計(jì)算花色苷的含量。按上述方法，重復(fù)3 次。

1.2.6 提取溫度對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響準(zhǔn)確稱取5 份篩目為60 目的洋紫荊花瓣粉末各1 g，提取劑的濃度為0.1%鹽酸-乙醇溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%），料液比為1∶30 g/mL，浸泡2 h，提取溫度分別設(shè)置成20℃、40℃、60℃、80℃、100℃，提取時(shí)間40 min。提取液抽濾并用pH 示差法計(jì)算花色苷的含量。按上述方法，重復(fù)3 次。

1.2.7 料液比對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響 準(zhǔn)確稱取5 份篩目為60 目的樣品各1 g，提取劑的濃度為0.1% 鹽酸-乙醇溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%），料液比分別設(shè)置為1∶10 g/mL、1∶20 g/mL、1∶30 g/mL、1∶40 g/mL、1∶50 g/mL，浸泡2 h，提取溫度40℃，提取時(shí)間40 min。提取液抽濾并用pH 示差法計(jì)算花色苷的含量。按上述方法，重復(fù)3 次。

1.2.8 提取時(shí)間對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響準(zhǔn)確稱取5 份篩目為60 目的樣品各1 g，提取劑的濃度為0.1%鹽酸-乙醇溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%），料液比為1∶30 g/mL，浸泡2 h，提取溫度為40℃，提取時(shí)間分別設(shè)置為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min。提取液抽濾并用pH 示差法計(jì)算花色苷的含量。按上述的方法，重復(fù)3 次。

1.2.9 響應(yīng)面法優(yōu)化洋紫荊花瓣花色苷的實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)所得到的單因素的結(jié)果，利用Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取4 因素乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，自變量設(shè)置成3 個(gè)水平值：-1、0、1，以洋紫荊花色苷含量為響應(yīng)值，利用Design-Expert V 8.0.6.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，進(jìn)一步優(yōu)化確定洋紫荊花色苷提取的最佳工藝參數(shù)，驗(yàn)證后的花色苷提取液進(jìn)行體外抗氧化性分析。

1.3 抗氧化能力測(cè)定方法

1.3.1 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定 參照鄰苯三酚法測(cè)定[16]。取6 支試管，加入0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH=8.2）4 mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入不同濃度的色素溶液2 mL，再加入3 mmol/L 鄰苯三酚1 mL，在5 ℃水浴中反應(yīng)5 min，立即加入3 滴10 mol/L HCl 終止反應(yīng)，以Tris-HCl 緩沖液作空白，測(cè)325 nm 處吸光度A0。以VC（維生素C）作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算清除率。

清除率=［A0-（A1-A2）］/A0×100%

式中，A0為不加色素溶液的吸光度，A1為加入色素溶液后的吸光度，A2為不加鄰苯三酚的吸光度。

1.3.2 羥基自由基清除能力測(cè)定 采用水楊酸法進(jìn)行測(cè)定[17]。取6 支試管，分別加入8 mmol/L FeSO41 mL、5 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液2 mL 和不同濃度的色素溶液2 mL，最后加入0.3% H2O21 mL 反應(yīng)0.5 h，測(cè)510 nm 處吸光度。以VC 作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算清除率。

清除率=［A0-（A1-A2）］/A0×100%

式中，A0為不加色素溶液的吸光度，A1為加入色素溶液后吸光度，A2為不加H2O2的吸光度。

2 結(jié)果分析

2.1 洋紫荊花瓣花色苷可見(jiàn)光譜特征 由圖1可知，將洋紫荊花色苷的提取液，在紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)400～650 nm 范圍進(jìn)行波長(zhǎng)的掃描后，在可見(jiàn)光區(qū)536 nm 處峰值最高。唐佳麗[18]以黑樹(shù)莓為原材料提取花色苷，其光譜特征表明，黑樹(shù)莓花色苷在518 nm 處有最大吸收波長(zhǎng)；趙壘[19]以平陰玫瑰為原材料提取花色苷，光譜特征表明，平陰玫瑰花色苷在520 nm 處有最大吸收波長(zhǎng)。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，花色苷及其色素元在可見(jiàn)光465～550 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收峰[20]。由此可判斷洋紫荊色素屬花色苷[21]。

圖1 洋紫荊花瓣花色苷吸收光譜圖

2.2 各單因素對(duì)洋紫荊花瓣花色苷含量的影響

2.2.1 浸泡時(shí)間對(duì)洋紫荊花瓣花色苷含量的影響 由圖2 可知，浸泡時(shí)間在0～3 h 時(shí)，花色苷的含量隨著浸泡時(shí)間的增加呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，浸泡時(shí)間為3 h 時(shí)，花色苷含量達(dá)到最大，此時(shí)花色苷的含量為1.835 mg/g。當(dāng)浸泡時(shí)間超過(guò)3 h 后，花色苷的含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榻輹r(shí)間達(dá)3 h 時(shí)，就已將花色苷完全提取出，繼續(xù)增加浸泡時(shí)間，可能會(huì)將多糖等可溶性物質(zhì)溶解出，從而影響花色苷的含量。通過(guò)單因素方差分析，得出洋紫荊花色苷最佳浸泡時(shí)間為3 h。

圖2 不同浸泡時(shí)間對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2.2 篩目對(duì)洋紫荊花瓣花色苷含量的影響由圖3 可知，當(dāng)篩目為20～60 目時(shí)，花色苷的含量隨著篩目的增加呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，且篩目為60 目時(shí)，花色苷含量達(dá)到最大，此時(shí)花色苷的含量為1.618 mg/g。但超過(guò)60 目后，隨著篩目數(shù)的增加，花色苷含量逐漸下降。這可能是因?yàn)殡S著篩目增加，導(dǎo)致花瓣粉末的顆粒直徑逐漸變小，與提取劑的接觸面積變大，導(dǎo)致在浸提過(guò)程中其他物質(zhì)被溶解出，影響了花色苷含量的測(cè)定。通過(guò)單因素方差分析，得出洋紫荊花色苷最佳篩目為60 目。

圖3 不同篩目對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洋紫荊花瓣花色苷含量的影響 由圖4 可知，在20%～40%之間，洋紫荊花色苷含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而增大，且在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)到達(dá)最大值，此時(shí)花色苷的含量為1.789 mg/g。乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)40%后，花色苷含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而減小，產(chǎn)生這樣的原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)較大從而導(dǎo)致其他物質(zhì)成分，例如，多糖被溶解出，而影響了花色苷含量。通過(guò)單因素方差分析，得出洋紫荊花色苷最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

圖4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2.4 提取溫度對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響由圖5 可知，在20～40℃時(shí)，隨著提取溫度升高，花色苷含量增大，且在40℃時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)花色苷的含量為1.672 mg/g。但超過(guò)40℃后，花色苷含量就隨著溫度的增大而逐漸降低，導(dǎo)致此現(xiàn)象的原因可能是由于溫度逐漸升高，導(dǎo)致花色苷不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)降解，進(jìn)而影響花色苷含量。通過(guò)單因素方差分析，得出洋紫荊花色苷最佳提取溫度為40℃。

圖5 不同提取溫度對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2.5 料液比對(duì)洋紫荊花瓣花色苷含量的影響由圖6 可知，在料液比為（1∶10）～（1∶30）g/mL 時(shí)，花色苷含量隨料液比減小而增大，且在料液比為1∶30 g/mL 時(shí)，花色苷含量達(dá)到最大，此時(shí)花色苷的含量為1.624 mg/g。但低于1∶30 g/mL 后，花色苷的含量隨料液比的減小而降低，這可能是因?yàn)殡S著料液比逐漸降低，提取液濃度逐漸下降，進(jìn)而影響了花色苷的含量。通過(guò)單因素方差分析，得出洋紫荊花色苷最佳料液比為1∶30 g/mL。

圖6 不同料液比對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2.6 提取時(shí)間對(duì)洋紫荊花瓣花色苷含量的影響 由圖7 可知，在20～60 min，花色苷含量隨提取時(shí)間的增加而增大，且在提取時(shí)間為60 min時(shí)，花色苷含量達(dá)到最大，此時(shí)花色苷的含量為1.618 mg/g。但超過(guò)60 min 后，花色苷的含量隨提取時(shí)間的增加而降低，這可能是因?yàn)闀r(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致其他物質(zhì)溶解出，影響了花色苷的含量。通過(guò)單因素方差分析，得出洋紫荊花色苷最佳提取時(shí)間為60 min。

圖7 不同提取時(shí)間對(duì)洋紫荊花色苷含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化洋紫荊花色苷提取結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取 根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析表明，由于篩目和浸泡時(shí)間對(duì)洋紫荊花色苷含量影響較小，故在使用響應(yīng)面優(yōu)化工藝時(shí)，選取4 個(gè)因素，分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度作為工藝優(yōu)化的因素，以含量為響應(yīng)值，利用Design－Expert V 8.0.6.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

2.3.2 響應(yīng)模型的建立與分析 利用Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析，確定最佳的提取工藝條件。利用Design－Expert V8.0.6.1 軟件進(jìn)行回歸擬合。以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度為自變量，以花色苷含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)4 因素3 水平共29 組響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)值實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3 可知，B、D、A2、C2、D2對(duì)響應(yīng)面的影響達(dá)到極顯著水平，C、B2達(dá)到顯著水平。4 因素兩兩交互項(xiàng)AC、BC、BD 的P＜0.05，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間、料液比和提取時(shí)間、料液比和提取溫度的交互作用影響顯著。從整體分析，模型的P＜0.0001，表明該二次多項(xiàng)回歸模型達(dá)到極顯著水平。R2=0.9532，R2 Adj=0.9065，C.V=3.03%，說(shuō)明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好。回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明，在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)洋紫荊花瓣花色苷含量影響排序?yàn)椋毫弦罕龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.3.3 各因素交互作用對(duì)花色苷含量的影響 等高線圖可直觀地反映2 個(gè)變量交互作用的影響程度，圓形表示2 因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。由圖8 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比之間交互作用較弱，料液比對(duì)花色苷含量的影響略大于乙醇體積分?jǐn)?shù)。乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間之間交互作用顯著，提取時(shí)間對(duì)花色苷含量變化的影響較大，表現(xiàn)為響應(yīng)面圖曲線較陡和等高線較密集。乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度之間交互作用較弱，提取溫度對(duì)花色苷含量的影響略大于乙醇體積分?jǐn)?shù)。料液比與提取時(shí)間之間具有顯著的交互作用，料液比對(duì)花色苷含量變化的影響較大。料液比與提取溫度之間具有顯著的交互作用，料液比對(duì)花色苷含量變化的影響較大。提取時(shí)間與提取溫度之間交互作用較弱，提取溫度對(duì)花色苷含量的影響略大于提取時(shí)間。以上結(jié)果均與表3 回歸分析結(jié)果吻合。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

圖8 各因素交互作用對(duì)花色苷含量影響的響應(yīng)面圖

2.4 洋紫荊花色苷提取工藝優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果 利用Design－Expert V 8.0.6.1 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)優(yōu)化預(yù)測(cè)，進(jìn)一步確定提取條件工藝最佳條件，得到花色苷的提取最佳工藝條件為篩目60 目、浸泡時(shí)間3 h、提取溫度20℃、料液比1∶50 g/mL、提取時(shí)間60 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，預(yù)測(cè)得到洋紫荊花色苷提取量為2.547 mg/g，實(shí)際測(cè)得的花色苷含量為2.587 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值符合度較高。因此，采用上述最適宜工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際洋紫荊花色苷的提取工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.5 洋紫荊花色苷抗氧化活性分析

2.5.1 花色苷對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用通過(guò)鄰苯三酚法對(duì)洋紫荊花色苷清除超氧陰離子自由基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖可知，洋紫荊花色苷和VC 對(duì)超陰離子的清除率均隨濃度的增加而增大，濃度低于1.5 mg/mL 時(shí)，VC 的清除效果優(yōu)于洋紫荊羊蹄甲花色苷，當(dāng)濃度超過(guò)1.5 mg/mL 時(shí)，花色苷的清除效果基本與VC 相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洋紫荊花色苷對(duì)超氧陰離子自由基的清除有較好的效果?；ㄉ战Y(jié)構(gòu)中具有多個(gè)酚羥基，屬于羥基供體，與游離的自由基結(jié)合形成穩(wěn)定的自由基，阻礙了自由基發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[22]。

圖9 VC 和花色苷對(duì)超氧陰離子自由基的清除率曲線

2.5.2 花色苷對(duì)羥自由基的清除作用 羥自由基清除法對(duì)洋紫荊花色苷的清除效果見(jiàn)圖10。分析圖10 可知，花色苷對(duì)羥基自由基的清除作用，隨濃度的增加其清除能力增強(qiáng)，當(dāng)濃度低于1.0 mg/mL 時(shí)，花色苷的清除效果基本與VC 相近，當(dāng)濃度高于1.0 mg/mL 時(shí)，VC 的清除效果優(yōu)于花色苷。雖然花色苷對(duì)羥基自由基的清除效果略低于VC，但對(duì)羥基自由基仍有一定的清除作用。

圖10 VC 和花色苷對(duì)羥自由基的清除率曲線

3 討論與結(jié)論

花色苷是花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物，屬酚類化合物中的類黃酮，是構(gòu)成花瓣、果實(shí)等顏色的主要水溶性色素；花色苷作為一種天然食用色素，安全、無(wú)毒、資源豐富，且具有一定的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用，在食品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著巨大應(yīng)用潛力[3,23]。影響花色苷穩(wěn)定性的因素有很多，pH 值、氧氣、溫度、花色苷濃度和結(jié)構(gòu)、光、金屬離子、酶，以及其他輔助因素等均能使花色苷的顏色產(chǎn)生變化[24]，目前還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的提取方法。傳統(tǒng)的花色苷提取工藝研究用單因素結(jié)合正交法，但隨著科技的發(fā)展，目前主要采用單因素結(jié)合響應(yīng)面進(jìn)行論證提取工藝。洋紫荊是羊蹄甲屬植物，對(duì)洋紫荊色素的研究鮮有報(bào)道，但同為羊蹄甲屬的紅花羊蹄甲色素的研究已有報(bào)道[25-27]。前人在對(duì)紅花羊蹄甲花色苷提取工藝的研究中，主要以最大吸收波長(zhǎng)下的吸光值為指標(biāo)，用正交法探討花色苷的提取工藝。通過(guò)與已有研究結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)以含量為指標(biāo)，在進(jìn)行提取工藝的研究中，對(duì)單因素條件的考慮較為周全，并且采用了響應(yīng)面的方法分別進(jìn)行可交互作用的分析，同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化工藝的實(shí)際驗(yàn)證，與理論預(yù)測(cè)值相差不大。在抗氧化活性方面，李容等[28]從超氧陰離子自由基清除能力、羥自由基清除能力2 個(gè)方面評(píng)價(jià)羊蹄甲花色素的抗氧化活性，并與抗氧化劑VC 進(jìn)行比較。色素對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用基本與VC 相當(dāng)，對(duì)羥基自由基的清除作用略低于VC，以上都說(shuō)明其抗氧化能力隨著花色苷提取液濃度的增加而提高，這與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，洋紫荊具有較好的營(yíng)養(yǎng)功效，合理開(kāi)發(fā)利用洋紫荊花色苷的功能活性，可提高其綜合利用價(jià)值。

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化洋紫荊花色苷的工藝，最佳工藝條件為篩目60 目、浸泡時(shí)間3 h、提取溫度20℃、料液比1∶50 g/mL、提取時(shí)間60 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，實(shí)驗(yàn)測(cè)得的洋紫荊花色苷含量為2.561 mg/g。洋紫荊花色苷提取液在一定的濃度內(nèi)，對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的具有一定的清除能力，具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，為進(jìn)一步研究洋紫荊花色苷及其副產(chǎn)品加工提供數(shù)據(jù)參考。