自噬在葛根素促成骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)中的作用

于冬冬，趙丹陽，楊鶇祥

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，沈陽 110032；2.沈陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110041）

成骨細(xì)胞的分化受到抑制是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要機(jī)制之一［1-2］。近年來，應(yīng)用中藥的活性成份調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松癥的目的越來越受到人們的重視，如淫羊藿苷、丹參酮-ⅡA和骨碎補(bǔ)等［3-5］。葛根素作為中草藥葛根的活性成分，能增加成骨細(xì)胞的增殖和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的活性、促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成，促進(jìn)機(jī)體骨密度和骨礦物質(zhì)含量增加［6］。本課題組前期研究［1，7-8］發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的分化。

自噬是維持細(xì)胞正常代謝必需的一個(gè)生理過程［9］。自噬與骨質(zhì)疏松癥關(guān)聯(lián)密切，敲除自噬關(guān)鍵基因的模型大鼠骨量下降，發(fā)生骨質(zhì)疏松癥［10］。自噬缺乏的成骨細(xì)胞礦化能力降低［11］，提示自噬在骨形成和成骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

葛根素能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及礦化，但是其作用機(jī)制目前還不完全清楚。本研究擬探討自噬在葛根素調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化過程中的作用，為葛根素應(yīng)用于臨床防治骨質(zhì)疏松癥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：hFOB1.19人成骨細(xì)胞（美國ATCC公司）。

1.1.2 試劑：葛根素（中國狄爾格生物醫(yī)藥公司，溶于DMSO，儲(chǔ)存濃度1×10-5mol/L，-20 ℃保存）；進(jìn)口胎牛血清（美國Hychone公司）；BCIP/NBT ALP顯色試劑盒（中國Beyotime公司），茜素紅S（美國Sigma公司），免疫熒光染色試劑盒、山羊抗兔、山羊抗鼠二抗HRP（美國Abcom公司），Cy3標(biāo)記的二抗（中國Beyotime公司）；Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX 2），骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、微管相關(guān)蛋白輕連3-Ⅱ/Ⅰ（microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ/Ⅰ，LC3-Ⅱ/Ⅰ）、BECLIN 1一抗（美國Abcom公司）；G418（美國Sigma公司）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）。

1.1.3 儀器：細(xì)胞孵箱（日本Thermo公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；免疫熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；AMR-100酶標(biāo)儀（中國杭州奧盛儀器公司）。

1.2 方法

1.2.1 hFOB1.19成骨細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及分組：

1.2.1.1 未分化的成骨細(xì)胞培養(yǎng) 未分化的成骨細(xì)胞培養(yǎng)基含DMEM/F-12、10%胎牛血清、0.3 g/L G418，孵箱培養(yǎng)條件為5%CO2、33 ℃。

1.2.1.2 誘導(dǎo)分化培養(yǎng) 分化培養(yǎng)基是在未分化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入β-甘油磷酸（5×10-3mol/L），抗壞血酸（0.1 g/L），維生素K（10-8mol/L ），1，25-二羥維生素D3［1，25（OH）2D3］（10-7mol/L），孵箱培養(yǎng)條件為5%CO2，39.4 ℃。

1.2.1.3 分組 將成骨細(xì)胞分為3組，即A組（成骨分化誘導(dǎo)），B組（成骨分化誘導(dǎo)+10-8mol/L葛根素3 h），C組（成骨分化誘導(dǎo)+10-8mol/L葛根素3 h+5 mmol/L 3-MA 1 h）。

1.2.2 ALP分析：細(xì)胞分組處理后，PBS洗滌3次，用95%乙醇固定細(xì)胞10 min，晾干，按照碧云天的BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒所提供的相應(yīng)操作步驟進(jìn)行染色分析，晾干拍照。

1.2.3 茜素紅染色：細(xì)胞（1×105/孔）接種于24孔板內(nèi)生長致融合，分組處理后75%乙醇固定和1%的茜素紅S染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 免疫熒光染色檢測成骨分化過程中LC3Ⅰ/Ⅱ的蛋白表達(dá)：將圓形的多聚賴氨酸載玻片至于6孔板內(nèi)，細(xì)胞接種于多聚賴氨酸載玻片上24 h。分組處理后，用免疫染色固定液固定爬片10 min，免疫染色洗滌液洗玻片3次，每次3 min，封閉液封閉60 min；一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。去除一抗，加熒光二抗，濕盒中37 ℃孵育1 h，滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.5 透射電鏡觀察：細(xì)胞經(jīng)分組處理后消化、離心，去上清，將離心管中的細(xì)胞團(tuán)塊取出移入1.5 mL的EP管內(nèi)，在4 ℃用PBS漂洗3次，每次10 min。再用1% 四氧化鋨在4 ℃固定15～30 min，接著用PBS漂洗3次。丙酮溶液梯度脫水后浸透，吸棄瓶中脫水劑，加3 mL純丙酮-EPON812包埋劑（1 ∶1體積比），室溫下放置30 min后，棄去稀釋的包埋劑，加純包埋劑1 mL，室溫放置2 h或過夜。將預(yù)先干燥的EPON明膠囊注滿混合包埋劑，倒蓋在單層細(xì)胞上，在60 ℃固化24 h。超薄切片，采用JEOL 2000FX透射電子顯微鏡觀察。對(duì)自噬性溶酶體空泡樣量化，自噬性溶酶體空泡樣的計(jì)數(shù)在每個(gè)領(lǐng)域和標(biāo)準(zhǔn)化的表面積（n＞ 3）。

1.2.6 Western blotting檢測：加入裂解液提取細(xì)胞蛋白，冰上放置40 min，4 ℃ 12 000 r/min離心40 min，取上清，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白樣品，于10%聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后100 V電轉(zhuǎn)印至PVDF膜。將PVDF膜放入封閉液中37 ℃封閉1 h，加入稀釋一抗4 ℃孵育過夜。PBS洗膜3次，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的稀釋二抗孵育，37 ℃震搖1 h，洗膜。ECL發(fā)光法曝光成像，掃描入電腦（n＞ 3）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用ANOVA方法，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化

不同濃度的葛根素（10-6、10-7、10-8mol/L）處理誘導(dǎo)分化組細(xì)胞3 h后，都可見不同程度的促成骨細(xì)胞分化作用。結(jié)果顯示，未處理組細(xì)胞ALP染色陽性面積約占視野的40%，10-6mol/L葛根素組ALP染色陽性面積約占視野的55%，10-7mol/L葛根素組ALP染色陽性面積約占視野的65%，10-8mol/L葛根素組ALP染色陽性面積約占視野的80%以上，見圖1。葛根素在10-8mol/L濃度時(shí)促成骨細(xì)胞分化效果最明顯（P=0.002），因此，本研究選用該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化 ×40Fig.1 Puerarin promotes osteoblast differentiation ×40

2.2 3-MA抑制葛根素的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化

ALP染色結(jié)果顯示，非誘導(dǎo)組細(xì)胞分化不明顯，A組細(xì)胞開始成骨細(xì)胞分化，ALP染色陽性面積約占視野的30%。B組成骨細(xì)胞分化效果顯著提升，ALP染色陽性面積約占視野的80%（P=0.004），C組成骨細(xì)胞分化程度明顯高于對(duì)照組（P=0.021），但明顯低于葛根素處理的B組，ALP染色陽性面積約占視野的50%，見圖2。

圖2 3-MA抑制葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化作用 ×40Fig.2 Inhibition of puerarin’s osteogenic effect by 3-MA ×40

2.3 葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化

茜素紅染色結(jié)果顯示，A組細(xì)胞有鈣化結(jié)節(jié)的形成，茜素紅染色陽性面積約占視野的25%。B組鈣化結(jié)節(jié)的形成更加顯著（P=0.012），茜素紅染色陽性面積約占視野的50%。C組促成骨細(xì)胞分化受到抑制（P=0.034），茜素紅染色陽性面積約占視野的30%，見圖3。

圖3 葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化 ×40 Fig.3 Puerarin promotes osteoblast mineralization ×40

2.4 葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化過程中自噬體的形成

A組有少量自噬體形成，B組自噬體形成較A組增多（P=0.002）。C組用3-MA自噬抑制劑處理后，自噬體明顯減少，在自噬受到抑制的同時(shí)，葛根素的促成骨細(xì)胞分化效果也受到抑制（P=0.024），見圖4。

圖4 葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化過程中自噬體的形成Fig.4 Puerarin promotes autophagy during osteoblast differentiation

2.5 葛根素促進(jìn)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，未加葛根素處理時(shí)，LC3-Ⅱ散在分布于細(xì)胞質(zhì)中，加入葛根素后，LC3-Ⅱ增多并在細(xì)胞核周圍累積（染色紅色），說明LC3-Ⅱ的表達(dá)和分布通過葛根素給藥明顯放大。用3-MA自噬抑制劑（5 mm，1 h）處理后，LC3-Ⅱ表達(dá)減少，見圖5。

圖5 葛根素促進(jìn)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá) Fig.5 Puerarin promotes LC3-Ⅱ protein expression

2.6 葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞分化過程中，A組OPG、RUNX 2蛋白表達(dá)略增加，B組OPG、RUNX 2蛋白表達(dá)明顯增加（P=0.012和P=0.38）。C組葛根素的促成骨細(xì)胞分化作用被明顯減弱，其蛋白表達(dá)與A組相似。提示葛根素在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化過程中，成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，見圖6。

圖6 葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 Puerarin promotes autophagy during osteoblast differentiation

2.7 葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化過程中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

A組LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)略有增加（P=0.001），B組LC3-Ⅱ的表達(dá)顯著增加。BECLIN 1在自噬開始的信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用，與A組相比，B組BECLIN 1的表達(dá)也顯著增加（P=0.004）。C組葛根素的促成骨細(xì)胞分化作用被明顯減弱，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)亦減弱。提示在葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化過程中，自噬發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用（P=0.014和P=0.028），見圖7。

圖7 葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化過程中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.7 Puerarin promotes expression of autophagy-related proteins during osteoblast differentiation

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程中伴隨著成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性的不平衡［12］。其中，成骨細(xì)胞的分化能力降低是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的主要原因之一。成骨細(xì)胞是骨形成的主要細(xì)胞，因此，增加成骨細(xì)胞的分化能力是防治骨質(zhì)疏松癥的主要策略［13］。前期相關(guān)研究［14］發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。但是，葛根素對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響以及自噬在成骨細(xì)胞分化過程中的作用目前還不清楚。

自噬參與骨組織的代謝過程，適當(dāng)水平的自噬使成骨細(xì)胞能夠存活于低氧、營養(yǎng)缺乏甚至高滲的環(huán)境［15］。此外，自噬在維持骨穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用，與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生密切相關(guān)［11］。研究［16-17］表明，自噬相關(guān)蛋白參與成骨細(xì)胞分化、礦化和骨形成。敲除FIP200（參與組成fip200-atg13-ulk1復(fù)合體）的基因鼠模型中，由于骨形成嚴(yán)重減少導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，導(dǎo)致成骨細(xì)胞多種自噬缺陷，包括p62的過表達(dá)、LC3-Ⅱ 的轉(zhuǎn)換不充分、自噬流的缺乏等，影響骨的形成［18-19］。敲除自噬相關(guān)基因7可導(dǎo)致大鼠松質(zhì)骨的骨量和皮質(zhì)骨的厚度下降，皮質(zhì)骨孔隙度增加，誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生［20］。

本研究結(jié)果表明，成骨細(xì)胞在分化過程中表現(xiàn)出一定的基礎(chǔ)自噬水平，葛根素在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的同時(shí)，也明顯增強(qiáng)細(xì)胞的自噬能力，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量增加和自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ和BECLIN 1的表達(dá)增強(qiáng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，加入自噬抑制劑3-MA后，葛根素的促成骨細(xì)胞分化作用受到明顯抑制，說明自噬在葛根素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的過程中扮演著重要的角色，葛根素可能通過自噬調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化。

本研究深入分析了自噬在葛根素促成骨細(xì)胞分化中的分子生物學(xué)作用，明確了葛根素通過自噬調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化潛在的機(jī)制，為臨床應(yīng)用中藥單體防治骨質(zhì)疏松癥提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。