外源茉莉酸甲酯對(duì)鹽脅迫下玉米幼苗AsA-GSH循環(huán)的影響*

陳 芳 楊雙龍 張 莉 佟祎鑫 張志華 虞凡楓 賈凌云**

（1 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室 甘肅蘭州 730070 2 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室 云南昆明 650501）

土壤鹽漬化對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有極大滯礙作用，我國(guó)鹽漬化土地的總面積約占全國(guó)可利用土地面積的4.88%（約1 億hm2），且每年約有0.83%的農(nóng)耕土地發(fā)生次鹽漬化[1-2]。尤其是我國(guó)西部干旱荒漠地區(qū)，土地鹽漬化尤為嚴(yán)重，對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成了較為嚴(yán)重的損害。

玉米（Zea maysL.）作為一種喜溫農(nóng)作物，具有品質(zhì)好、產(chǎn)量高、適應(yīng)能力較強(qiáng)等特點(diǎn)[3]，玉米的大量種植也是解決我國(guó)糧食問(wèn)題的有效手段之一。近年來(lái)，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展和種植方式的不斷改進(jìn)，玉米的栽培面積逐年地增加，玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)也有較大的提高，使我國(guó)玉米總的種植面積僅次于水稻（Oryza sativaL.）和小麥（Triticum aestivumL.），約為2 000 萬(wàn)hm2[4-5]。有研究表明，土壤鹽漬化會(huì)導(dǎo)致玉米的產(chǎn)量嚴(yán)重受損[1-2]，緩解鹽脅迫對(duì)植物造成傷害的相關(guān)研究迫在眉睫。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonat，MeJA）是一種普遍存在于植物體內(nèi)的重要激素和信號(hào)分子，參與植物抗逆反應(yīng)的眾多調(diào)控過(guò)程[6-8]。已有研究表明，施加MeJA 能降低鹽脅迫對(duì)植株造成的損傷，從而使其抵抗逆境的能力升高[6,9-10]。龐延軍等[11]通過(guò)研究表明，一定質(zhì)量濃度的外源MeJA 可使鹽脅迫下水稻種子萌發(fā)率明顯的提高。而Yoon等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)鹽脅迫下的大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］外源施加MeJA，增加了其脯氨酸的含量，降低植株的光合速率，表明外源施加MeJA能減小鹽脅迫對(duì)大豆造成的傷害。

已有研究證實(shí)，植物受到逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)的抗氧化劑含量及抗氧化物酶的活性會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，以強(qiáng)化其抗氧化代謝循環(huán)的水平，優(yōu)化植物活性氧的解毒體系，最終提高植物抵抗逆境的能力［13］?，F(xiàn)有研究主要關(guān)注MeJA 對(duì)鹽脅迫下水稻、大豆等植物抗氧化能力的影響，而對(duì)于玉米抗鹽脅迫的相關(guān)研究較少。研究顯示，外源MeJA 對(duì)于滲透脅迫下的玉米幼苗具有一定的調(diào)節(jié)作用[14]，但外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米幼苗的抗氧化能力影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)短期鹽脅迫下的玉米幼苗根系外源施加75 μmol/L MeJA，探究其對(duì)150 mmol/L NaCl 脅迫下玉米幼苗抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究實(shí)驗(yàn)材料為“農(nóng)星-207”玉米種子，選購(gòu)于山東淄博公司。

1.2 材料及培養(yǎng) 選取“農(nóng)星-207”玉米種子（籽粒飽滿），用自來(lái)水清洗3～5 次，洗去包衣。用1.5%的CuSO4溶液（稱取1.5 g CuSO4溶于100 mL蒸餾水）浸泡消毒10 min 后，再用蒸餾水沖洗2～3 次，浸泡24 h。將浸泡好的種子均勻播種至鋪有6 層濾紙的白瓷盤上，用蒸餾水潤(rùn)濕后蓋上蓋子，期間連續(xù)補(bǔ)給適量蒸餾水，注意不能超過(guò)種子的2/3。置于溫度為28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)60 h，待種子萌發(fā)出芽并長(zhǎng)至3～4 cm（胚芽鞘）高時(shí)，進(jìn)行相應(yīng)的處理。

玉米種子的處理參照楊雙龍等[15]的方法。萌發(fā)60 h 后，將實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行3 種處理：1）蒸餾水培養(yǎng)的對(duì)照組（CK）；2）150 mmol/L NaCl 鹽脅迫實(shí)驗(yàn)組（N）；3）鹽脅迫外施75 μmol/L MeJA 實(shí)驗(yàn)組（N+M）。處理前取樣一次，以后各組每隔24 h 取一次樣，共取5 次，每次實(shí)驗(yàn)取3 組樣，每組實(shí)驗(yàn)取3 個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)各稱取玉米胚芽鞘0.1 g，裝在2 mL 離心管中，經(jīng)液氮速凍后，在-80℃冰箱保存。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 氧化物質(zhì)含量的測(cè)定 還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、按還原型抗壞血酸（AsA）含量的測(cè)定按照購(gòu)買的試劑盒（蘇州科銘）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 抗氧化酶活性測(cè)定 抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測(cè)定按照購(gòu)買的試劑盒（蘇州科銘）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1）APX 活性單位的定義：每分鐘每克樣本（鮮重）在25℃的條件下催化1 μmol AsA，即為1 個(gè)酶活力單位（1 U）。

2）DHAR 活性單位的定義：每分鐘每克樣本（鮮重）在25℃的條件下形成1 nmol AsA，即為1 個(gè)酶活力單位（1 U）。

3）MDHAR 活性單位的定義：每分鐘每克樣本（鮮重）在25℃的條件下催化1 nmol NADH，即為1 個(gè)酶活力單位（1 U）。

4）GR 活性單位的定義：每分鐘每克樣本（鮮重）在25℃、pH 值為8.0 的條件下氧化1 nmol NADPH，即為1 個(gè)酶活力單位（1 U）。

1.4 數(shù)據(jù)分析 將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理后，用SPSS 19.0 軟件和Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較分析數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism8.4.3 進(jìn)行圖表繪制，圖中以不同小寫(xiě)字母表明在P＜0.05 水平上有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘AsA 含量的影響 由圖1 可知，鹽脅迫處理的實(shí)驗(yàn)組提高了AsA 的含量，24 h 時(shí)較對(duì)照升高了51.4%（P＜0.01），96 h 時(shí)升高了42.2%（P＜0.01），說(shuō)明鹽脅迫促使AsA 含量提高。鹽脅迫下施加外源MeJA 處理進(jìn)一步提高了AsA 含量，在處理24 h時(shí)相比對(duì)照增加56.9%（P＜0.01），96 h 時(shí)增加了55.6%（P＜0.01）。鹽脅迫下MeJA 處理與單獨(dú)的NaCl 脅迫處理相比，在24 h 時(shí)分別增加3.7%，96 h 時(shí)增加7.7%，表明鹽脅迫組在施加外源MeJA后，玉米胚芽鞘中AsA 含量顯著升高。

圖1 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘還原型抗壞血酸（AsA）含量的影響

2.2 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘中AsA 代謝酶（APX、DHAR、MDHAR）活性的影響 由圖2可知，與對(duì)照組相比，單獨(dú)的鹽脅迫處理下APX活性隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在96 h 時(shí)其活性提高了71.0%（P＜0.01）。鹽脅迫下施加外源MeJA 處理，APX 活性也呈升高趨勢(shì)，在處理96 h時(shí)其活性與對(duì)照組相比提高了91.0%（P＜0.01），表明施加MeJA 促進(jìn)了鹽脅迫下玉米胚芽鞘中APX活性的提高。

圖2 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性的影響

由圖3 可知，在96 h 時(shí)單獨(dú)的鹽脅迫處理下，DHAR 活性提高，相比對(duì)照組提高了179.8%（P＜0.01）。鹽脅迫下施加MeJA 處理進(jìn)一步提高了DHAR 活性，在處理96 h 時(shí)相比對(duì)照組提高了233.5%（P＜0.01），相比單獨(dú)的鹽脅迫處理提高19.2%，表明75 μmol/L MeJA 處理促進(jìn)了玉米胚芽鞘中DHAR 活性的提高。

圖3 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性的影響

由圖4 可知，單獨(dú)的鹽脅迫處理下MDHAR 活性顯著提高，在96 h 時(shí)相比對(duì)照組提高了34.6%（P＜0.01）。鹽脅迫下施加外源MeJA 處理進(jìn)一步提高了MDHAR 的活性，在處理96 h 時(shí)相比對(duì)照組提高了54.2%（P＜0.01），相比單獨(dú)的鹽脅迫處理提高了14.6%，表明75 μmol/L MeJA 處理促進(jìn)了玉米胚芽鞘中MDHAR 活性的提高。

圖4 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性的影響

2.3 MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘GSH 含量影響

由圖5 可知，單獨(dú)的鹽脅迫處理相比對(duì)照組提高了GSH 的含量，在96 h 時(shí)升高了36.7%（P＜0.01），說(shuō)明鹽脅迫促進(jìn)了GSH 含量的提高。鹽脅迫下施加外源MeJA 后進(jìn)一步提升了GSH 含量，在96 h 時(shí)相比對(duì)照組增加了86.1%（P＜0.01），表明外源施加MeJA處理促進(jìn)了玉米胚芽鞘中GSH含量的提高。

圖5 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘還原型谷胱甘肽（GSH）含量的影響

2.4 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘GSH/GSSG 比值的影響 圖6 顯示，外源施加MeJA 能提高鹽脅迫下玉米胚芽鞘GSH/GSSG 比值，在處理96 h 時(shí)，NaCl+MeJA 處理比單獨(dú)NaCl 處理GSH/GSSG 比值提高了69.7%（P＜0.01）；同時(shí)，NaCl 處理和NaCl+MeJA 處理GSH/GSSG 比值分別比對(duì)照組提高了195.6%（P＜0.01）和401.6%（P＜0.01），表明外源施加75 μmol/L MeJA 處理下，玉米胚芽鞘細(xì)胞氧化還原力（GSH/GSSG）增強(qiáng)。

圖6 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘還原型谷胱甘肽含量與氧化型谷胱甘肽含量（GSH/GSSG）比值的影響

2.5 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘中GSH 代謝酶（GR）活性的影響 由圖7 可知，單獨(dú)的NaCl脅迫處理的實(shí)驗(yàn)組，在處理96 h 時(shí)與對(duì)照相比，玉米胚芽鞘中GR 活性上升了31.7%（P＜0.01）。與單獨(dú)的NaCl 處理相比，在處理96 h 時(shí)，NaCl+MeJA處理下玉米胚芽鞘中GR 活性升高了13.6%（P＜0.05），表明外源施加MeJA 能提高NaCl 脅迫下玉米胚芽鞘中GR 的活性。

圖7 外源MeJA 對(duì)鹽脅迫下玉米胚芽鞘谷胱甘肽還原酶（GR）活性的影響

3 討論

鹽脅迫會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成較嚴(yán)重的氧化脅迫傷害[16-17]，而在維持植物細(xì)胞的氧化還原平衡中，AsA-GSH 循環(huán)具有十分重要的作用[16]。APX 催化AsA 將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O 和MDHA，MDHA 在MDHAR 的催化作用下轉(zhuǎn)化成AsA 或進(jìn)一步生成DHA，而DHA 在DHAR 的催化作用下以GSH 為底物生成AsA，與此同時(shí)GSH 氧化成GSSG，GSSG 又可在GR 的作用下還原為GSH[18-19]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，在人工模擬的150 mmol/L NaCl 鹽脅迫下，外源施加75 μmol/L MeJA 提高了150 mmol/L NaCl 鹽脅迫下玉米幼苗AsA-GSH 循環(huán)中抗氧化劑AsA、GSH 含量，GSH/GSSG 的比值及抗氧化酶APX、DHAR、MDHAR、GR 活性，從而促進(jìn)玉米幼苗抗氧化能力的提高。

有研究顯示，MeJA 可參與逆境脅迫下AsAGSH 循環(huán)的調(diào)節(jié)過(guò)程[20-22]，但對(duì)于在鹽脅迫下，MeJA 調(diào)控玉米幼苗中AsA-GSH 循環(huán)的機(jī)制目前尚不清楚。實(shí)驗(yàn)探究玉米幼苗中AsA、GSH 含量變化，GSH/GSSG 比值的變化及AsA-GSH 循環(huán)中關(guān)鍵酶活性的變化，旨在闡明MeJA 調(diào)控對(duì)鹽脅迫下玉米幼苗中AsA-GSH 循環(huán)的機(jī)制的影響。

AsA 在植物細(xì)胞的抗氧化脅迫能力方面具有十分關(guān)鍵的作用，而APX、DHAR、MDHAR 及GR是AsA-GSH 循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶[23-25]。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，施加MeJA 促進(jìn)了鹽脅迫下玉米胚芽鞘中的AsA 含量，并提高了AsA 循環(huán)中關(guān)鍵酶APX、DHAR、MDHAR 活性，表明鹽脅迫下對(duì)玉米幼苗外源施加MeJA 能提高AsA 含量，促使AsA 清除鹽脅迫下玉米幼苗中產(chǎn)生的過(guò)量H2O2，從而緩解鹽脅迫造成的損害。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MeJA 提高了玉米胚芽鞘中MDHAR 和DHAR 的活性，加速了玉米幼苗中MDHA 和DHA 的轉(zhuǎn)化，最終促使AsA 含量的增加，加速了AsA-GSH 循環(huán)。APX 活性的升高表明MeJA 加速了AsA 的轉(zhuǎn)化，但相較于MDHAR 和DHAR 活性的增幅，APX 活性升高較小，說(shuō)明可能存在另一種轉(zhuǎn)化機(jī)制促使AsA 的轉(zhuǎn)化或因玉米胚芽鞘中積累過(guò)多活性氧，導(dǎo)致APX 活性升高的比較緩慢。

GSH 含量是AsA-GSH 循環(huán)效率高低的重要指標(biāo)之一[25-26]，更為重要的是，植物細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧（ROS）能在一定程度上被GSH 清除，從而減少由于膜脂過(guò)氧化作用對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重傷害[27-28]。GSH/GSSG 比值是細(xì)胞內(nèi)重要的氧化還原參數(shù)，表示細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)[11]。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)150 mmol/L NaCl 脅迫使GSH含量升高，GSH/GSSG 的比值增大，而施加外源MeJA 進(jìn)一步促使了玉米幼苗在鹽脅迫下GSH 含量升高及GSH/GSSG 比值的升高。與單獨(dú)鹽脅迫處理的玉米胚芽鞘相比，外源施加75 μmol/L MeJA 進(jìn)一步提高了玉米胚芽鞘中AsA-GSH 循環(huán)中GR 的活性。GSH 含量升高，GSSG 含量下降，GR 活性升高，表明GSH 含量的增加主要是GSH生成量的增加；GR 活性升高，表明GSH 循環(huán)的加速，從另一方面也表明AsA 含量的增加一部分來(lái)自于GSH 循環(huán)。

綜上所述，在150 mmol/L NaCl 鹽脅迫條件下，外源施加MeJA 提高了玉米幼苗AsA-GSH 循環(huán)中抗氧化劑AsA、GSH 含量及抗氧化酶APX、DHAR、MDHAR、GR 活性，加速了對(duì)活性氧的清除，從而促進(jìn)玉米幼苗抗氧化能力的提高。這些結(jié)果為深入研究鹽脅迫下MeJA 調(diào)控植物抗氧化代謝提供了新的思路，也有助于探明鹽脅迫下植物維持細(xì)胞氧化還原平衡的機(jī)理。因條件限制，本實(shí)驗(yàn)未從玉米胚芽鞘的質(zhì)膜通透性、抗氧化酶活性等其他耐鹽生理生化指標(biāo)方面做進(jìn)一步探究，期待其他有興趣的研究者能進(jìn)行深入研究。