用ITS2鑒定芥辣類調(diào)味品中山葵、辣根和芥末組分

陳雪貞， 李兆雯， 吳 新， 蘆春斌*

（1.暨南大學 生命科學技術學院，廣東 廣州510632；2.珠海天禾食品有限公司，廣東 珠海519090）

芥辣類調(diào)味品是日式飲食常見的調(diào)味品，在食品領域有重要的市場地位。十字花科的一些植物含豐富的異硫氰酸酯，使其有特殊的辛辣刺鼻的風味。常見的植物原料有山葵、辣根和芥末。山葵屬于十字花科山萮菜屬，與同屬十字花科的馬蘿卜屬的辣根和蕓苔屬的芥末，在味道和口感上非常相似，但由于山葵種植的環(huán)境和條件苛刻，使其價格也非常昂貴。而辣根味道與山葵非常相近，市面上多通過添加綠色色素到辣根中來代替山葵。芥菜的籽研磨成粉狀后（俗稱“芥末”），加入水后能散發(fā)出更重的刺激味道，也常用于替代山葵。但是山葵與辣根和芥末還是有一定的區(qū)別的，山葵中的5-甲硫基戊基異硫氰酸脂、6-甲硫基己基異硫氰酸脂、7-甲硫基庚基異硫氰酸脂使其具有獨特的香氣，而這3種成分在辣根和芥末中是沒有的。而且，芥末含有一種由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈組成的蛋白質(zhì)，可引起過敏性皮膚病、呼吸道疾病哮喘等[1]，是一種常見的過敏原，芥末與花生及其制品、大豆及其制品等食品出現(xiàn)在歐盟14種食品過敏源名單中。所以，快速、準確地鑒定出加工產(chǎn)品中的山葵、辣根、芥末成分對食品生產(chǎn)、質(zhì)控和食品安全有重要的意義。國內(nèi)外已有許多研究通過篩選特異引物檢測食品中的芥末過敏原。Palle-reisch等利用逆轉(zhuǎn)錄元件13G42-26引物檢測釀造香腸中的黑芥末和棕芥末，并通過雙重實時PCR技術進行定量檢測[2-3]。在國內(nèi)，邵娟等利用芥末Sin A1管家基因設計特異性引物靈敏地檢測食品中芥末成分[4]。

由于食品在加熱、高壓、研磨等加工過程中，食品的成分會變得復雜且多變，傳統(tǒng)的檢測方法對食品進行精確檢測的難度大大增加。谷秀蘭[5]證明用傳統(tǒng)的異硫氰酸烯丙酯檢測方法檢測芥末成分，其工序復雜，檢測數(shù)據(jù)重復性不好、不穩(wěn)定，并且該方法也不能將山葵、芥末、辣根這3種品種區(qū)分開來，也不能滿足市場上對其原材料溯源的要求。

植物中不同品種的分子標記，無論在新鮮食品還是加工食品中，都能較為穩(wěn)定、精確、高效地追溯食品原料來源和驗證食品的真實性。在已有的報道中，許多研究利用黑芥子酶基因作為十字花科的特征基因來設計特異引物，從而檢測出芥辣類產(chǎn)品的成分。黃科等[6]用黑芥子酶基因證實了十字花科各屬之間的進化關系，為往后研究提供參考。Hara等[7-8]設計了辣根的特異引物，擴增出辣根中黑芥子酶基因ArMY1（登錄號AY822710），并且利用山葵的特異性引物通過巢式PCR擴增山葵黑芥子酶基因WjMY1（登錄號AB194903）。然而，黑芥子酶基因同源性很高，設計特異引物難度大，難以設計黑芥子酶基因的種屬特異性引物對其進行鑒定，且特異基因表達量低、檢測靈敏度不夠高、PCR檢測中可能存在交叉反應等問題使檢測難度加大。而本研究中利用一段標準的、相對更短的DNA序列通用基因核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Ⅱ（ITS2）作為標記，對樣品中該標準序列進行PCR擴增和測序，從而將山葵與其近緣物種辣根、芥末等成分快速、準確、自動化地鑒定出來，這已是食品與藥物檢測和鑒定常用的方法。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列是核糖體RNA基因中存在于結(jié)構RNA的非功能性RNA序列，位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的5.8S rRNA基因的兩側(cè)，分別稱為ITS1和ITS2。被子植物的ITS長度比較穩(wěn)定，在600～700 bp，其中ITS1的長度為187～298 bp，ITS2的長度為187～252 bp[9]，ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域。由于核糖體rDNA是高度重復的串聯(lián)序列，這些高度重復單位受到的選擇壓力非常小，同步進化作用下，ITS在大部分真核生物中表現(xiàn)出較廣泛的序列多態(tài)性，種間差異比較明顯，所以可以利用ITS表現(xiàn)出的差異性對近親物種進行鑒定[10-11]。Chen等[12]提出ITS2序列可以作為標準DNA條形碼鑒別藥用植物及其近緣物種。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列的鑒定系統(tǒng)已在一些植物及中藥藥材的鑒定中廣泛應用，但在食品檢測應用中尤其是芥辣類調(diào)味品中ITS檢測尚無應用。

作者利用ITS2標記DNA技術對山葵及辣根、芥末進行種屬特異性鑒定，為食品生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量控制中特異性檢測山葵、辣根、芥末提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品山葵 （Eutrema wasabi）、辣根（Armoracia rusticana）、白芥末（Sinapis alba）：珠海天禾食品有限公司提供（均是凍干研磨而成的干粉）。實驗樣品信息見表1。

表1 實驗樣品信息Table 1 Sample information

1.1.2 試劑PCR擴增引物由生工生物工程有限公 司 合 成；ITS2引 物 序 列（ITS2_S2F：ATGCGATA CTTGGTGTGAAT；ITS2_S3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT）、2×Taq PCR MasterMix：生工生物工程有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氯仿、乙醇、異丙醇、β-巰基乙醇：北京鼎國生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測稱取樣品干粉100 mg，根據(jù)CTAB法中提取植物DNA方法提取基因組DNA，DNA用TE緩沖液溶解。

1.2.2 PCR擴增及測序反應體積10μL：2×Taq PCRMasterMix 5μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），總DNA 1μL（100 ng/μL），ddH2O 2μL。引物ITS2擴增程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 GenBank中獲取山葵、辣根和芥末序列信息從數(shù)據(jù)庫中搜索山葵、辣根和芥末3種植物ITS2序列的信息（見表2）。用MEGA7.0進行序列對比，計算遺傳距離，構建鄰接樹（Neighbor-joining tree，NJ tree），設置Bootstrap（1 000次重復）檢驗各分支支持率。

表2 數(shù)據(jù)庫中獲取的山葵、辣根和芥末3種植物ITS2序列信息Table 2 Information of ITS2 sequence of three plants of Eutrema wasabi， Armoracia rusticana and mustard in the database

1.3 數(shù)據(jù)分析

3種樣品的PCR產(chǎn)物測序后獲得測序峰圖文件，使用MEGA7.0計算種間遺傳距離，用最大似然法（Maxinmum likelihood，ML）構建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與PCR擴增檢測

用CTAB法提取山葵、辣根、白芥末3種樣品的基因組DNA，經(jīng)Nanodrop紫外分光光度計檢測其濃度和純度。用通用引物ITS2_S2分別對3種樣品提取的DNA進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測，3種DNA樣品均擴增出198 bp特異性DNA條帶。PCR產(chǎn)物在廣州生工生物工程有限公司進行測序。

2.2 山葵與辣根、白芥末種間序列信息及變異位點分析

經(jīng)MEGA7.0分析比對后，山葵、辣根及白芥末的ITS2序列比對后種間序列長度、變異位點和遺傳距離等信息統(tǒng)計結(jié)果見表3。其中，白芥末與辣根之間的K2P遺傳距離最大，為0.171；山葵與白芥末之間的K2P遺傳距離最小，為0.088；辣根與山葵的K2P遺傳距離為0.150。所有樣品比對后K2P遺傳距離都較遠，且大于0.01，初步推斷利用ITS2序列能將山葵、辣根和白芥末區(qū)分開來。山葵與辣根、白芥末ITS2序列比對后序列長度有198 bp，平均GC堿基的含量有6.99%。3種樣品ITS2序列比對后變異位點有36個，其中山葵與白芥末比對后變異位點有18個，山葵與辣根之間變異位點有26個，白芥末與辣根比對后變異位點有29個，具體變異位點見表4。

表3 山葵、辣根及白芥末ITS2序列比對信息Table 3 ITS2 sequence information of Eutrema wasabi，Armoracia rusticana and white mustard

表4 山葵、辣根及白芥末比對后變異位點Table 4 Variation sites of Eutrema wasabi、Armoracia rusticana and white mustard

2.3 最大似然法（ML）構建進化樹鑒別山葵、辣根及白芥末

通過MEGA7.0利用最大似然法（ML）分析山葵、辣根、白芥末3種樣品，分析得山葵與白芥末和辣根之間K2P遺傳距離分別為0.090和0.160，白芥末與辣根之間的K2P遺傳距離為0.170。利用最大似然法（ML）構建的進化樹（見圖1），辣根與白芥末之間的遺傳距離最遠，而白芥末與山葵之間的遺傳距離最近。

2.4 用ITS2序列構建山葵及其近緣物種的鄰接樹（NJ tree）

從數(shù)據(jù)庫GenBank中獲取山葵、西北山崳菜、白芥末、棕芥末、黑芥末、辣根的ITS2序列。利用MEGA7.0構建鄰接樹（NJtree）（見圖2），山葵、西北山崳菜以99%的支持率聚為一大支，所以，山葵與其他物種用ITS2序列可明顯區(qū)別開。而棕芥末與白芥末、黑芥末以72%的支持率聚為一大支，白芥末和棕芥末以75%的支持率聚為一支，支持率均大于70%。因此用ITS2序列可以將3種芥末與其他物種區(qū)分，且可以將黑芥末與白芥末、棕芥末區(qū)分開。分析6條ITS2序列的K2P遺傳距離（見表5），6條序列之間K2P遺傳距離在0.030～0.105，均大于0.01。其中山葵與西北山崳菜之間的遺傳距離最近，為0.030；棕芥末與辣根之間的遺傳距離最遠，為0.105；3種芥末之間的K2P遺傳距離相近，在0.045～0.049；而山崳菜屬的山葵和西北山崳菜與蕓苔屬的3種芥末相比，K2P遺傳距離在0.064～0.077；山崳菜屬的山葵和西北山崳菜與辣根相比，K2P遺傳距離在0.093～0.097；蕓苔屬的3種芥末與辣根相比，K2P遺傳距離在0.080～0.105。所以山崳菜屬與蕓苔屬K2P遺傳距離最近，蕓苔屬與辣根之間K2P遺傳距離最遠。

表5 山葵及其近緣物種ITS2序列K2P遺傳距離分析Table 5 Genetic distance analysis of ITS2 sequence of Eutrema wasabi and its related species

2.5 討論

食品成分檢測因食品基質(zhì)的極其復雜及不同程度的加工處理會使檢測難度增加。利用動植物特定成分的基因特異性進行分子檢測，尤其是進行有效成分和過敏源基因檢測，在食品安全評估和測試中的應用尤為廣泛。DNA標記識別基因組核苷酸序列的變異，可以突出物種間和物種內(nèi)部的多樣性。例如，線粒體DNA標記CO1被證明對食品中動物物種的鑒定是有效的，該標記基因可用于鑒別牛品種和市面上標記錯誤的漁業(yè)產(chǎn)品[13-14]。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）是相近的種群中有著高度可變性的非功能片段，在區(qū)別或鑒定同屬物種關系中具有重要作用，這種技術不僅對真菌的鑒別成功率很高，還能通過分析ITS區(qū)域DNA序列鑒別引起食物中毒的蘑菇和鑒定不同產(chǎn)地的海藻干燥產(chǎn)品等植物材料[15-16]。而Amaia等還基于ITS擴增利用SYBR Green I和TaqMan兩種實時定量PCR檢測方法檢測炭疽曲霉的含量[17]。

如今市面上許多芥辣類調(diào)味品用山葵為原材料，同時也有用近親物種辣根和芥末摻入或代替，雖然辣根和芥末的風味與山葵相似，但山葵的價格與辣根、芥末相比還是不同的，而且芥末的鑒別對芥末過敏的人群來說也是非常重要的。已有許多研究利用特異引物檢測食品中山葵和辣根、芥末成分，但因引物設計難度高和靈敏度低等原因使檢測難度加大。DNA條形碼是一種利用基因組中標準和特定位置的短DNA序列來表征生物物種的技術手段。有研究人員就提出了兩個葉綠體DNA（cpDNA），分別是rbcl和matk，作為植物DNA條形碼[18]。Alaklabi等利用葉綠體基因matk和質(zhì)體基因rbcl對瀕危的植物蘆薈特有假單胞菌進行分子鑒定[19]。Fang等通過對溺水動物的肺部浮游生物菌落的rbcl基因進行焦磷酸測序來輔助法醫(yī)對溺水現(xiàn)場進行推斷[20]。但是，由于cpDNA在密切相關的分類群之間存在基因流動以及不能對系統(tǒng)發(fā)育精準分辨等潛在的問題，使這些序列進化速率低，限制了cpDNA在屬或物種水平的分配能力，而18S～25S核糖體DNA（ITS）作為新的替代方法發(fā)展起來。Hao等[21]同時利用核ITS和cpDNA數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)發(fā)育分析，證明中國四川省橫斷山脈的一種新種——大葉菊與云南屬植物有明顯區(qū)別。另外，目前大多數(shù)研究者認為ITS2比ITS1、全長ITS更有利于進行植物鑒定[22]。由于ITS1變化較大，無法保證保守的序列。Hoggard等[23]比較利用ITS1、小亞基rRNA 18S（SSU）、大亞基rRNA 26S（LSU）和ITS2鑒定人類菌群，發(fā)現(xiàn)使用ITS1、SSU或LSU標記無法識別由ITS2標記識別的關鍵分類單元。而全長ITS序列比ITS2長很多，比ITS2測序所需要的成本高，且樣品DNA降解也會影響全長ITS測序的精確性。另外ITS2有二級結(jié)構，比ITS序列保守性更高。因此，本研究中基于ITS2序列對芥辣類調(diào)味品中的山葵及辣根、芥末進行種屬鑒定。

3 結(jié) 語

基于ITS2序列的物種鑒定和聚類分析結(jié)果可知，山葵與白芥末之間的K2P遺傳距離最小，為0.088；白芥末與辣根之間的K2P遺傳距離最大，為0.171。山葵與白芥末、辣根對比后變異位點有36個。K2P遺傳距離分析可以看出山葵、辣根和白芥末的彼此遺傳距離較遠，推測3種植物各歸為一支，能用ITS2序列區(qū)分開來。從數(shù)據(jù)庫獲得山葵及其近緣物種ITS2序列，用NJ法進行系統(tǒng)分析表明，山葵和西北山崳菜以99%的支持率聚為一大支，白芥末、黑芥末和棕芥末聚為一大支。山崳菜屬的山葵和西北山崳菜與蕓苔屬的3種芥末K2P遺傳距離在0.064～0.077，而蕓苔屬的3種芥末與辣根K2P遺傳距離在0.080～0.105，K2P遺傳距離都較遠，且大于0.01。這些結(jié)果表明，通過利用ITS2序列進行DNA擴增和測序分析能明顯將山葵及其近緣物種鑒定出來。利用該方法可以鑒別芥辣類調(diào)味品中復雜成分，鑒定芥辣類產(chǎn)品中是否含有山葵、辣根或芥末。另外，還可以將該方法應用于實時定量PCR，從而同時檢測出含有山葵、辣根、芥末等成分的樣品中各成分的含量，為芥辣類相關食品檢測提供一種更高效、靈敏的檢測方法。