昆明地區(qū)引種荷花遺傳多樣性分析

趙琳，林森，趙琬玥，胡慧貞，陳龍清

西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院/國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心,昆明 650224

荷花(NelumbonuciferaGaertn.)為蓮科(Nelumbonaceae)蓮屬(Nelumbo)的多年水生草本植物，是中國十大傳統(tǒng)名花中唯一的水生花卉，也是重要的切花植物[1]，能有效吸收水體中的氮和磷，凈化水質(zhì)[2]。荷花已有2 500多年的栽培歷史，正式文獻記載的名稱全球已達2 080個[3]，根據(jù)用途劃分為花蓮、籽蓮及藕蓮，是集觀賞、食用和藥用價值于一身的重要的經(jīng)濟植物。

物種適生性及遺傳多樣性研究有助于探究物種對環(huán)境變化的響應(yīng)，采取人為手段幫助物種適應(yīng)環(huán)境變化，對于保護和利用遺傳資源以及改良植物性狀具有重要意義[4]。荷花為異花授粉植物，高度雜合，遺傳變異多樣，可供選擇的親本數(shù)量龐大，通過分子標記技術(shù)手段能高效且精確地反映個體分子水平上的遺傳差異優(yōu)勢，目前常用的分子標記有InDel、SSR、SRAP、Scot等。其中InDel和SSR作為共顯性標記廣泛分布于基因組中，數(shù)量眾多、突變率高、雜合程度高、多態(tài)性含量較高，在植物遺傳多樣性分析中應(yīng)用廣泛。Indel標記是不同個體基因組同一位點序列核苷酸片段的插入和缺失，其檢出效率較高[5]。SSR標記為簡單重復(fù)序列，按其來源可分為基因組SSR和EST-SSR，廣布于整個基因組中，在荷花的進化及多樣性分析中得到廣泛應(yīng)用[6]。此外，SSR標記及SNP標記在鑒別品種中具有較高的靈敏度，被國際植物品種權(quán)保護聯(lián)盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV)確定為構(gòu)建植物品種DNA數(shù)據(jù)庫的首選標記[7]。

2013年中國古代蓮全基因組測序完成[8]；2018年 “Chinese Tai-Zi”染色體水平上的基因組組裝完成[9]；這2個基因組測序的完成為荷花功能組學(xué)研究和新基因的挖掘提供了豐富的遺傳信息，為解析不同生物學(xué)性狀提供了基礎(chǔ)。Hu等[10]對58個荷花種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，藕蓮和籽蓮分別聚為不同類群，花蓮在2個類群中均有分布。Yang等[11]利用36對SSR標記對來自不同地區(qū)的11個居群的83份荷花資源進行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)泰國蓮與中國蓮居群之間的親緣關(guān)系比美洲黃蓮近。Yang等[12]結(jié)合分子標記對210份荷花種質(zhì)資源進行連續(xù)2 a的表型觀測，對荷花重要觀賞性狀遺傳定位進行了研究。AN等[13]對18個省的94份藕蓮進行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)和華東地區(qū)的藕蓮品種具有更高的遺傳多樣性。Zheng等[14]通過EST-SSR標記構(gòu)建包括荷花在內(nèi)的3類水生植物指紋圖譜，為快速鑒定后代種子是否純合提供了便利。

云南地區(qū)高原湖泊眾多，地理和氣候環(huán)境多樣，植物多樣性豐富。普者黑、鶴慶等地素有栽培荷花的傳統(tǒng)，近期有研究指出，云南熱帶地區(qū)可能是野生荷花及重瓣型荷花的原產(chǎn)地[15]。云南鄉(xiāng)土荷花品種 ‘普者黑紅荷’‘普者黑白荷’‘小灑錦’‘宜良千瓣’ 等皆具有較高的食用價值及觀賞價值[16]，但目前云南地區(qū)栽種的荷花多為外地引進品種，品種混雜，缺乏系統(tǒng)研究。為明確昆明地區(qū)引種栽培的荷花種質(zhì)資源的遺傳背景，更好地發(fā)揮該地區(qū)的生態(tài)環(huán)境優(yōu)勢，本研究利用InDel、EST-SSR和SSR標記對94份在昆明地區(qū)收集的引種荷花種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，充分了解引種栽培荷花遺傳多樣性、明確遺傳背景，以期為云南地區(qū)推廣荷花栽培提供參考依據(jù)并為荷花育種提供優(yōu)良親本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

94份荷花種質(zhì)原產(chǎn)于重慶大足、廣西貴港、湖北武漢及四川遂寧等地，其中52份引種后種植于西南林業(yè)大學(xué)荷花種質(zhì)資源圃，其余試驗樣品在云南昆明、曲靖、西雙版納地區(qū)采集所得，其中有30份為實生選育品種。品種信息詳見表1。

1.2 材料種植及管理

2018年4月上旬，選取頂芽保存完好、藕身具膨大的藕節(jié)2節(jié)及以上的種藕，種植于口徑 65 cm×高 70 cm 的黑色塑料缸。每缸種植2支，每一品種種植5缸，采用“藏頭露尾”的方式栽植，根據(jù)植株生長狀況適時進行科學(xué)管理。

1.3 DNA提取及標記擴增

選取無病蟲害剛出水面的卷葉，采用天根多糖多酚專用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-02)提取DNA；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，Nanodrop 2000測各樣本質(zhì)量濃度并記錄，將各樣本稀釋至50 ng/μL，于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

50對InDel引物為課題組自主開發(fā)，50對EST-SSR和50對SSR引物來源于已發(fā)表的文獻[6,11,17-18]，均由上海生工生物股份有限公司合成。隨機選擇5份供試材料DNA進行擴增，每個標記篩選出各20對多態(tài)性好、條帶清晰的引物用于94份種質(zhì)荷花的遺傳多樣性研究。采用6% 的聚丙烯酰胺凝膠對 PCR 擴增產(chǎn)物進行電泳、銀染、顯影、人工讀帶。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel對分子標記擴增條帶進行統(tǒng)計整理。利用POPGEN 32及PIC_CALC進行遺傳多樣性指標分析，利用Excel 2007及NTSYS-pc 2.10e進行遺傳相似系數(shù)分析及Mantel檢測。使用MEGA-X采用UPGMA法進行聚類，iTOL在線工具進行美化。利用Structure 2.3.4進行群體結(jié)構(gòu)分析，使用Structure Harvest在線工具計算最佳K值，確定群體數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel、EST-SSR、SSR遺傳多樣性分析

分別選取InDel、SSR、EST-SSR各50對引物進行擴增，篩選出InDel、SSR和EST-SSR各20對能擴增出豐富、穩(wěn)定、清晰條帶的標記對引種的94份荷花種質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)篩選出的標記能較好地揭示94份荷花材料多樣性及遺傳差異(表2)。3種分子標記共擴增204條條帶，總共檢測到233個等位基因。每種標記都表現(xiàn)出較高多樣性水平，平均Shannon指數(shù)≥0.85，基因多樣性指數(shù)≥0.52，多態(tài)性信息含量≥0.44，其中SSR標記在94份荷花種質(zhì)中表現(xiàn)出更高的多態(tài)性水平。

2.2 InDel、EST-SSR和SSR標記相關(guān)性檢測

對3種標記進行Mantel檢測，相關(guān)性分析結(jié)果(表3)顯示，InDel、EST-SSR和SSR三者間相關(guān)性除EST-SSR和SSR≥0.529 0，其他均小于0.5，說明3種標記間的相關(guān)性較差，但3種標記組合與InDel、EST-SSR和SSR遺傳相似系數(shù)矩陣相關(guān)性系數(shù)均大于0.789 4，呈高度正相關(guān)，表明可以采用3種標記組合進行遺傳多樣性分析。

表1 供試種質(zhì)及其來源 Table 1 Ninety-four Lotus accessions used in this study and their origins

續(xù)表1 Continued Table 1

注:1)帶“?”表示該材料信息不詳; 2)‘優(yōu)良株系X-X’為自主培育的新品種; ‘秋日紅花’ ‘秋星’ ‘秋艷’‘秋陽’‘秋玉’為秋荷品種,為中國蓮與泰國蓮雜交的后代。Note:1) Materials with ‘ ? ’mean unknown information; 2)‘ Youliang Zhuxi ’is new varietiy cultivated independently; ‘ Qiuri Honghua ’ ‘ Qiuri Xing ’ ‘ Qiu Yan ’ ‘ Qiu Yang ’ ‘ Qiu Yu ’ are autumn lotus varieties,the off-springs of crosses between Chinese lotus and Thai lotus.

表2 InDel、EST-SSR、SSR引物多態(tài)性分析 Table 2 The polymorphism analysis of InDel，EST-SSR and SSR

表3 InDel、EST-SSR、SSR標記遺傳相似系數(shù)相關(guān)系數(shù) Table 3 Correlation coefficients of InDel,EST-SSR,SSR genetic similarity coefficients

2.3 基于InDel、EST-SSR和SSR的聚類分析

聚類分析將94份種質(zhì)資源劃分為5大類(圖1)。結(jié)合種源地信息、形態(tài)特征和聚類結(jié)果綜合分析，結(jié)果表明：可以將類群 Ⅰ 細分為6個亞群。類群 Ⅰ-Ⅰ 有 33份材料，種源地為重慶及武漢的材料居多，除‘金鳳凰’‘如意觀音’為中美雜交蓮，31份為中國蓮，4份為實生苗選育品種，均為單瓣品種，其余29份荷花材料為重瓣荷花；除‘金鳳凰’為黃色，‘水中月’為白色以及‘大灑錦’為灑錦色系以外，其余均為紫堇色或淡紫堇色系。類群 Ⅰ-Ⅱ 有8份材料，僅‘玉鸝’為中美雜交蓮，其余均為湖北武漢地區(qū)的中國蓮，除‘艷陽天’外均表現(xiàn)為中小株型重瓣荷花，類群 Ⅰ-Ⅲ 有7份材料，僅‘錦紅袍’為中美雜交蓮，其余均為中國蓮品種，2個為秋荷品種，3個品種為太空育種品種，‘千瓣蓮’被劃分在此類群內(nèi)，花色多為紫堇色。類群 Ⅰ-Ⅳ 有17份材料，均為中國蓮品種，無明顯的種源地劃分；花色均為紫堇色或淡紫堇色系，大株型品種較多，3份秋荷品種聚類到一起，單瓣大株型籽蓮均在此類群內(nèi)，遺傳距離較近。Ⅰ-Ⅴ 僅‘新披針紅’一份材料，引自江蘇南京，為中小型重瓣荷花。Ⅰ-Ⅵ 類群有19份材料，有4份為美洲蓮品種，以湖北武漢地區(qū)引種品種較多，多為當(dāng)年蓮子播種的中小株型荷花。

帶▲為實生苗栽培品種 The cultivars with ▲ are indicated seeding culticars.圖1 94份荷花種質(zhì)資源聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 94 lotus

類群 Ⅱ，‘SN’獨聚為一支，該品種來自日本，與其他荷花品種地理距離較遠。

類群 Ⅲ，‘粉紅凌霄’獨聚為一支，為熱帶蓮品種。

類群 Ⅳ 有6個材料，除‘紅桃子’無法確認其種源外，其中5個均為中美雜交蓮，花色除‘媚態(tài)觀音’及‘紅桃子’為復(fù)色品種外，其余以黃色和白色為主。

類群Ⅴ，‘美洲黃蓮’獨聚為一支。

2.4 群體結(jié)構(gòu)分析

為了明確不同種質(zhì)間的群體結(jié)構(gòu)關(guān)系及遺傳背景差異，對94份材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，從圖2可以看出，94份荷花材料在K=5時，ΔK出現(xiàn)峰值，說明在此群體中有5種主要的基因組結(jié)構(gòu)成分。

圖2 ΔK隨K變化的折線圖Fig.2 ΔK values changing with K value

群體結(jié)構(gòu)分析的分組結(jié)果(圖3)顯示，根據(jù)顏色的不同可將94份荷花的主要遺傳組分劃分為5種；根據(jù)遺傳組分的相似性可以將94份種質(zhì)聚類成5個亞群，各亞群所包含的種質(zhì)材料與聚類分析的結(jié)果有相似之處。

遺傳組分的分組結(jié)果顯示群體R與聚類分析中的 Ⅰ-Ⅳ 種質(zhì)資源較一致，除‘媚態(tài)觀音’外，其余均為中國蓮，種系不明的‘紅桃子’可能為中美雜交蓮；大部分為子蓮及實生苗選育品種。群體G中與聚類分析中的類群 Ⅰ-Ⅰ 中的大部分種質(zhì)一致，大都為中國蓮品種，其中僅1份為黃色系中美雜交蓮‘金鳳凰’，但其遺傳組分與美洲黃蓮相似度較低。群體B中除‘水中月’為白色外，均為堇紫色品種?！\紅袍’‘陶然一笑’‘如意觀音’與美洲蓮遺傳組分的相似度很低，所以聚類結(jié)果中類群 Ⅰ-Ⅰ 及類群 Ⅰ-Ⅲ 均為中國蓮遺傳組分占比高的種質(zhì)資源。群體Y主要分布在類群 Ⅳ、Ⅴ 中，均為美洲蓮及中美雜交蓮。群體P與類群 Ⅰ-Ⅴ 中的種質(zhì)較一致，以武漢地區(qū)中國蓮為主，大部分為中小型荷花品種實生苗；其中‘玉鸝’與美洲蓮相似的組分很低，所以與中國蓮聚類在同一個組中；來自日本的‘SN’也在此群體內(nèi)，同一品種的不同實生苗遺傳組分也有所差異，且其遺傳組分組成較復(fù)雜。

圖中數(shù)字為種質(zhì)材料編號。The accession numbers are indicated in the figure.圖3 群體結(jié)構(gòu)Q圖Fig.3 Q-plot of the population structure

3 討 論

3.1 組合分子標記對遺傳多樣性的檢出率高

本研究中的94份荷花種質(zhì)來源廣泛，遺傳背景復(fù)雜，觀賞性狀及農(nóng)藝性狀豐富。不同的分子標記其來源不同，所揭示的基因位點的遺傳信息有所差異，可以為遺傳多樣性研究及種質(zhì)資源分類提供更豐富的遺傳信息，本研究通過Mantel檢測發(fā)現(xiàn)組合標記與單個分子標記的r值均大于0.75，采用組合分子標記發(fā)現(xiàn)供試群體具有豐富的遺傳多樣性。Hu等[10]利用AFLP和SSR標記進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)AFLP、SSR聯(lián)合分析的遺傳相似系數(shù)分別與AFLP和SSR標記高度匹配，使用聯(lián)合標記可以更好地進行聚類。Yang等[19]使用SSR、SRAP對43份荷花材料進行基因分型，SSR-SRAP聯(lián)合分析分別與SSR、SRAP高度相關(guān)。本研究的群體結(jié)構(gòu)分析顯示，同一品種的實生苗在遺傳組分上存在一定差異，說明聯(lián)合標記檢出率更高，在一定程度上能揭示較多的遺傳信息。

3.2 形態(tài)和分子標記相結(jié)合更利于對引種荷花的評價

結(jié)合3種分子標記的結(jié)果進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)荷花種質(zhì)在分子水平上與形態(tài)水平上對資源的分類并不完全一致，但具有一定的關(guān)聯(lián)性，袁王俊等[20]在菊花的遺傳多樣性分析中也發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的分類方法不能完全反映菊花的親緣關(guān)系，說明分子水平上揭示的遺傳信息差異不一定能在形態(tài)上表現(xiàn)出來；在關(guān)聯(lián)分析的研究中發(fā)現(xiàn)，分子標記位點間的相互連鎖會導(dǎo)致同一個分子標記位點同時影響多個相互關(guān)聯(lián)的表型性狀[21]。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征與荷花的經(jīng)濟價值直接相關(guān)，將形態(tài)學(xué)標記與分子標記結(jié)合分析對育種實踐具有重要的指導(dǎo)意義。聚類的群體與種質(zhì)資源的種源地沒有明顯的關(guān)聯(lián)，這與尹靜靜等[22]和李青竹等[23]對種藕的研究結(jié)果類似。Yeshitila等[24]利用9對SSR標記對來自不同自然地理分布的15個群體共計216個熱帶蓮樣本進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)遺傳距離與地理距離存在正相關(guān)關(guān)系，但是Islam等[25]利用12對SSR引物對326個美洲蓮的遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)遺傳距離與地理距離無顯著相關(guān)性。在本研究中，‘SN’‘粉紅凌霄’‘美洲黃蓮’等種源地與中國蓮種質(zhì)資源明顯分隔的品種，無論是在聚類還是群體結(jié)構(gòu)分析中與中國蓮品種均有差異，而群體內(nèi)來自中國各地區(qū)的種質(zhì)資源無明顯劃分，可能是由于引種的品種多為近期人工雜交選育，各地種質(zhì)資源交流頻繁導(dǎo)致基因交流頻繁，基因組分較為復(fù)雜。籽蓮品種均聚類在同一個群體或類群內(nèi)，大部分的研究表明藕蓮、籽蓮在分子水平上有較大的差異，它們復(fù)雜的遺傳關(guān)系可能是由于長期人工選擇和無性繁殖逐漸形成的遺傳差異[19,26]。本研究中花蓮觀賞性狀豐富，且部分品種與籽蓮遺傳分化明顯，可選擇優(yōu)良品種與結(jié)實較多的籽蓮進行雜交，選育新品種。

在聚類及群體結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，部分有記載種系來源的荷花品種與聚類結(jié)果有差異，可能是由于標記數(shù)量較少導(dǎo)致，同時聚類及遺傳結(jié)構(gòu)分析也能幫助重新注釋品種的背景，為后續(xù)的研究提供科學(xué)的指導(dǎo)。

聚類結(jié)果以及群體結(jié)構(gòu)分析皆顯示，美洲蓮被獨聚為一支，與亞洲蓮遺傳距離較遠，與前人研究結(jié)果一致[15]。中美雜交蓮在聚類的過程中沒有完全聚在一起，這可能是由于不同品種的中美雜交蓮遺傳組分構(gòu)成不同，通過群體結(jié)構(gòu)分析也可看出，部分中美雜交蓮遺傳組分與美洲蓮相似度極低，與中國蓮相似度更高。秋荷品種也并未完全聚類到一起，除秋玉外，其余品種遺傳組分類似，與種源地為泰國的‘粉紅凌霄’遺傳組分部分相似。

綜上，InDel、EST-SSR和SSR 3種分子標記組合對荷花多樣性研究有較高的檢出率，94份荷花品種遺傳多樣性高，亞洲蓮及美洲蓮有明顯遺傳分化，不同品種的中美雜交蓮或秋荷在遺傳組分存在差異，研究結(jié)果可為后續(xù)的優(yōu)良品種選育及選配適合的雜交組合提供種質(zhì)資源及技術(shù)支撐。