多黏菌素耐藥性研究進(jìn)展

李立，葉璟，胡蕾，談林華

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院外科重癥監(jiān)護(hù)室 國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310052)

多重耐藥菌不斷泛濫已在全世界引起很高的發(fā)病率和死亡率，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亟待解決的重大問題。根據(jù)預(yù)測，到2050年每年將有約1 000萬人死于耐藥菌感染[1]。特別是耐碳青霉烯的腸桿菌科細(xì)菌，銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的暴發(fā)給抗菌藥物的選擇帶來巨大挑戰(zhàn)[2]。由于缺乏新的有效治療藥物，多黏菌素再次成為治療多重耐藥性的革蘭陰性菌(Gram-negative bacteria,GNB)感染的最后一道防線[3]。

多黏菌素是由廣泛分布于土壤的多黏芽孢桿菌產(chǎn)生的一種聚陽離子多肽[4]，屬于多黏菌素類抗生素，具有親水和親脂的雙親性。根據(jù)多黏菌素化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同可分為多黏菌素A、B、C、D和E五個(gè)家族成員[5]。目前在臨床上使用的僅為多黏菌素B和多黏菌素E(即黏菌素)兩種。但隨著多黏菌素的應(yīng)用，其耐藥菌株在世界范圍內(nèi)迅速出現(xiàn)[6]。Touati等[7]對北非黏菌素耐藥流行病學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)的評價(jià)發(fā)現(xiàn)，這些耐藥菌株廣泛分布于農(nóng)場動(dòng)物的糞便、食物、環(huán)境樣本及臨床中?，F(xiàn)對多黏菌素耐藥性的研究進(jìn)展予以綜述，以期為應(yīng)對多黏菌素耐藥性傳播提供新視角。

1 多黏菌素抗菌作用機(jī)制

GNB的外膜是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要屏障。外膜表面脂多糖的存在限制了其疏水性和(或)大分子抗生素的滲透，對細(xì)菌起到保護(hù)作用。脂質(zhì)A是脂多糖的重要組成部分，在細(xì)菌滲透性及與細(xì)胞外部交換中起重要作用[8]。多黏菌素帶正電荷的二氨基丁酸殘基通過靜電作用與GNB外膜中脂多糖脂質(zhì)A上帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)競爭性置換脂多糖上的二價(jià)陽離子(Ca2+和Mg2+)，破壞脂多糖的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而破壞GNB的細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放，引起細(xì)菌死亡。多黏菌素還可通過囊泡接觸途徑、羥自由基途徑抑制細(xì)菌呼吸酶活性等機(jī)制起到殺菌作用[9-11]。

2 多黏菌素耐藥機(jī)制

2.1染色體介導(dǎo)的黏菌素耐藥性 GNB對多黏菌素耐藥的機(jī)制較復(fù)雜，目前仍不明確[3]。脂多糖是多黏菌素的作用靶點(diǎn)，脂多糖的修飾改變會(huì)影響其對GNB的殺菌效果。通過陽離子基團(tuán)4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖(4-amino-4-deoxy-L-arabinose,L-Ara4N)和(或)磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine，PEtN)部分取代脂質(zhì)A的磷酸基團(tuán)可以實(shí)現(xiàn)對脂多糖的修飾[10-11]。脂多糖修飾的過程受雙組分調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)[12]。該調(diào)控系統(tǒng)及其調(diào)節(jié)器的突變會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)A的磷酸基團(tuán)被L-Ara4N、PetN陽離子基團(tuán)取代，降低外膜的負(fù)電荷，阻礙多黏菌素與細(xì)菌的結(jié)合，減弱多黏菌素的殺菌作用[13]。GNB主要通過降低外膜的負(fù)電荷來實(shí)現(xiàn)對脂多糖的修飾作用，脂多糖的修飾涉及的基因和操縱子如下。

2.1.1pmrCAB操縱子、pmrHFIJKLM操縱子及pmrE基因 pmrCAB操縱子編碼3種蛋白質(zhì)：PEtN磷酸轉(zhuǎn)移酶PmrC(又稱eptA)，負(fù)責(zé)將pEtN基團(tuán)添加到脂多糖上，因此PmrC過表達(dá)會(huì)影響多黏菌素與細(xì)菌外膜的結(jié)合，是黏菌素耐藥性的主要原因之一；響應(yīng)調(diào)節(jié)器PmrA(也稱為BasR)；傳感器激酶蛋白PmrB(也稱為BasS)[14]。pmrCAB的突變可能會(huì)影響相關(guān)蛋白的表達(dá)，改變其對多黏菌的耐藥性。有學(xué)者通過Sanger測序研究發(fā)現(xiàn)，pmrCAB中突變數(shù)量最高的是PmrB，其最常見的氨基酸變異是A138T，約占分離菌株的41%；而PmrC的突變是I42V和L150F[15]。Oikonomou等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黏菌素敏感和耐藥菌株中均存在pmrCAB的突變，表明鮑曼不動(dòng)桿菌對多黏菌素耐藥機(jī)制復(fù)雜，僅pmrCAB基因的突變不足以誘導(dǎo)其對多黏菌素的耐藥性。pmrHFIJKLM操縱子(也稱為arnBCADTEF或pbgPE操縱子)和pmrE基因負(fù)責(zé)陽離子基團(tuán)L-Ara4N的合成并將其固定到脂質(zhì)A上[17]。

2.1.2PmrAB雙組分系統(tǒng)及crrAB操縱子 該系統(tǒng)編碼調(diào)節(jié)蛋白PmrA和蛋白激酶PmrB兩種蛋白，PmrB是一種具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)，具有傳感器特性，可以檢測細(xì)胞膜Mg2+和Ca2+含量的變化、pH值改變及黏菌素等環(huán)境信號的變化[18]。受這些環(huán)境刺激，PmrB可通過磷酸化途徑激活PmrA，活化的PmrA可依次激活pmrCAB操縱子、pmrHFIJKLM操縱子以及pmrE基因。pmrHFIJKLM操縱子和pmrE基因負(fù)責(zé)L-Ara4N和pEtN部分的合成及其與脂質(zhì)A的結(jié)合[17]。

crrAB操縱子編碼調(diào)控蛋白CrrA和傳感器蛋白激酶CrrB兩種蛋白。crrAB操縱子的生理作用機(jī)制仍不清楚。但crrB基因失活可導(dǎo)致pmrAB操縱子過表達(dá)，從而引起pmrHFIJKLM操縱子、pmrC和pmrE基因的激活，產(chǎn)生L-Ara4N和pEtN[19]。

2.1.3PhoPQ雙組分系統(tǒng)及其調(diào)控基因mgrB 與PmrAB系統(tǒng)類似，環(huán)境刺激物(如巨噬細(xì)胞吞噬體、Fe2+、Al3+和pH值)可激活具有酪氨酸激酶活性的PhoQ，活化的PhoQ可通過磷酸化途徑激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PhoP[20]?；罨腜hoP驅(qū)動(dòng)pmrHFIJKLM操縱子的轉(zhuǎn)錄，該操縱子通過向脂多糖中添加L-Ara4N參與脂多糖的化學(xué)修飾。同時(shí)，活化的PhoP還可以激活pmrA基因，從而觸發(fā)PmrA蛋白的表達(dá)，將pEtN添加到脂多糖中[21-22]。

mgrB基因是一個(gè)長度為141個(gè)核苷酸保守基因，編碼一個(gè)47個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)MgrB[21]。該蛋白質(zhì)對PhoPQ調(diào)節(jié)系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)反饋，降低其對黏菌素的耐藥性。然而mgrB基因的失活或缺失引起phoPQ操縱子的過表達(dá)，導(dǎo)致pmrHFIJKLM操縱子激活，引起L-Ara4N生物合成，增加其對黏菌素耐藥性[23]。mgrB基因突變是臨床肺炎克雷伯菌耐藥的主要原因，該耐藥性是通過插入序列(IS5-like、IS1F、ISKpn13、ISKpn14、IS10R)或點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)[24]。

2.1.4lpxA、lpxC和lpxD基因 lpxA、lpxC和lpxD基因與脂質(zhì)A生物合成有關(guān)，其突變失活會(huì)引起脂多糖合成障礙，導(dǎo)致多黏菌素的作用靶點(diǎn)喪失[25]。這組獨(dú)特的基因存在于鮑曼不動(dòng)桿菌，其突變會(huì)影響脂質(zhì)A的生物合成，形成鮑曼不動(dòng)桿菌對多黏菌素的高度耐藥性。一項(xiàng)對21株體外培養(yǎng)的多黏菌素耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌獨(dú)立型菌株ATCC 19606的分析表明，脂質(zhì)A生物合成的3種基因(lpxA、lpxC、lpxD)均含有獨(dú)特突變方式：單個(gè)堿基的改變、大片段的缺失和IS元件的插入[26]。其中IS Aba11和一個(gè)新型的IS4家族元件的替換、截?cái)?、移碼或插入失活會(huì)導(dǎo)致脂多糖完全喪失，引起多黏菌素耐藥。脂多糖是細(xì)菌的一種主要的毒力因子和主要結(jié)構(gòu)成分，這種突變引起細(xì)菌結(jié)構(gòu)變化的同時(shí)也會(huì)引起其毒力下降。上述機(jī)制通常會(huì)導(dǎo)致耐藥性增加，但傳播率較低。

另外，GNB對黏菌素的耐藥機(jī)制還包括外排泵系統(tǒng)的孔蛋白突變和過表達(dá)、莢膜多糖的產(chǎn)生、黏菌素滅活酶等[24]。

2.2質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥性 在臨床分離獲得的對多黏菌素具有耐藥性的菌株仍較少。長期以來對多黏菌素耐藥的機(jī)制均被歸因于染色體突變，但這種耐藥性不會(huì)在細(xì)菌間進(jìn)行傳播，不具備廣泛流行的特點(diǎn)。直到2015年，中國學(xué)者在對食用動(dòng)物大腸埃希菌抗生素耐藥性例行監(jiān)測時(shí)鑒定出第一個(gè)質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素可移動(dòng)耐藥基因mcr，命名為mcr-1[27- 28]。

mcr-1是一種PEtN脂質(zhì)A轉(zhuǎn)移酶，屬于“YhjW/YjdB/YijP”堿性磷酸酶超家族[29]。目前共發(fā)現(xiàn)了22種mcr-1的遺傳變異體[30]，包括mcr-1.1[27]、mcr-1.2[31]，直到mcr-1.22。這些變異體核苷酸和氨基酸具有高度一致性，對黏菌素的耐藥機(jī)制也相似[30，32]。mcr-1介導(dǎo)黏菌素耐藥性的機(jī)制與GNB固有耐藥機(jī)制相同。mcr-1編碼PEtN轉(zhuǎn)移酶，促使PEtN加入脂多糖的脂質(zhì)A上，從而增加脂多糖陽離子電荷，降低黏菌素對脂多糖的結(jié)合力[27，32-33]。

在國內(nèi)，mcr-1的存在最早可追溯到20世紀(jì)80年代[34]。1970—2014年對雞大腸埃希菌分離株的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查表明，大腸埃希菌mcr-1的攜帶率從2009年的5.2%增加到2014年的30.0%[34]。推測可能與我國此期間多黏菌素在畜牧業(yè)中的大量使用有關(guān)。而在一些尚未將黏菌素作為生長促進(jìn)劑使用的國家(如美國及歐洲)食用動(dòng)物中mcr-1基因的攜帶率較低(0.1%～10%)[35-36]。2017年我國政府做出嚴(yán)格禁止黏菌素作為畜牧生產(chǎn)的增長促進(jìn)劑的決定[37]。

mcr-1已成為大量GNB對多黏菌素耐藥性傳播的一個(gè)重要原因[13，17，27]。mcr-1可在不同菌株間傳播，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、阪崎腸桿菌、沙門菌、弗氏檸檬酸桿菌、檸檬酸桿菌、宋內(nèi)痢疾和莫拉菌[13，38]，也可在農(nóng)場動(dòng)物的糞便、食物、環(huán)境樣本中廣泛傳播[39]。2020年，mcr-10在細(xì)菌Enterobacter roggenkampii的質(zhì)粒上得到鑒定，目前在GNB中共發(fā)現(xiàn)10個(gè)不同變異體[40]。已知的mcr基因的變異體見表1。

3 不同細(xì)菌的多黏菌素耐藥機(jī)制

3.1腸桿菌科 腸桿菌科家族中對多黏菌素耐藥性菌株較多，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌、志賀菌屬、腸桿菌屬和檸檬酸桿菌[54-55]，其主要耐藥機(jī)制是通過添加陽離子基團(tuán)L-Ara4N和(或)pEtN來修飾脂多糖實(shí)現(xiàn)[11-12]。

肺炎克雷伯菌染色體耐藥機(jī)制主要是由mgrB基因介導(dǎo)。mgrB基因的失活或缺失引起phoPQ操縱子過表達(dá)，進(jìn)而激活pmrHFIJKLM操縱子，促進(jìn)L-Ara4N 生物合成，增加其黏菌素耐藥性[23]。肺炎克雷伯菌另一個(gè)多黏菌素耐藥機(jī)制是表面陰離子莢膜多糖的過表達(dá)[24]，產(chǎn)生的保護(hù)性屏障阻礙了多黏菌素與脂質(zhì)A的結(jié)合。

在大腸埃希菌中，mgrR是其對多黏菌素耐藥的遺傳決定因素[56]。mgrR通過將pEtN添加到脂多糖中實(shí)現(xiàn)對多黏菌素的耐藥。在沙門菌中，mig-14基因可以通過降低生物體外膜的滲透性，支持生物膜形成來影響多黏菌素耐藥性[57]。而在鼠傷寒沙門菌中，lpxM可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)A的?；饔?，其失活可導(dǎo)致L-Ara4N修飾缺失，降低多黏菌素的耐藥性。

除上述染色體基因改變外，腸桿菌科細(xì)菌是可移動(dòng)多黏菌素耐藥基因的第一個(gè)儲(chǔ)存庫，2015年11月首次在動(dòng)物來源大腸埃希菌菌株中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1[27]。迄今為止，大腸埃希菌仍是mcr陽性分離株中最流行的物種，占攜帶mcr分離株總數(shù)的90%以上，其次是腸沙門菌(7%)、肺炎克雷伯菌(2%)[58]。截至2019年，mcr在已在全球47個(gè)不同國家均有報(bào)道，廣泛分布于動(dòng)物、水、食物和生存環(huán)境中[39，58]。

3.2鮑曼不動(dòng)桿菌 與其他腸桿菌科細(xì)菌相比，鮑曼不動(dòng)桿菌缺乏用于L-Ara4N生物合成所有必需基因[13]。Adams等[59]研究顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌的黏菌素耐藥性與pmrA和pmrB基因有關(guān)。pmrA和pmrB基因突變引起pEtN加入脂多糖中，降低外膜的負(fù)電荷，阻礙多黏菌素與細(xì)菌的結(jié)合，產(chǎn)生耐藥性。對黏菌素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株也可通過PmrA/B突變下調(diào)操縱子PmrCAB表達(dá)，降低其耐藥性。

另外，在鮑曼不動(dòng)桿菌中鑒定出生物素、lpxA、lpxC和lpxD基因與多黏菌素耐藥性關(guān)系密切。生物素、lpxA、lpxC和lpxD是脂質(zhì)代謝的重要輔助因子，生物素水平不足或lpxA、lpxC和lpxD基因突變可影響脂質(zhì)A的生物合成，是鮑曼不動(dòng)桿菌中多黏菌素耐藥性相關(guān)的因子[3，13]。而較高的生物素水平導(dǎo)致脂質(zhì)A的產(chǎn)生增加，可降低鮑曼不動(dòng)桿菌對黏菌素的耐藥水平[60]。另據(jù)Bojkovic等[61]研究揭示，LptD是新合成的脂多糖插入到外膜所必要的成分，去除lptD基因可導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌脂多糖完全缺失，引起多黏菌素耐藥性降低。

對鮑曼不動(dòng)桿菌，常規(guī)染色體編碼多黏菌素耐藥性的傳播力有限。然而，近年在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒攜帶的mcr基因：在捷克共和國鮑曼不動(dòng)桿菌中檢測到了mcr-4[62]，在巴基斯坦鮑曼不動(dòng)桿菌中檢測到了mcr-1[63]以及在中國[52]和巴西[64]等地檢測到mcr-4.3。這種基因型分布和耐藥機(jī)制的發(fā)現(xiàn)對鮑曼不動(dòng)桿菌對多黏菌素的耐藥性研究至關(guān)重要。

3.3銅綠假單胞菌 銅綠假單胞菌的耐藥性由5個(gè)調(diào)節(jié)脂多糖修飾的雙組分系統(tǒng)介導(dǎo)，除PmrAB和PhoPQ的雙組分系統(tǒng)外，還涉及ColR/ColS、ParR/ParS和CprRS三個(gè)雙組分調(diào)控系統(tǒng)[24]。在細(xì)胞外Zn2+過量的情況下，ColR/ColS雙組分調(diào)控系統(tǒng)上調(diào)，將PEtN添加到脂質(zhì)A中，從而引起黏菌素耐藥性[10]。

與鮑曼不動(dòng)桿菌類似，銅綠假單胞菌中l(wèi)pxC或lpxO2基因的突變也可導(dǎo)致脂質(zhì)A的生物合成障礙，使多黏菌素作用靶點(diǎn)丟失，導(dǎo)致對多黏菌素耐藥性增高[3]。此外，在細(xì)胞膜Mg2+水平降低的情況下，外膜蛋白OprH(或H1)過表達(dá)并與帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)相結(jié)合，阻礙多黏菌素的結(jié)合，產(chǎn)生耐藥性[65]。Perez等[65]揭示多黏菌素耐藥性也可能通過產(chǎn)生過多莢膜而發(fā)生。

在質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥方面，人們首次在美國馬里蘭州地區(qū)銅綠假單胞菌中檢測到mcr。2018年，Snesrud等[66]通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)了銅綠假單胞菌中編碼mcr-5的染色體中攜帶黏菌素不敏感的轉(zhuǎn)座子。2019年在對巴基斯坦地區(qū)銅綠假單胞菌多黏菌素耐藥性調(diào)查中也檢測到mcr-1陽性的分離菌株[64]。銅綠假單胞菌中mcr基因的起源、可傳播性和流行性仍有待進(jìn)一步鑒定。

4 展 望

GNB是引起臨床感染的常見病原體，如碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌等多重耐藥微生物感染越來越受到人們的關(guān)注。新型抗菌藥物研發(fā)遲緩，促使黏菌素再次成為人們治療多重耐藥GNB的重要選擇。然而畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)中黏菌素的廣泛濫用使其耐藥菌株在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)，這大大損害了黏菌素的功效。特別是質(zhì)粒攜帶的mcr耐藥基因的跨物種傳播，已成為全世界的公共衛(wèi)生和臨床管理領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)問題。因此，應(yīng)加強(qiáng)抗生素耐藥基因的檢測，同時(shí)加強(qiáng)相關(guān)專家之間的跨學(xué)科交流與合作，有效制止黏菌素在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及臨床上的濫用，嚴(yán)格控制細(xì)菌耐藥性的進(jìn)一步傳播，同時(shí)制訂政策引導(dǎo)，加大新型抗生素的研發(fā)投入力度。