蕎麥蜜對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和腸道菌群失調(diào)的改善效果

朱靜宇,王峻,金秀娥,陳向丹,劉睿,3,4,魯群,3

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070; 2.湖北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心,武漢 430070; 3.武漢市蜂產(chǎn)品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心,武漢 430070;4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070

飲酒與健康是全世界人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問題，長(zhǎng)期或過量的飲酒對(duì)身體是有害的。肝臟是酒精代謝的主要場(chǎng)所，長(zhǎng)期或過量飲酒容易引起酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)，其發(fā)展進(jìn)程依次為：酒精性脂肪肝(脂肪變性)、脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌[1]。90%～ 95%大量飲酒的人會(huì)發(fā)生脂肪變性，10%～ 40%最終會(huì)發(fā)展為肝纖維化[2]。最近研究表明“腸-肝”軸參與了ALD的發(fā)展，酒精濫用會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，腸道通透性升高，細(xì)菌及其產(chǎn)物進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)和肝，引起肝細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致酒精性肝病[3-4]。因此，通過膳食或者藥物調(diào)節(jié)腸道菌群可能減緩ALD的發(fā)展。

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)，具有多種生物活性[5]，是我國(guó)藥食同源目錄中的物質(zhì)。已有文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道部分蜂蜜可以改善酒精引起的肝損傷，但少見關(guān)于蜂蜜干預(yù)酒精誘導(dǎo)的腸道微生物失衡延緩ALD的研究報(bào)道。蕎麥蜜，蜜源植物為蕎麥，主要產(chǎn)自我國(guó)東北三省和內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅等地，是一種深琥珀色、具有強(qiáng)烈刺激性氣味的蜂蜜。與其他品種蜂蜜相比，蕎麥蜜具有較高含量的酚類化合物、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和維生素，從而具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗氧化、抗菌等生物活性[8-9]。但由于蕎麥蜜自身的刺激性氣味和色澤，導(dǎo)致其食用和藥用價(jià)值未被合理開發(fā)利用[10]。因此，本研究通過建立小鼠酒精性肝損傷模型，探討蕎麥蜜對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用以及對(duì)酒精引起的腸道菌群失衡的調(diào)節(jié)作用，以期進(jìn)一步挖掘蕎麥蜜護(hù)肝功能特性，提高蕎麥蜜的接受度和商業(yè)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

蕎麥蜜，產(chǎn)地為阿爾泰，由武漢樂神三寶蜂業(yè)有限公司提供；Lieber-Decarli酒精液體鼠糧和Lieber-Decarli對(duì)照液體鼠糧購(gòu)買于戴茨生物科技(無錫)有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所；總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(TG)試劑盒，浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司；肝臟病理學(xué)切片，武漢市皮諾飛生物科技有限公司；其他試劑均為分析純或色譜純。

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(18±2) g，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012。

1.2 儀器與設(shè)備

HI96785蜂蜜色度測(cè)定儀，哈納水環(huán)境工程(上海)有限公司；配有示差折光檢測(cè)器的高效液相色譜儀，島津20AD，日本島津公司；Agilent 7800 ICP-MS，美國(guó)Agilent公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；F6/10手持式高速勻漿機(jī)，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；低溫高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Ependoff公司；倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司。

1.3 蕎麥蜜主要理化性質(zhì)與成分測(cè)定

色度的測(cè)定采用SN/T 0852-2012《中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 進(jìn)出口蜂蜜檢驗(yàn)規(guī)程》 中專用的卜方特比色計(jì)比色法。用蒸餾水進(jìn)行調(diào)零，將不含氣泡的試樣倒入卜方特(Pfund)比色槽內(nèi)，以卜方特比色計(jì)進(jìn)行比色讀取色值后確定色澤，色值單位為mm。

總酚含量的測(cè)定參照Folin-Ciocalteu比色法[11]。

糖含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[8]中的方法，并略有改動(dòng)。采用40%乙腈溶液配制成0.04 g/mL樣品溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)行分析，色譜柱為NH2氨基柱(4.6 mm × 150 mm,5.0 μm)，柱溫35 ℃。流動(dòng)相為乙腈∶水= 8∶2(V/V)，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

礦物質(zhì)元素的測(cè)定參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.268-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測(cè)定》。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

動(dòng)物模型參照Bertola等[12]報(bào)道的小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。雄性SPF級(jí)C57 BL/6小鼠在12 h的光/暗循環(huán)中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在18～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%。將小鼠分為空白對(duì)照組(C)、酒精模型組(M)、蕎麥蜜干預(yù)組(B)，每組10只，用Lieber-Decarli對(duì)照液體鼠糧適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，第6天開始樣品組以10 g/kg的劑量灌胃蕎麥蜜，同時(shí)空白對(duì)照組和酒精模型組給予7.8 g/kg劑量的麥芽糊精灌胃，除空白對(duì)照組用Lieber-Decarli對(duì)照液體鼠糧進(jìn)行喂養(yǎng)外，其他各組小鼠用Lieber-Decarli酒精液體鼠糧進(jìn)行喂養(yǎng)，連續(xù)10 d，并在第15天收集糞便。在第16天，除空白對(duì)照組給予麥芽糊精溶液外，其他組均給予31.5%乙醇按小鼠體質(zhì)量的2%灌胃。9 h后，取血和肝臟。血液于4 ℃、5 000 r/min離心15 min后分離血清，待測(cè)。肝臟取部分加入組織固定液固定用于組織病理學(xué)觀察，其余冰浴制成10%勻漿液，于4 ℃、3 500 r/min離心10 min后分離上清于-80 ℃保存，待測(cè)。

1.5 小鼠體質(zhì)量變化和肝臟指數(shù)測(cè)定

肝臟是酒精代謝的主要場(chǎng)所，過量飲酒會(huì)導(dǎo)致熱量增加、攝食減少、代謝異常等情況，使得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，加劇對(duì)肝臟的損傷，體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的變化在一定程度上可以反映肝臟的損傷程度。建立模型期間，每天記錄小鼠體質(zhì)量，計(jì)算各組小鼠體質(zhì)量的變化量。解剖取出肝臟后，用預(yù)先冷卻的生理鹽水洗去血液，用濾紙吸干并稱質(zhì)量。肝臟指數(shù)按照公式(1)計(jì)算：

肝臟指數(shù)= 肝臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%

(1)

1.6 生化指標(biāo)測(cè)定

ALT升高反映了肝細(xì)胞膜的損傷，AST升高表明肝細(xì)胞損傷到了細(xì)胞器，AST和ALT是反映肝損害和樣品是否有保護(hù)肝損傷效果的最直接和最重要的指標(biāo)。酒精性肝損傷的初期表現(xiàn)為酒精性脂肪肝，而TC和TG是評(píng)估脂肪肝發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和病情分度的重要指標(biāo)，其中TG的關(guān)聯(lián)度更高。活性氧自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激是多種肝損傷發(fā)生的共同病理生理基礎(chǔ)，MDA、SOD指標(biāo)可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激程度。血清AST、ALT活力、肝臟TC、TG含量、血清MDA含量、肝臟SOD活力等指標(biāo)的測(cè)定參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 肝臟組織病理學(xué)觀察

肝臟組織固定后，經(jīng)過梯度乙醇脫水和石蠟包埋后用病理切片機(jī)進(jìn)行切片，將切片再次經(jīng)過梯度乙醇脫水、脫蠟后用蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察切片病理學(xué)形態(tài)。

1.8 小鼠糞便微生物分析

腸道菌群與肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展有著緊密的聯(lián)系。評(píng)估腸道菌群穩(wěn)態(tài)通常分析其物種多樣性和豐富度的變化、物種組成差異等。其中，α多樣性反映了樣本微生物群落的豐富度和多樣性，包括Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、Good’s coverage指數(shù)等。Shannon指數(shù)包含著物種數(shù)和各種間個(gè)體分配的均勻性兩個(gè)部分。樣品多樣性越高，個(gè)體分配越均勻，Shannon指數(shù)值就越大。Simpson指數(shù)是隨機(jī)抽取的2個(gè)個(gè)體屬于不同種的概率。Simpson指數(shù)越高，表明群落多樣性越高。Chao指數(shù)反映群落豐富度，即群落中所含物種種類的多少。Good’s coverage指數(shù)反映測(cè)序深度，指數(shù)越接近于1，說明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。PCA圖可以直觀反映樣本微生物群落差異，樣本組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。取小鼠糞便，提取其中的DNA，并對(duì)16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，送往上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果優(yōu)化處理后進(jìn)行OUT聚類，對(duì)物種進(jìn)行注解，然后進(jìn)行α多樣性分析、物種組成分析等。

1.9 數(shù)據(jù)分析

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan’s多重比較法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥蜜的主要理化性質(zhì)與成分

蜂蜜的抗氧化活性與其組成成分相關(guān)，尤其是酚類化合物、礦物質(zhì)等，因此對(duì)蕎麥蜜中的主要相關(guān)成分進(jìn)行了測(cè)定。蕎麥蜜的色度值為150 mm，為深色蜜。果糖和葡萄糖的含量為43.03和35.19 g/100 g，二者總和超過60 g/100 g，蔗糖未檢測(cè)出，符合GB 14963-2011對(duì)蜂蜜糖含量的規(guī)定。重要的是蕎麥蜜的總酚含量高達(dá)(145.81±3.93) mg/100 g，明顯高于其他品種的蜂蜜[13]。而且蕎麥蜜中礦物質(zhì)元素種類豐富，鉀是主要的礦物質(zhì)元素(221.22 mg/kg)，其次是鈣、鎂、錳、鐵、鈉、鋁、銅、鋅等(分別為27.94、11.87、5.48、4.84、3.27、2.11、0.56、0.46 mg/kg)，這些礦物質(zhì)均可以影響蜂蜜的價(jià)值。此外，蜂蜜中的鉛、鎘、汞等重金屬含量符合GB 2762-2017中規(guī)定的限量值。

2.2 蕎麥蜜對(duì)酒精引起的肝損傷小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的變化結(jié)果見圖1。如圖1A所示，與空白對(duì)照組相比，酒精的攝入使小鼠體質(zhì)量顯著減輕(P<0.05)；而相對(duì)于酒精模型組，蕎麥蜜的攝入明顯減緩了小鼠體質(zhì)量的下降(P=0.075)，說明蕎麥蜜可以減緩飲酒導(dǎo)致的體質(zhì)量降低。由圖1B可知,與空白對(duì)照組相比，酒精模型組的肝臟指數(shù)明顯升高(P<0.05)；而蕎麥蜜干預(yù)組的肝臟指數(shù)與酒精模型組相比出現(xiàn)一定程度的降低(P=0.087)。

2.3 蕎麥蜜對(duì)酒精引起的肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響

小鼠血清中ALT和AST活力測(cè)定結(jié)果如圖2所示。酒精模型組的ALT和AST活性明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，說明肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷；但是給予蕎麥蜜干預(yù)后，與酒精模型組相比，樣品干預(yù)組的ALT和AST顯著降低(P<0.05)，尤其是血清中AST活性幾乎恢復(fù)到空白對(duì)照組水平(P>0.05)。說明蕎麥蜜對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠肝臟細(xì)胞膜和肝內(nèi)細(xì)胞器的損傷具有較好的修復(fù)效果，肝臟功能明顯改善。

C.空白對(duì)照組；M.酒精模型組；B.蕎麥蜜干預(yù)組。下同。*表示與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)。C.Control group; M.Model group; B.Buckwheat honey group. The same as below. *indicates significant difference compared with the control group(P<0.05 ).

*表示與空白對(duì)照組相比，在α=0.05水平上有顯著性差異；#表示與酒精模型組相比，在α=0.05水平上有顯著性差異；下同。* indicates significant difference compared with the control group(P<0.05). “#” indicates significant difference compared with alcohol model group(P<0.05).The same as below.

2.4 蕎麥蜜對(duì)酒精引起的肝損傷小鼠肝臟TC和TG的影響

對(duì)肝臟中的TC和TG含量進(jìn)行測(cè)定。由圖3可知，持續(xù)的酒精飼喂導(dǎo)致小鼠肝臟中TC和TG水平顯著升高(P<0.05)，誘導(dǎo)脂肪肝的形成。通過攝入蕎麥蜜進(jìn)行干預(yù)，略降低了小鼠肝臟中TG含量(P>0.05)，但對(duì)TC改善效果不明顯。

2.5 蕎麥蜜對(duì)酒精引起的肝損傷小鼠MDA和SOD的影響

MDA、SOD反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激程度，結(jié)果如圖4所示。與空白對(duì)照組相比，酒精模型組的MDA值顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)，說明酒精的攝入使肝臟的氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化能力降低。蕎麥蜜的攝入能顯著降低MDA含量(P<0.05)，且與空白對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)，同時(shí)提高了SOD活性(P=0.098)。該結(jié)果表明蕎麥蜜能抑制酒精引起的小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化損傷程度，提高小鼠機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力。

圖3 蕎麥蜜對(duì)小鼠肝臟TC(A)和TG(B)的影響Fig.3 Effects of buckwheat honey on liver TC(A) and TG(B) of mice

圖4 蕎麥蜜對(duì)小鼠MDA(A)和SOD(B)的影響Fig.4 Effects of buckwheat honey on MDA(A) and SOD(B) of mice

2.6 肝臟病理學(xué)切片結(jié)果

各處理組肝臟病理學(xué)切片結(jié)果見圖5，直觀反映了各組小鼠肝臟損傷的情況?？瞻讓?duì)照組(C)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，胞漿內(nèi)無脂滴分布，無氣球樣變性和炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象，肝組織無異常改變。在酒精模型組(M)很明顯可以看出，胞漿內(nèi)有大量脂滴分布，結(jié)構(gòu)紊亂，表明酒精模型組肝臟脂肪變性嚴(yán)重。在使用蕎麥蜜干預(yù)(B)后，可以觀察到胞漿內(nèi)脂滴明顯減少，肝細(xì)胞較完整且肝細(xì)胞排列趨于正常，肝臟脂肪變性明顯減輕，這表明蕎麥蜜對(duì)酒精引起的肝臟脂肪變性有明顯的改善作用，肝臟受到很好的保護(hù)。

圖5 小鼠肝臟組織病理學(xué)變化Fig.5 Histopathological changes of mice liver

2.7 小鼠腸道菌群的α多樣性分析

如圖6所示，各組的測(cè)序深度均接近于1，且無顯著性差異(P>0.05)。與空白對(duì)照組相比，酒精模型組的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)均下降，Chao指數(shù)升高但無顯著性差異。而蕎麥蜜的攝入使Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)均有所提升。

圖6 α多樣性分析Fig.6 α diversity analysis

2.8 小鼠腸道菌群群落組成

如圖7所示，3組樣本聚為3類，空白對(duì)照組與酒精模型組完全分開，而同樣給予酒精的樣品干預(yù)組也與空白對(duì)照組分開，與酒精模型組也幾乎分開，說明了空白對(duì)照組與酒精模型組和樣品干預(yù)組的腸道菌群組成存在差異，而且酒精模型組與樣品干預(yù)組的腸道菌群組成也存在差異。因此，酒精和蕎麥蜜的攝入使小鼠腸道菌群的組成發(fā)生了改變。

腸道菌群的各菌種間形成一種互相制約、互相依存的平衡關(guān)系，多種因素可導(dǎo)致其失調(diào)。通過對(duì)小鼠糞便腸道菌群進(jìn)行不同水平上的物種組成分析，比較不同組之間的物種組成差異，門水平結(jié)果如圖8和9所示。由圖8可知，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在門水平上主導(dǎo)腸道菌群的組成，占比90%左右，其次還包括Proteobacteria、Epsilonbacteraeota、Deferribacteres、Actinobacteria、Fusobacteria、Tenericutes、Spirochaetes等。由圖9A～D可知：與空白對(duì)照組相比，酒精的攝入使厚壁菌門相對(duì)豐度增加了24.56%，擬桿菌門相對(duì)豐度下降了4.4%，Proteobacteria相對(duì)豐度下降了21.6%，厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)的比例升高了30.30%；而蕎麥蜜的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，與酒精模型組相比，蕎麥蜜干預(yù)組厚壁菌門降低15.59%，擬桿菌門升高7.18%，二者的比值下降21.25%，并基本恢復(fù)到與空白對(duì)照組一致的水平。

圖7 PCA分析圖Fig.7 PCA analysis diagram

圖8 門水平腸道菌群物種分析Fig.8 Species analysis of gut microbiotaat phylum level

圖9 擬桿菌門(A)、厚壁菌門(B)、變形菌門(C)的相對(duì)豐度以及厚壁菌門/擬桿菌門比值(D)Fig.9 Relative abundance of Bacteroidetes(A),Firmicutes(B),Proteobacteria(C) and F/B(D)

為進(jìn)一步說明蕎麥蜜的攝入是否對(duì)酒精引起的腸道菌群變化有改善作用，對(duì)屬水平相對(duì)豐度排前36的菌屬進(jìn)行了差異分析(圖10)。由圖10可知，各組間微生物相對(duì)豐度存在差異。圖11A～C中，各組中Ruminococcaceae_UCG-013、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Helicobacter、Alistipes、Parasutterella、Faecalibaculum、Lachnoclostridium等菌屬基本無變化；與空白對(duì)照組相比，酒精的攝入使uncultured_bacterium、Bacteroides、Alloprevotella、Mucispirillum、Dubosiella、Ambiguous_taxa、Ruminiclostridium、Rikenellaceae_RC9_gut_group、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Coriobacteriaceae_UCG-002、Muribaculum、Pseudomonas等菌屬豐度減少，而Parabacteroides、Blautia、Butyricimonas、Intestinimonas、Lachnoclostridium、Ruminococcaceae_UCG-003、Harryflintia、Roseburia、Escherichia-Shigella、Romboutsia、Oscillibacter、Anaerotruncus、Prevotella_9、Ruminiclostridium_9、Tyzzerella、Desulfovibrio等菌屬豐度增加。在給予蕎麥蜜進(jìn)行干預(yù)后，uncultured_bacterium、Bacteroides、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Alloprevotella、Muribaculum、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group等菌屬豐度升高，同時(shí)Parabacteroides、Intestinimonas、Lachnoclostridium、Harryflintia、Roseburia、Romboutsia、Oscillibacter、Anaerotruncus、Prevotella_9、Tyzzerella等菌屬豐度降低。

圖10 屬水平物種分析圖Fig.10 Species analysis of gut microbiota at genus level

3 討 論

3.1 蕎麥蜜對(duì)酒精引起的小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)和組織病理學(xué)的影響

脂肪變性、體質(zhì)量減輕是酒精性肝損傷發(fā)生的癥狀，在酒精肝損傷早期往往伴隨著肝臟的腫大，從而使肝臟指數(shù)升高[14]。本研究所用動(dòng)物模型是長(zhǎng)期適量酒精誘導(dǎo)加單次過量酒精飼喂協(xié)同誘導(dǎo)肝損傷，結(jié)果表明，酒精的攝入使小鼠的體質(zhì)量顯著下降，肝臟指數(shù)升高，導(dǎo)致肝臟發(fā)生損傷，肝組織病理學(xué)特征異常改變，發(fā)生嚴(yán)重的脂肪變性，預(yù)示著實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒?。由于液體飼料中添加了酒精，造模前期小鼠不適應(yīng)導(dǎo)致食欲減退，進(jìn)食量變少，后期酒精的毒性會(huì)使胃腸道消化及吸收發(fā)生障礙，從而使小鼠體質(zhì)量下降。而蕎麥蜜的干預(yù)使這一結(jié)果得到改善，說明蕎麥蜜可以在一定程度上減輕飲酒所致的肝臟損傷。

3.2 蕎麥蜜對(duì)酒精引起的肝臟損傷小鼠ALT、AST、TC、TG、MDA和SOD的影響

血清中ALT和AST的升高是酒精性肝損傷的重要標(biāo)志[14]。正常情況下，ALT和AST是存在于肝細(xì)胞內(nèi)的指示肝功能的重要酶，當(dāng)肝臟受損時(shí)，血清中的ALT和AST活性會(huì)升高。飲酒會(huì)導(dǎo)致脂代謝紊亂，肝臟脂質(zhì)積累[15]。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致酒精性肝損傷發(fā)生的主要機(jī)制之一。MDA是脂質(zhì)過氧化代謝的產(chǎn)物，常用于反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度；肝臟SOD活性的高低能夠反映肝臟清除氧自由基的能力，進(jìn)而反映肝臟抗氧化能力[16]。本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，酒精模型組小鼠血清ALT和AST活性顯著升高，肝臟脂質(zhì)過氧化物含量升高，抗氧化能力降低，肝臟的氧化應(yīng)激水平升高；與酒精模型組相比，蕎麥蜜的干預(yù)使血清中的轉(zhuǎn)氨酶活性、MDA含量顯著降低，SOD活性有所提高，這一結(jié)果與Cheng等[6]以及黃穎等[7]的結(jié)果相似。蕎麥蜜中酚類化合物含量很高，而酚類化合物又是公認(rèn)的抗氧化劑，表明蕎麥蜜具有良好的抗氧化活性，可以抑制酒精引起的小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化物損傷程度和提高小鼠機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力。

3.3 蕎麥蜜對(duì)酒精引起的小鼠腸道菌群的影響

腸道菌群的組成和多樣性在體內(nèi)平衡中扮演著重要角色。多種因素如飲食、疾病、生活方式或抗生素的使用等都可能導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)和多樣性的改變[17]。本研究中，酒精的攝入降低了腸道菌群群落的α多樣性，此結(jié)果與Fan等[18]的研究結(jié)果相似。而飼喂蕎麥蜜可以改善酒精引起的小鼠腸道菌群的多樣性和豐富度的變化，改善小鼠腸道的內(nèi)部環(huán)境。厚壁菌門和擬桿菌門是腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌門[19]，酒精及其代謝產(chǎn)物的毒性會(huì)使腸道菌群失調(diào)。研究表明，飲酒人群中擬桿菌門的相對(duì)含量低于健康人群[20]。在ALD小鼠模型中，腸道菌群的變化與腸道擬桿菌門水平的降低和厚壁菌門水平的升高有關(guān)[20]。本研究結(jié)果表明，酒精的攝入確實(shí)改變了腸道菌群的組成，給予酒精后的小鼠腸道中腸道菌群在門水平上主要引起了Bacteroidetes、Firmicutes等菌門的變化；在屬水平上，酒精使多種菌屬發(fā)生了改變，其中相對(duì)豐度較高的Parabacteroides菌屬發(fā)生顯著性升高，Alloprevotella相對(duì)豐度降低。而在給予蕎麥蜜干預(yù)后，小鼠腸道菌群發(fā)生變化，厚壁菌門相對(duì)豐度降低、擬桿菌門相對(duì)豐度增加，屬水平上16種菌屬的相對(duì)豐度發(fā)生改變,其中Parabacteroides菌屬發(fā)生顯著下降，Alloprevotella相對(duì)豐度上升。Alloprevotella可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，有助于腸道緊密連接蛋白的保持，有助于腸黏液的產(chǎn)生來改善腸道屏障，減少有害物質(zhì)易位[21]。這表明蕎麥蜜可以改善酒精引起的小鼠腸道菌群的失調(diào)。此外，過量的酒精攝入造成的腸道菌群失調(diào)會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致微生態(tài)失衡，進(jìn)而引起腸道屏障功能發(fā)生改變，緊密連接蛋白被破壞，腸道通透性增加，細(xì)菌易位，大量的有害物質(zhì)通過“腸-肝”軸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)和肝臟刺激促炎介質(zhì)的釋放，如活性氧、白三烯、趨化因子和細(xì)胞因子，引發(fā)炎癥造成肝臟和其他器官的炎癥浸潤(rùn)和纖維化[22-23]。

蕎麥蜜作為深色蜜，含有豐富的果糖、酚類物質(zhì)和礦物質(zhì)，這些成分與體內(nèi)的抗氧化反應(yīng)的發(fā)揮以及腸道菌群的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[24]。本研究中，酒精性肝損傷小鼠給予蕎麥蜜干預(yù)可以改善肝臟病理切片中脂滴現(xiàn)象，提高了機(jī)體的抗氧化水平，對(duì)酒精引起的肝損傷有一定的保護(hù)作用。更重要的是，蕎麥蜜的干預(yù)對(duì)酒精引起的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)異常變化起到改善作用，提高了腸道菌群的豐富度和多樣性。預(yù)示蕎麥蜜具有開發(fā)為護(hù)肝功能性食品的潛力。此外，本研究腸道菌群分析結(jié)果還可通過相關(guān)基因和相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)進(jìn)一步探討蕎麥蜜改善腸道健康的作用機(jī)制。