1株林麝源綠膿桿菌的分離鑒定及全基因組序列分析

賀 健，邢小勇，武小椿，溫峰琴，張陽陽，張生英，劉 佳，包世俊

(甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070)

林麝(Moschusberezovskii)又名香獐，其雄麝香腺囊分泌的麝香是中醫(yī)藥的名貴藥材，亦是一種高級香料，具有極高的藥用價值和經濟價值。由于過度獵捕和棲息地的破壞，野生林麝種群數(shù)量急劇減少，因而我國將其列為國家一級重點保護動物，《國際瀕危動植物貿易公約》(CITES)亦將其列為極危級保護動物[1-2]。為有效保護林麝資源，我國從1958年即開始林麝的人工馴養(yǎng)，但隨著生活方式的改變和飼養(yǎng)種群的擴大，麝群中傳染性疾病亦頻繁發(fā)生，給林麝馴養(yǎng)業(yè)造成了重大損失，也嚴重制約了相關產業(yè)的發(fā)展[3-4]。因此，開展林麝傳染性疾病相關的研究，將為我國林麝馴養(yǎng)業(yè)的健康發(fā)展提供有效保障。

綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)又稱銅綠假單胞菌，是自然界中廣泛存在的一種條件致病菌[5]。當人或動物機體免疫力下降或傷口暴露時，該菌極易感染并導致相應的疾病[6-10]。2019年7月，甘肅省天水市某林麝養(yǎng)殖場出現(xiàn)疫情，數(shù)頭林麝突發(fā)死亡。剖檢病死林麝可見肝、肺等臟器腫大、出血，其中肺出血尤為嚴重，且有大小不等、散在分布的化膿灶。本課題組采集病死林麝肺組織，從中分離到1株綠膿桿菌，并在分離菌株致病性和藥物敏感性分析的基礎上，完成了分離菌全基因組測序、序列的組裝與注釋及毒力基因toxA和exoT的遺傳進化分析，為林麝綠膿桿菌感染相關疾病的防治提供理論依據，也為綠膿桿菌致病機制和耐藥機制的深入研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料為采自甘肅省天水市某林麝養(yǎng)殖場病死林麝的肺組織。

1.2 主要試劑

5%兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基由本實驗室配制；細菌微量生化反應管、藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌全基因組提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；pMD19-T載體、T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產品；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物有限公司；DNA Marker購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

BALB/c小鼠，5周齡，雌雄各20只，購自中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.4 細菌的分離及鏡檢

無菌取相應組織病料劃線接種于5%兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征，挑選可疑菌落涂片染色鏡檢，并轉接種于肉湯培養(yǎng)基中增殖。

1.5 生化試驗

應用生化微量反應管進行分離菌的葡萄糖、麥芽糖等糖發(fā)酵試驗，枸櫞酸鹽利用試驗，VP試驗，MR試驗，硝酸鹽還原試驗，H2S試驗和吲哚試驗，即將分離菌株分別接種于上述生化微量反應管中，置37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，參照產品說明書判定結果。

1.6 16S rRNA序列測定及分析

以提取的分離菌株全基因組為模板，應用16S rRNA基因通用引物對(16S-F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；16S-R：5′-TACGGYTAC CTTGTTACGACTT-3′)，利用PCR擴增分離菌株16S rRNA基因。PCR程序：98 ℃ 預變性5 min；98 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產物與pMD19-T載體連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經PCR鑒定的陽性克隆送北京擎科生物有限公司測序，并將測序結果登陸NCBI，通過BLAST與GenBank中的已知序列進行比對。

1.7 小鼠致病性試驗

將分離菌劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細菌對數(shù)期，并進行菌落計數(shù)。將36只BALB/c小鼠隨機分為6組，每組雌雄各3只，第1組小鼠腹腔的細菌接種量為2.64×108CFU、第2組小鼠接種量為2.64×107CFU、第3組小鼠接種量為2.64×106CFU、第4組小鼠接種量為2.64×105CFU、第5組小鼠接種量為2.64×104CFU，對照組每只小鼠則分別腹腔注射0.2 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。每天觀察小鼠健康狀況，并記錄小鼠發(fā)病情況及死亡數(shù)量，連續(xù)7 d，用改良Karber法計算分離菌的半數(shù)致死量(LD50)。同時，無菌剖檢死亡小鼠并分離鑒定病原菌。

1.8 藥敏試驗

參照葛愛民等[11]所述方法，將分離菌純培養(yǎng)物涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基，5 min后將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h后測量各藥敏片的抑菌圈直徑并判定結果。

1.9 病原菌全基因組測序及序列分析

提取病原菌基因組后送至西安奧納斯特生物科技有限公司進行全基因組測序。應用Unicycler(0.4.8)軟件過濾測序結果并將所得reads進行組裝、連接，進而獲得分離菌的基因組完成圖。利用Prokka、CRISPRfinder、IslandViewer 4等軟件對組裝后的基因組進行功能元件預測分析，并將預測的基因序列與GO、COG、KEGG、CARD、VFDB等功能數(shù)據庫通過BLAST比對，從而得到相應基因功能的注釋。

1.10 毒力基因的遺傳進化分析

在全基因組測序并分析的基礎上，將TS2019的毒力基因toxA和exoT序列分別登錄NCBI，通過BLAST與GenBank中的已知序列比對，選取AE004091.2、LN831024.1、CP065412.1等數(shù)十株相似性高的綠膿桿菌相應基因序列，利用DNAstar軟件構建系統(tǒng)進化樹。

2 結 果

2.1 細菌的分離及鏡檢

用接種針蘸取肺組織病料，劃線接種于5%兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，可見表面光滑、濕潤、邊緣整齊的淡黃綠色菌落生長，且呈β溶血，并伴有特殊芳香氣味。挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r·min-1增菌培養(yǎng)12 h后可見培養(yǎng)基呈均勻渾濁。菌液涂片，革蘭染色、鏡檢見單個或成對排列的革蘭陰性短桿菌。

2.2 生化試驗

利用微量生化反應管進行分離菌的生化試驗。結果顯示(結果未展示，備索)：分離菌葡萄糖發(fā)酵試驗、枸櫞酸鹽利用試驗和硝酸鹽還原試驗為陽性，而麥芽糖和乳糖發(fā)酵試驗、VP試驗、MR試驗、H2S試驗及吲哚試驗結果均為陰性。試驗結果均與綠膿桿菌一致，因此，初步判定分離菌為綠膿桿菌。

2.3 16S rRNA基因序列分析

利用16S rRNA通用引物擴增分離菌16S rRNA基因，結果顯示PCR產物約為1 500 bp。測序結果表明，分離菌株16S rRNA基因序列與綠膿桿菌PA01(登錄號：AE004091.2)的16S rRNA基因序列相似性為99.5%，且與GenBank中其他綠膿桿菌分離株16S rRNA基因均具有極高的相似性。因此，確定該分離菌株為綠膿桿菌，并將其命名為TS2019。

2.4 小鼠致病性試驗

利用小鼠進行分離菌致病性分析，試驗結果表明，在攻毒12 h后，2.64×108CFU和2.64×107CFU接種組小鼠全部死亡，2.64×106CFU接種組的小鼠死亡1只；其余接種組小鼠均出現(xiàn)不同程度癥狀，但至7 d未見死亡；對照組小鼠無任何異常表現(xiàn)。所有死亡小鼠剖檢見肺輕微腫大并明顯出血，并從肺中檢出TS2019菌(見圖1)。根據公式LD50=lg-1[Xm-i(∑P-0.5)]，計算得到TS2019對小鼠的半數(shù)致死量LD50為2.82×107CFU·mL-1。

2.5 藥敏試驗

利用K-B法進行分離菌的藥敏試驗，結果顯示TS2019對環(huán)丙沙星、洛美沙星等4種藥物高度敏感，對頭孢曲松、大觀霉素等5種藥物敏感性次之，而對新霉素、強力霉素等7種藥物存在耐藥性(表1)。

表1 藥敏試驗結果

2.6 TS2019全基因組基本信息分析

全基因組測序獲得TS2019菌株全基因組大小為6 308 327 bp，其中G+C含量占66.51%，共編碼5 929個基因，含tRNA 73個、rRNA 12個、tmRNA 1個。全基因組中共預測到5條CRISPRs結構，6個基因島。

2.7 TS2019基因功能分析

2.7.1 GO注釋分析 TS2019全基因組經GO數(shù)據庫注釋分析，共有3 647個基因得到注釋，占總基因的61.5%。其中生物學過程注釋條目約占總功能注釋的33.1%，主要與代謝過程(metabotic process)、轉錄調控(regulation of transcription)、跨膜轉運(transmembrane transport)等有關；細胞組分注釋條目約占總功能條目的23.2%，其中主要為細胞質(cytoplasm)和質膜(plasma membrane)等；而分子功能注釋約占總注釋條目的43.7%，主要被注釋到轉運活性(transporter activity)和結合(binding)單元。具體結果見圖2A(每個分類選取前20個注釋最多的條目)。

2.7.2 COG功能統(tǒng)計分析 通過與COG數(shù)據庫比對，發(fā)現(xiàn)TS2019中共有2 352個基因得到功能注釋，約占總基因數(shù)的39.7%。其中預測蛋白功能注釋主要集中在氨基酸轉運和代謝過程(291個蛋白質)、能量生產與轉化(211個蛋白質)、核苷酸轉運和代謝(61個蛋白質)等分類單元。具體COG功能注釋分類見圖2B。

2.7.3 KEGG功能統(tǒng)計分析 經KEGG數(shù)據庫注釋，TS2019中共有2 021個基因參與相應的代謝通路，約占總基因數(shù)的34.1%。其中參與新陳代謝途徑的蛋白質最多，共有1 035個，約占注釋蛋白總數(shù)的51.2%。另外，有500個蛋白質參與環(huán)境信息處理，約占注釋蛋白總數(shù)的24.7%。具體注釋分類可見圖2C。

A.GO功能分類; B.COG功能分類; C.KEGG功能分類

2.7.4 耐藥基因注釋分析 經CARD數(shù)據庫比對注釋，發(fā)現(xiàn)TS2019共有5 288個ORF分別為四環(huán)素類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等藥物的耐藥相關基因。其中多數(shù)耐藥相關基因為抗菌藥物的特有外排泵和抗生素靶位點修飾酶或水解酶。具體結果見表2。

表2 TS2019菌株主要耐藥基因類型

2.7.5 毒力因子注釋分析 經VFDB數(shù)據庫比對注釋，得到TS2019全基因組中共有875個序列可編碼與TS2019致病性相關的基因。且這些基因產物多具有黏附、調控或鐵攝取等功能，其中部分基因產物存在功能交叉。根據功能不同可將毒力因子進行分類，具體結果見表3。

表3 TS2019菌株主要毒力因子類型

2.8 toxA和exoT基因系統(tǒng)進化樹的構建

TS2019毒力基因toxA和exoT的序列分析結果表明，toxA基因和exoT基因序列與GenBank中大多數(shù)綠膿桿菌分離株的相應基因序列相似性均高于99%。toxA基因進化樹表明，TS2019與綠膿桿菌NCTC10332株(登錄號：LN831024.1)位于同一分支上，其親緣關系最近(圖3A)。而exoT基因進化樹表明，TS2019與中國杭州人源分離株P33(登錄號：CP065412.1)親緣關系較近，并與中國蘇州人源分離株SE5416(登錄號：CP046404.1)、美國人源分離株PABL077(登錄號：MK509304.1)位于同一大分支(圖3B)。推測TS2019分離株可能來源于人，并通過人與林麝的接觸而導致林麝的感染。

A.toxA基因; B.exoT基因

3 討 論

麝香是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，其具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等諸多功效，藥用和經濟價值極高[12-13]。但隨著野生麝類資源的銳減，我國將所有麝屬動物列為一級重點保護野生動物，并全面禁止野生麝類動物獵捕和取香。因此，麝屬動物的人工繁育及活體取香便成為獲取天然麝香的唯一途徑。林麝是我國人工馴養(yǎng)種群數(shù)量最多的麝屬動物，但隨著生境的變化和種群密度的增加，傳染性疾病逐漸成為影響林麝種群穩(wěn)定增長的主要因素[14-15]。因此，開展林麝傳染病及其防控相關的研究，將為林麝資源的保護和合理利用提供理論支持和技術支撐。

綠膿桿菌的致病性是由眾多胞內及胞外毒力因子協(xié)同作用所形成，鞭毛、菌毛可通過發(fā)揮運動、黏附功能來參與細菌定植過程；鐵攝取系統(tǒng)可通過各種策略獲取鐵元素以滿足細菌生長需求[16]；Ⅲ型分泌系統(tǒng)可直接使效應蛋白exoY、exoS、exoU、exoT進入宿主細胞內，從而破壞宿主細胞防御系統(tǒng)和信號轉導系統(tǒng)[17]；而彈性蛋白酶和堿性蛋白酶協(xié)同作用可使綠膿桿菌逃逸宿主的免疫識別過程[18]。本研究毒力基因注釋結果顯示，TS2019菌株Ⅲ型分泌系統(tǒng)所攜帶的效應蛋白為exoY、exoS、exoT，而 exoU缺失。其可能是因exoU基因和exoS基因在基因組中的位點存在一定的拮抗作用而導致通常只能攜帶二者之一[19]。將TS2019與20株水貂源綠膿桿菌分離株對比，發(fā)現(xiàn)所有菌株攜帶的毒力基因(如exoS、exoT、aprA、phzM、plcH等)均有一定差異[20]。由于本研究分離菌株樣本量不足，因此未能發(fā)現(xiàn)不同動物源性綠膿桿菌的毒力因子攜帶類型與宿主的直接關聯(lián)性。

外毒素A為綠膿桿菌最主要的毒力因子之一，由綠膿桿菌II型分泌系統(tǒng)所分泌，可通過阻斷宿主細胞蛋白質的合成導致細胞壞死或凋亡[21-22]。exoT作為一種基礎的T3SS效應蛋白，幾乎在所有的綠膿桿菌臨床分離株中都表達，并作為一種通用且有效的細胞毒素可誘導多種形式的宿主細胞凋亡[23-24]。基于此，本研究對toxA和exoT基因分別進行了遺傳進化分析。結果表明，toxA和exoT分別與GenBank中綠膿桿菌相應基因序列具有高度相似性，但TS2019的exoT基因處于獨立分支，這可能與該基因堿基突變、缺失等所造成的遺傳距離變化有關。另外，發(fā)現(xiàn)TS2019的toxA基因在第426、553位氨基酸位點均發(fā)生突變。有研究表明，外毒素A的關鍵氨基酸位點改變將導致其毒力下降[25-26]，這與TS2019相比國內部分綠膿桿菌分離株毒力較弱的結果相符合[7,27]。但兩者之間是否存在必然聯(lián)系，需進一步研究。

藥敏試驗結果表明TS2019對強力霉素、四環(huán)素等藥物存在顯著耐藥性。而葛愛民等[11]的研究結果顯示，大多數(shù)綠膿桿菌對強力霉素敏感。其可能是由于不同地域使用不同抗菌藥物而導致細菌耐藥譜產生了變化。耐藥基因注釋結果顯示，TS2019可編碼氨基糖苷類、氟喹諾酮類等藥物的耐藥基因，但試驗結果顯示分離菌對慶大霉素、左氧氟沙星等藥物敏感。此類差異可能與細菌生物被膜的生理異質性有關，即氧氣和各種營養(yǎng)物質濃度發(fā)生變化使生物被膜內不同區(qū)域菌細胞的基因表達、代謝活性出現(xiàn)差異，最終導致基因型和表型之間出現(xiàn)不一致[28]。

本研究中，預測基因的COG功能注釋結果表明，TS2019中有大量基因的編碼產物可參與氨基酸轉運和代謝、能量生產與轉化等生物學過程，這將提供充足的能源物質來保證細菌的增殖、生長。另外，KEGG功能注釋結果顯示，TS2019中有超過50%的預測蛋白參與新陳代謝途徑。這將極有助于細菌建立強大的代謝調控系統(tǒng)來適應不同的生存環(huán)境，以便在感染過程中形成絕對優(yōu)勢[29]。

4 結 論

從病死林麝肺組織中分離到1株綠膿桿菌TS2019，該菌有較強的致病性，且對多種抗生素耐藥；全基因組序列顯示TS2019攜帶耐藥相關基因5 288個、毒力基因875個，其中毒力基因toxA、exoT與GenBank中所有綠膿桿菌toxA、exoT基因序列具有高度相似性。本研究結果為林麝綠膿桿菌感染相關疾病的防治提供了理論支持，也為綠膿桿菌致病機制和耐藥機制的深入研究奠定了基礎。