豬流行性腹瀉病毒S蛋白納米抗體的篩選與鑒定

王天宇，李志偉，楊 婷，董林芳，馬志倩，邊巴次仁，肖書奇，李 爽*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.西藏阿里地區(qū)中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，阿里 859000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是一種接觸傳染性腸道病毒病，以仔豬的水樣腹瀉、高死亡率和發(fā)病率為特征[1-2]。PED的病原豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一種單股正鏈RNA病毒，基因組大小約28 kb，編碼16個非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein, nsp)，4個結(jié)構(gòu)蛋白(S、E、M和N)和1個輔助蛋白ORF3[3]。在結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白根據(jù)功能劃分為S1和S2，S1結(jié)構(gòu)域有助于受體識別、引發(fā)腸致病性和免疫原性，因?yàn)樗@性中和表位。S2結(jié)構(gòu)域錨定在病毒膜上，觸發(fā)膜融合[4]。S1蛋白中的中和表位分別為COE(499—638 aa)、SS2(748—755 aa)和SS6(764—771 aa)，(1 368—1 374 aa)位于S2結(jié)構(gòu)域中[5-7]。除此之外，S1蛋白的N端(34—230 aa)含有比較重要的抗原表位，可以誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)，負(fù)責(zé)與細(xì)胞表面唾液酸受體結(jié)合[8]。此外，S蛋白是PEDV的一個主要的毒力基因[9-10]，也是分析PEDV遺傳變異和分子流行病學(xué)的重要靶標(biāo)[11]，這使得S蛋白成為研發(fā)疫苗和診斷試劑的候選者。

20世紀(jì)90年代，一群比利時學(xué)生嘗試純化單峰駱駝血清中的蛋白，無意中發(fā)現(xiàn)了除傳統(tǒng)抗體之外，還有一種缺少輕鏈，僅由重鏈組成的抗體，這種抗體后來被稱為重鏈抗體[12]。隨后，在羊駝和鯊魚等動物外周血中也發(fā)現(xiàn)了這種特殊抗體的存在。其重鏈可變區(qū)組成的單域抗體稱為VHH(variable domains of Camellidae heavy chain-only antibodies，VHH)。VHH的形狀為扁長型，類似于橄欖球狀，相對分子質(zhì)量約為15 ku，直徑約為2.5 nm，高約4 nm，VHH是已知最小的具有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體，因此被稱為納米抗體(nanobody，Nb)[13]。與常規(guī)抗體相比，Nb穩(wěn)定性高，可溶性好、親和力強(qiáng)、免疫原性小及易在大腸桿菌中表達(dá)和純化，且具有高表達(dá)產(chǎn)量等特點(diǎn)[14-15]。因此，這使得Nb被應(yīng)用到許多醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、診斷和治療中[16-17]。

目前，還沒有報道針對PEDV S蛋白納米抗體用于PED的治療和診斷中，本研究擬通過噬菌體展示技術(shù)篩選出PEDV S1蛋白的特異性納米抗體，為PED的治療、診斷及研究PEDV的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coliTrans5α和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；pCANTAB 5E噬菌體載體購自美國GE公司；HRP-Goat@Mouse IgG抗體和Anti-His Mouse mAb均購自于Jackson immuoresearch公司。Ficoll-Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液購自Greiner bio-one公司；輔助噬菌體M13K07和限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit和Prime STAR HS DNA polymerase購自日本TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組S1蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用RNAiso Plus從PEDV(GenBank序列號: No MT787025)陽性的組織病料中提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA, 用表1引物以cDNA為模板擴(kuò)增S1基因(66—1 515 bp)，通過BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn)克隆到pET32a載體中，得到質(zhì)粒pET32a-S1,測序正確后,用于后續(xù)試驗(yàn)。使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit進(jìn)行 pET32a-S1的質(zhì)粒提取，檢測質(zhì)粒濃度，置于-20 ℃保存。

表1 構(gòu)建重組S1蛋白原核表達(dá)載體的引物序列

1.2.2 重組S1蛋白的表達(dá)與純化 將pET32a-S1質(zhì)粒陽轉(zhuǎn)到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆到LB培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫?fù)u床中220 r·min-1震蕩培養(yǎng)過夜，按照1∶100的比例接種于大的搖瓶中，培養(yǎng)至對數(shù)期，加入IPTG貯存液(1 mol·L-1)至終濃度為1 mmol·L-1，誘導(dǎo)5 h后收菌，SDS-PAGE鑒定蛋白是否表達(dá)。對誘導(dǎo)后的菌體138 kW超聲3 s，暫停3 s，共超聲40 min，收集上清和沉淀進(jìn)行蛋白可溶性分析。用Ni-NTA純化S1蛋白。

1.2.3 動物免疫 5 mg純化的PEDV S1蛋白同弗氏完全佐劑和不完全佐劑乳化后免疫阿拉善雙峰駝。免疫間隔為2周，4次后，采用間接ELISA測定駱駝血清中特異性PEDV S1抗體滴度，隨后采集駱駝外周抗凝血，并分離淋巴細(xì)胞。間接ELISA的具體操作步驟：使用PBS作為包被緩沖液，將截短PEDV S蛋白稀釋至10 μg·mL-1，100 μL·孔-1，加入酶標(biāo)板，4 ℃條件包被過夜；次日，用PBS’T洗板 4次，200 μL·孔-1加入2.5%脫脂奶粉，37 ℃恒溫孵育1 h；棄去封閉液，用PBS’T洗板4次，對駱駝血清樣品使用封閉液進(jìn)行倍比稀釋，各稀釋比例100 μL·孔-1，置于37 ℃恒溫孵育1 h；棄去倍比稀釋的駱駝血清樣品，PBS’T洗板4次，使用封閉液1∶2 000 稀釋Rabbit @ Camel IgG多克隆抗體，100 μL·孔-1，37 ℃恒溫孵育1 h；棄去抗血清，PBS’T洗板4次，100 μL·孔-1加入稀釋至工作濃度的Goat @ Mouse IgG HRP標(biāo)記抗體，37 ℃恒溫孵育1 h。棄去酶標(biāo)二抗，用PBS’T洗板4次，100 μL·孔-1加入TMB顯色底物，37 ℃避光恒溫孵育15 min；50 μL·孔-1加入3 mol·L-1H2SO4，使用分光光度計(jì)測量OD450 nm。

1.2.4 噬菌體展示文庫的構(gòu)建 提取外周血淋巴細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA.采用巢式PCR擴(kuò)增VHH基因，用表2中CALL-1和CALL-2引物擴(kuò)增出大小約700 bp的片段; 隨后，用表2中VHH-F和VHH-R進(jìn)行第二輪的擴(kuò)增，大小約400 bp, 對第二輪的產(chǎn)物回收,對回收產(chǎn)物和pCANTAB 5E載體同時進(jìn)行雙酶切，酶切位點(diǎn)為PstⅠ和NotⅠ；隨后將載體與目的片段連接并電轉(zhuǎn)入E.coliTG1感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞在37 ℃ 120 r·min-1恒溫培養(yǎng)40～60 min。吸取200 μL培養(yǎng)物用于所構(gòu)建文庫質(zhì)量的鑒定，將剩余培養(yǎng)物1.5 mL·板-1均勻涂布至 LB/AMP-GLU方形培養(yǎng)皿，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)6～8 h。刮下培養(yǎng)皿內(nèi)菌落到2～3 mL LB/AMP-GLU培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 VHH片段PCR擴(kuò)增引物

1.2.5 文庫容量和多樣性測定 將上述步驟中取出的200 μL培養(yǎng)物10倍梯度稀釋，并涂布到AMP-GLU LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)量。挑取96個單菌落并菌液PCR鑒定陽性率，對陽性克隆測序；使用MegAlign軟件對VHH序列進(jìn)行比對，分析文庫的序列多樣性。

1.2.6 VHH噬菌體抗體展示文庫的救援 取“1.2.4”步驟中構(gòu)建的VHH噬菌體抗體展示文庫，加入100 mL 2×YT/AMP-GLU培養(yǎng)基，37 ℃劇烈震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。加入20 MOI輔助噬菌體M13KO7，37 ℃ 200 r·min-1震蕩培養(yǎng)1～2 h，收集菌體沉淀。沉淀重懸后繼續(xù)震蕩培養(yǎng)12 h。離心，收集上清，加入1/5體積預(yù)冷的PEG/NaCl溶液，冰中孵育10～12 h。離心后用PBS重懸后即為重組噬菌體。

1.2.7 PEDV S1特異性重組噬菌體的淘選 用PEDV S1蛋白包板，100 ng·孔-1，同時設(shè)置對照孔，4 ℃包被過夜。棄包被液，2.5%脫脂奶粉封閉，37 ℃孵育1 h；1012pfu·mL-1加入步驟“1.2.6”救援的重組噬菌體，37 ℃孵育1 h。棄噬菌體溶液，洗板后加入0.1 mol·L-1的三乙胺，室溫靜置10 min，收集洗脫液，立即加入相同體積的1 mol·L-1Tris-HCl(pH7.4)，隨后對所洗脫的重組噬菌體進(jìn)行滴度的測定。取20 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的TG1，加入洗脫的噬菌體溶液，37 ℃靜置侵染60 min后加入80 mL 2×YT/AMP-GLU培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r·min-1，震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，按照上述步驟加入20 MOI輔助噬菌體進(jìn)行救援后進(jìn)行二輪淘選；按照上述步驟，對重組噬菌體總共進(jìn)行3輪固相淘選。

1.2.8 PEDV S1特異性重組噬菌體富集 以PEDV S1包板過夜。封閉后將重組噬菌體溶液使用封閉液按1∶10稀釋，37 ℃孵育1 h；棄去噬菌體溶液，PBS’T洗板 4次，加入 HRP標(biāo)記Mouse @ M13噬菌體抗體，37 ℃孵育1 h。棄去抗體，PBS’T洗滌4次，加入TMB顯色底物，37 ℃孵育15 min。50 μL·孔-1加入3 mol·L-1H2SO4終止顯色，測量OD450 nm。

1.2.9 重組納米抗體的表達(dá) 取第3輪淘選后的重組噬菌體溶液，重組噬菌體溶液十倍梯度稀釋后，加到對數(shù)期的TG1，37 ℃感染60 min，涂布于LB/AMP-GLU，過夜培養(yǎng)；挑取單菌落到LB/AMP-GLU中，培養(yǎng)過夜；從各菌落培養(yǎng)物中取出50 μL分別轉(zhuǎn)接于2 mL TB培養(yǎng)基中，對應(yīng)編號置于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至對數(shù)期；加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG，過夜誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.10 重組納米抗體粗提物的制備 收集步驟“1.2.9”中的24孔板中培養(yǎng)液于1.5 mL EP管中，離心收集菌體沉淀，加入PBS重懸菌體并-20 ℃凍融。離心后，上清即為納米抗體粗提物。

1.2.11 重組納米抗體粗提物的檢測 將經(jīng)過純化的截短PEDV S1重組蛋白用PBS緩沖液稀釋至100 μg·mL-1，100 μL·孔-1，4 ℃包被過夜，同時設(shè)置相同數(shù)量的對照孔，包被等量的PEDV N重組蛋白；進(jìn)行封閉后，用PBS’T洗滌4次，加入使用封閉液按1∶1稀釋的納米抗體粗提物，100 μL·孔-1，37 ℃ 恒溫孵育1 h；棄去粗提物溶液，用PBS’T洗板4次，加入使用封閉液按1∶2 000稀釋至工作濃度的Anti-E-tag標(biāo)簽抗體，100 μL·孔-1，37 ℃恒溫孵育1 h；棄掉Anti-E-tag標(biāo)簽抗體，用PBS’T洗滌4次，100 μL·孔-1加入使用封閉液稀釋至工作濃度的HRP標(biāo)記Goat@Rabbit IgG抗體，37 ℃ 恒溫孵育1 h；隨后進(jìn)行顯色，進(jìn)行使用分光光度計(jì)測量OD450 nm。

1.2.12 PEDV S1特異性納米抗體的序列分析 將上述ELISA鑒定為陽性的克隆測序。用MegAlign軟件比對測序結(jié)果，并根據(jù)納米抗體高變區(qū)分類。

1.2.13 PEDV S1蛋白納米抗體的特異性和結(jié)合力測定 使用同期對駱駝免疫的2種蛋白，豬圓環(huán)病毒Cap蛋白和豬偽狂犬病病毒gE蛋白作為對照。將截短PEDV S蛋白、豬圓環(huán)病毒Cap蛋白和豬偽狂犬病病毒gE蛋白包被于同一個ELISA酶標(biāo)板，利用“1.2.11”步驟檢測所篩選PEDV S蛋白納米抗體的特異性。對不同的納米抗體粗提物10倍倍比稀釋，用同樣的方法測定納米抗體的結(jié)合力。

1.2.14 納米抗體活性的鑒定 將生長狀態(tài)良好的Vero 細(xì)胞以一定密度鋪入含有24孔爬片細(xì)胞板中和正常的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后接入0.1 MO1 PEDV；接毒后24 h，一方面進(jìn)行間接免疫熒光檢測；每孔加入200 μL 4%多聚甲醛，置于37 ℃恒溫箱中固定15 min；棄掉固定液后，每孔加入200 μL 0.25% triton X-100,15 min后取出。用1×PBS(K+)洗滌3次，加入1%BSA封閉30 min；加入原核表達(dá)的納米抗體Nb3，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入His抗體，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入熒光二抗，孵育1 h；洗滌后加入DAPI，染色10 min，使用細(xì)胞成像Leica microscope進(jìn)行拍照。另一方面進(jìn)行Western blot: 收集12細(xì)胞培養(yǎng)板中正常Vero細(xì)胞和PEDV感染的Vero細(xì)胞。利用NP40裂解細(xì)胞，取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE；隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，用Nb3室溫孵育1 h，PBS’T洗滌4次后，加入His 抗體室溫孵育1 h，PBS’T洗滌4次后，用HRP標(biāo)記的Goat anti-Mouse IgG(H+L)二抗進(jìn)行室溫孵育1 h，PBS’T洗滌4次后，將PVDF膜置于ECL發(fā)光液中后，放入化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)進(jìn)行成像。

2 結(jié) 果

2.1 pET32a-PEDV-S1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

提取PEDV陽性組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物位于1 000～2 000 bp，與預(yù)期目的片段大小(1 452 bp)相符(圖1A)，目的條帶回收后與載體pET-32a同時雙酶切(圖1B)，連接轉(zhuǎn)化，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖1C, 將陽性克隆送公司測序，綜上結(jié)果表明，成功構(gòu)建pET32a-PEDV-S1原核表達(dá)載體。

A.PEDV S1基因的擴(kuò)增；B.目的片段和載體的雙酶切；C.菌液PCR鑒定

2.2 PEDV S1蛋白的表達(dá)與純化

將測序正確的pET32a-PEDV-S1質(zhì)粒轉(zhuǎn)到E.coliBL21(DE3)中，以1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE檢測，在大約70 ku處可見與預(yù)期結(jié)果一致的條帶，而空載誘導(dǎo)后，未出現(xiàn)此條帶(圖2A)，且S1 重組蛋白以包涵體的形式存在(圖2B)。用Ni-NTA純化后，得到純度較好S1重組蛋白(圖2C)。

A.PEDV S1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-32a空載體未誘導(dǎo)菌體；2.pET-32a空載體誘導(dǎo)菌體；3.pET-32a-S1表達(dá)載體未誘導(dǎo)菌體；4.pET-32a-S1表達(dá)載體誘導(dǎo)菌體)；B.PEDV S1重組蛋白的可溶性鑒定(M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.菌體裂解后上清；2.菌體裂解后沉淀)；C.PEDV S1重組蛋白的純化

2.3 雙峰駝免疫

用純化后的截短PEDV S重組蛋白免疫阿拉善雙駝峰，在最后一次免疫后第4天，用間接ELISA檢測S蛋白抗體效價，結(jié)果顯示，雙駝峰血清中PEDV S抗體效價高達(dá)1∶256 000(圖3)。

圖3 ELISA檢測駱駝血清中PEDV S1特異性抗體效價

2.4 VHH噬菌體展示文庫的構(gòu)建

采集200 mL駱駝外周抗凝血，分離外周血淋巴細(xì)胞。提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過巢式PCR擴(kuò)增VHH片段，第一輪回收700 bp左右目的條帶(圖4A)，第二輪PCR回收 400 bp左右條帶(圖4B)。將VHH片段構(gòu)建至pCANTAB 5E載體中，電轉(zhuǎn)化至TG1感受態(tài)得到噬菌體展示文庫，該文庫庫容約為2.1×107，陽性率約為85%(圖4C)。

A和B.擴(kuò)增VHH基因；C.VHH文庫的陽性率鑒定

2.5 PEDV S1蛋白特異性納米抗體的篩選

對噬菌體展示文庫進(jìn)行救援后，經(jīng)過3輪淘選后，富集率可以達(dá)到1 673(圖5A)。將第3輪淘選后的重組噬菌體侵染對數(shù)期 TGI細(xì)胞，涂布至 LB/AMP-GLU平板，挑取96個單菌落，共挑取2輪，進(jìn)行粗提，通過ELISA鑒定粗提物與PEDV S蛋白的反應(yīng)性，結(jié)果如5B，隨機(jī)選取的96個單克隆中有23個為陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序分析，鑒定出了6個序列不同的納米抗體，并依次命名為Nb1～Nb6(圖5C)。

A.特異性噬菌體富集結(jié)果；B.間接ELISA篩選PEDV S1蛋白特異性納米抗體；C.PEDV S1蛋白特異性納米抗體的氨基酸序列比對

2.6 PEDV S蛋白納米抗體特異性及結(jié)合力的測定

以豬圓環(huán)病毒Cap重組蛋白和豬偽狂犬病病毒gE重組蛋白作為對照，檢測篩選出的6株納米抗體的特異性。結(jié)果顯示，6株納米抗體均不存在交叉反應(yīng)(圖6A)。與此同時，通過ELISA進(jìn)一步確定了6株納米抗體對PEDV S重組蛋白的結(jié)合能力，結(jié)果顯示，Nb3具有最高的結(jié)合能力(圖6B)

圖6 PEDV S蛋白納米抗體的結(jié)合力(A)與特異性(B)的分析

2.7 Nb3與PEDV結(jié)合活性鑒定

通過Western blot和IFA驗(yàn)證納米抗體Nb3與PEDV的結(jié)合，用原核表達(dá)的納米抗體Nb3驗(yàn)證其是否能夠結(jié)合感染細(xì)胞中的PEDV，以未接毒細(xì)胞作為對照，結(jié)果如圖7，Nb3同 PEDV具有良好的結(jié)合活性。

A.WB鑒定納米抗體Nb3與PEDV的結(jié)合(1.PEDV 感染Vero細(xì)胞；2.正常Vero細(xì)胞)：B.間接免疫熒光鑒定納米抗體Nb3與PEDV的結(jié)合(標(biāo)尺=200 μm)

3 討 論

2010年10月，PED在中國大面積暴發(fā)，這次疫病的暴發(fā)以7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬極高發(fā)病率和死亡率為主要特征，2周齡以上的豬出現(xiàn)不同程度的腹瀉和厭食等癥狀，并預(yù)示著高毒力PEDV變異毒株的出現(xiàn)[19]，由此可見，PEDV是一種破壞力較大的腸道冠狀病毒[19-21]，目前，尚無針對 PEDV的有效疫苗，因此，治療與診斷對防控PED具有重大意義。

抗體能夠中和病毒，起到一定的治療作用，但同時也具有一定的風(fēng)險，比如產(chǎn)生ADE現(xiàn)象[22]。納米抗體優(yōu)越的生物學(xué)特性能夠克服常規(guī)抗體的不足，很適合疫病的治療[23-24]。Bao等[25]通過利用截短的PEDV S蛋白免疫駱駝后篩選出1株S蛋白特異性的納米抗體S7,但S7對PEDV沒有中和效果。Yang等[15]篩選出靶向PEDV M蛋白的4株特異性的單域抗體，但對PEDV同樣沒有中和活性。雖然沒有中和活性，但這些納米抗體均可被用于PEDV診斷。

納米抗體被廣泛用于病原診斷中[26-29]，比如新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)[17,27]、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus, PPV)[28]、豬流感病毒(swine influenza virus, SIV)[29]和寨卡病毒(Zika virus)[26]。納米抗體也被用于PEDV的診斷中，我們課題組已經(jīng)建立了基于PEDV N蛋白納米抗體的快速檢測PEDV的方法[30]。本研究表達(dá)截短的PEDV S1(22—505 aa)蛋白，該區(qū)域不含有中和表位，但能夠影響病毒的復(fù)制[8]。利用截短的S1蛋白免疫駱駝后構(gòu)建了多樣性良好的VHH噬菌體展示文庫。經(jīng)鑒定，該文庫庫容量為2.1×107，隨機(jī)挑選96個單菌落，陽性率達(dá)到85%, 對其中的陽性單克隆進(jìn)行測序，驗(yàn)證了該文庫具有良好的多樣性。進(jìn)一步對文庫進(jìn)行了救援和3輪特異性淘選富集，并最終篩選出6株氨基酸序列不相同的納米抗體，6株納米抗體與豬圓環(huán)病毒Cap蛋白、豬偽狂犬病病毒gE蛋白均不存在交叉反應(yīng)。隨后，驗(yàn)證結(jié)合力最高的納米抗體Nb3與PEDV具有良好的結(jié)合活性。

4 結(jié) 論

成功表達(dá)并純化PEDV S1蛋白，免疫雙峰駝后，構(gòu)建多樣性良好的噬菌體展示文庫，并利用噬菌體展示技術(shù)成功篩選出6株特異性結(jié)合PEDV S1蛋白的納米抗體。所篩選的特異性納米抗體為PEDV的診斷和納米抗體藥物的研發(fā)提供了參考。