鴨疫里默氏桿菌recA基因突變對其生長及DNA損傷反應(yīng)的影響

吉 果，陳啟偉，宮曉煒，劉永生，鄭福英

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

細(xì)菌SOS反應(yīng)又稱為細(xì)菌DNA損傷誘導(dǎo)反應(yīng)，是普遍存在的細(xì)菌應(yīng)對DNA損傷的重要保護(hù)機(jī)制[1-2]。SOS反應(yīng)的誘導(dǎo)途徑主要有兩種，即依賴RecA輔蛋白酶活性的途徑和不依賴RecA的通用應(yīng)激反應(yīng)途徑。依賴于RecA的SOS反應(yīng)途徑主要是利用其輔蛋白酶活性，催化包括LexA、噬菌體CI以及UmuC的自裂解，啟動(dòng)誘導(dǎo)SOS反應(yīng)；在大多數(shù)細(xì)菌中，LexA蛋白是RecA表達(dá)的重要調(diào)節(jié)蛋白，是細(xì)菌SOS反應(yīng)的主要抑制因子[3-5]。RecA存在于所有自然狀態(tài)下存活的細(xì)菌中，在整個(gè)細(xì)菌領(lǐng)域中的平均序列保守性為60%～70%[3]。RecA是參與基因重組和DNA修復(fù)的多功能蛋白，調(diào)節(jié)SOS誘導(dǎo)的DNA修復(fù)蛋白的合成與活性，參與突變形成，在基因重組、DNA修復(fù)以及DNA配對和鏈交換中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-5]。

細(xì)菌的SOS反應(yīng)首先是在對紫外線的響應(yīng)中被發(fā)現(xiàn)[6]，但它也與許多物理的(電離輻射，抗生素，酸堿刺激，重金屬破壞)和化學(xué)的(烷基化，交聯(lián)，氧化劑等)損害DNA的因素有關(guān)[7]。環(huán)境因素如UV，包括抗生素在內(nèi)的藥物和熱應(yīng)激都可以引發(fā)和增加活性氧ROS水平，隨之對DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成損傷，從而誘導(dǎo)SOS應(yīng)答[8]。SOS反應(yīng)還可以通過誘導(dǎo)基因重組和促進(jìn)抗性基因的水平轉(zhuǎn)移使細(xì)菌產(chǎn)生抗性[9]。亞抑菌濃度的抗生素誘導(dǎo)的SOS應(yīng)答和突變已在包括大腸桿菌、霍亂弧菌和鏈球菌上得到證實(shí)[7, 10-11]。

鴨疫里默氏桿菌感染鴨、鵝、雞、火雞等家禽和野禽，主要感染1～5周齡的雛鴨，發(fā)病鴨的主要剖檢病變?yōu)槔w維素性漿膜炎。鴨疫里默氏桿菌病在世界各地廣泛分布，具有較高的發(fā)病率和死亡率，是造成養(yǎng)鴨業(yè)重大損失的主要細(xì)菌病之一。鴨疫里默氏桿菌的recA基因?yàn)? 032 bp，編碼大小約37.7 ku的蛋白，但目前尚未報(bào)道該蛋白的生物學(xué)功能。這項(xiàng)工作首次研究了當(dāng)鴨疫里默氏桿菌受到紫外線輻照損傷時(shí)，RecA蛋白調(diào)控菌株的SOS反應(yīng)，獲得的信息有助于增進(jìn)對鴨疫里默氏桿菌RecA蛋白生物學(xué)功能的了解。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和菌株(及其培養(yǎng))

研究中使用的所有細(xì)菌菌株、質(zhì)粒的相關(guān)特性和來源見表1。胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)購自美國 BD difcoTM公司，LB肉湯和LB瓊脂購自北京Solarbio公司，2,6-二氨基庚二酸(DPA)購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；抗生素購自北京Solarbio公司，限制性內(nèi)切酶SacⅠ、SphⅠ、PstⅠ及質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒等均購自TaKaRa公司；多片段一步法快速克隆試劑盒和一步法快速克隆試劑盒購自天津諾禾致源生物信息科技有限公司；0.22 μm 無菌硝酸纖維素膜和過濾器購自美國 Millipore 公司。鴨疫里默氏桿菌RA-GD株和LJW-2株在37 ℃、5%CO2和在含5%小牛血清的TSB或TSA中培養(yǎng)。大腸桿菌X7213株在含有50 μg·mL-1DPA的LB肉湯或LB瓊脂上生長。

表1 本研究所用的菌株與質(zhì)粒

從四川綿櫻鴨業(yè)有限公司(中國成都)購得1日齡櫻桃谷鴨，將動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔環(huán)境，室溫保持在28～30 ℃，每天通風(fēng)兩次。

1.2 方法

1.2.1 ΔrecA缺失株的構(gòu)建 本研究中所用的引物見表2。ΔrecA缺失株的構(gòu)建如文獻(xiàn)[13]所述，將突變株中recA基因的位點(diǎn)替換為紅霉素(ermF)抗性基因。以鴨疫里默氏桿菌LJW-2株的DNA為模板，引物ErmF-F/ErmF-R進(jìn)行擴(kuò)增，獲得紅霉素(ermF)抗性基因。以RA-GD菌株的DNA作模板，用引物Up-F/Up-R和Dp-F/Dp-R分別擴(kuò)增recA基因的上游和下游(各600 bp)同源臂序列。最后用SacⅠ和SphⅠ酶切pRE112質(zhì)粒以獲得載體片段。

表2 PCR與qRT-PCR引物序列

將上游同源臂、ErmF基因、下游同源臂和酶切后的pRE112質(zhì)粒用多片段一步法快速克隆試劑盒(Novogene，天津)連接，生成重組質(zhì)粒pRE112::ErmF-600H，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌X7213。將攜帶pRE112::ErmF-600H重組質(zhì)粒的大腸桿菌X7213和鴨疫里默氏桿菌RA-GD株共培養(yǎng)，用2 mg·L-1的紅霉素篩選陽性菌株，并用保守引物OmpA-F/OmpA-R和鑒定引物RecA-F/RecA-R和ErmF-F/ErmF進(jìn)行擴(kuò)增，并將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證。得到的缺失株命名為ΔrecA。

1.2.2 c△recA回復(fù)株的構(gòu)建E.coli-R.anatipestifer穿梭質(zhì)粒pCPRA在前期工作中構(gòu)建完成[12]。以親本株RA-GD為模板，以引物pCP-RecA-F/pCP-RecA-R擴(kuò)增攜帶recA基因的片段，并回收。將pCRRA質(zhì)粒用PstⅠ和SphⅠ雙酶切，回收線性載體片段，用一步法快速克隆試劑盒(Novogene，天津)將recA基因目的片段和載體片段連接，轉(zhuǎn)化X7213大腸桿菌細(xì)胞，以100 μg·mL-1的Amp抗性進(jìn)行篩選，得到供體菌X7213-pCPRA::RecA。與缺失株ΔrecA共培養(yǎng)，以2 mg·L-1的Cfx進(jìn)行篩選，得到回復(fù)株c△recA。

1.2.3 生長曲線的測定 根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的OD600 nm值，在非競爭條件下監(jiān)測RA-GD、△recA和c△recA菌株的生長曲線。分別將菌株接種至5 mL 含5%小牛血清的TSB中，37 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)至OD600 nm約1.0，并測定每個(gè)菌株的菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)，調(diào)整每個(gè)菌株的起始濃度均為109CFU·mL-1。以1∶100的比例分別接種至10 mL含血清的TSB中，37 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)。每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度計(jì)測量其OD600 nm值，共測定12 h，每個(gè)菌株做3組平行試驗(yàn)。根據(jù)OD600 nm值繪制每個(gè)菌株的生長曲線。

1.2.4recA基因的轉(zhuǎn)錄 將親本株RA-GD培養(yǎng)至 OD600 nm值達(dá)到1.0，用60 μW·cm-2的紫外劑量輻照菌株，輻照時(shí)間為0、15、30和45 min，提取的樣品mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板備用。以RecA-qRT-F/RecA-qRT-R為引物，用qRT-PCR檢測recA基因的轉(zhuǎn)錄水平；同時(shí)用16S-F/16S-R引物擴(kuò)增rrsA3基因(產(chǎn)物為16S核糖體RNA)，作為內(nèi)參。利用2-△△Ct方法計(jì)算recA基因的相對轉(zhuǎn)錄水平[14]。

1.2.5 DNA損傷試驗(yàn) 根據(jù)細(xì)菌基因組的完整性判定雙鏈DNA(dsDNA)的損傷程度，試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[15]，該方法的原理：對細(xì)菌細(xì)胞施加損傷后，將細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞基因組DNA，此時(shí)DNA上會(huì)出現(xiàn)斷裂點(diǎn)。在控制合適的堿性和溫度條件下，dsDNA會(huì)從斷裂點(diǎn)位置解鏈，而完整的dsDNA不會(huì)解鏈。加入中和液后，再加入熒光染料，而染料只和未解鏈的dsDNA結(jié)合，不會(huì)和斷裂點(diǎn)解鏈的單鏈DNA結(jié)合。因此，檢測到的熒光信號越強(qiáng)，說明基因組DNA越完整；檢測到的熒光信號越弱，說明dsDNA上的斷裂點(diǎn)越多，損傷越嚴(yán)重。

把RA-GD、△recA和c△recA分別培養(yǎng)至OD600 nm為1.0，調(diào)整每個(gè)菌株的起始濃度均為105CFU·mL-1。將細(xì)菌懸液放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入500 μL懸液(5×104CFU)，用60 μW·cm-2的紫外劑量輻照菌株，輻照時(shí)間為45 min，提取細(xì)菌基因組DNA。取50 μL DNA溶液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后加入55 μL 0.2 mol·L-1的NaOH溶液，30 ℃保持60 min，使dsDNA解鏈。然后加入70 μL中和液(14 mmol·L-1β-巰基乙醇，1 mol·L-1葡萄糖)，同時(shí)將溫度降至22 ℃。最后加入78 μL SybrGreen溶液(1∶8333)，混勻后立即以492 nm激發(fā)/520 nm發(fā)射波長測定熒光信號。

未經(jīng)過紫外線處理的菌株作為陽性對照，處理時(shí)先把70 μL中和液加入細(xì)菌DNA溶液中，再加入55 μL 0.2 mol·L-1的NaOH溶液，以保證細(xì)菌dsDNA的完整性。不含有任何細(xì)菌DNA的樣本(50 μL DNA洗脫液)作為陰性對照。每個(gè)樣本的相對熒光信號依據(jù)以下公式計(jì)算：熒光信號(%)=(樣本-陰性對照)/(樣本-陽性對照)×100%。本研究中采用了依據(jù)檢測到的熒光信號的強(qiáng)弱從而判定基因組DNA完整性的FADU方法[15-17]。

另外，為了檢測RA-GD、△recA和c△recA在紫外線輻照下的存活能力，作者測定了經(jīng)紫外線輻照不同時(shí)間后上述菌株的CFU。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用GraphPad Prism 6.0版Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。t檢驗(yàn)用于確定組間差異的重要性。*.P<0.05表示差異顯著，而**.P< 0.01和***.P<0.001均表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ΔrecA基因缺失株的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，ΔrecA中recA基因無法擴(kuò)增，ermF基因可以擴(kuò)增出來，說明RA-GD中recA基因已被ermF基因置換(圖1)；經(jīng)對PCR產(chǎn)物測序驗(yàn)證，與目標(biāo)序列的相似性為100%，說明ΔrecA基因缺失株構(gòu)建成功。

M.DL2000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.ompA基因陽性對照；2、3.ompA基因擴(kuò)增；4、5.recA基因擴(kuò)增；6、7.ermF基因擴(kuò)增；8.ermF基因陰性對照

2.2 cΔrecA基因回復(fù)株的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，ΔrecA菌株中轉(zhuǎn)入回復(fù)質(zhì)粒pCPRA::RecA后，可以擴(kuò)增到recA基因(圖2)；對PCR產(chǎn)物測序驗(yàn)證，與目標(biāo)序列的相似性為100%，說明回復(fù)株cΔrecA構(gòu)建成功。

M.DL2000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.ompA基因陰性對照；2.ompA基因陽性對照；3.ompA基因擴(kuò)增；4.recA基因陽性對照；5.recA基因擴(kuò)增；6.recA基因陰性對照

2.3 生長曲線

根據(jù)12 h內(nèi)的生長曲線，與親本株RA-GD相比，缺失株ΔrecA的生長速率沒有明顯差異(圖3)，提示recA基因?qū)τ邙喴呃锬蠗U菌的生長特性沒有明顯影響。

圖3 親本株RA-GD和缺失株△recA的生長曲線

2.4 recA基因的轉(zhuǎn)錄水平

在紫外線處理的條件下，RA-GD株的recA基因的轉(zhuǎn)錄水平在0～45 min內(nèi)隨紫外線輻照時(shí)間的延長而顯著增加(圖4)。

圖4 紫外線輻照不同時(shí)間的RA-GD菌株recA基因的轉(zhuǎn)錄水平

2.5 DNA損傷試驗(yàn)

在紫外線輻照的0～45 min內(nèi)，親本株RA-GD和回復(fù)株cΔrecA dsDNA的熒光信號顯著強(qiáng)于缺失株cΔrecA(圖5)，說明紫外線可以破壞鴨疫里默氏桿菌dsDNA的完整性，并且recA基因缺失導(dǎo)致dsDNA的完整性明顯下降，提示recA基因參與了dsDNA的損傷修復(fù)反應(yīng)(SOS反應(yīng))。

圖5 紫外線處理不同時(shí)間條件下RA-GD、cΔrecA和ΔrecA的熒光信號

在0～45 min，RA-GD、cΔrecA和ΔrecA的CFU均隨著紫外線輻照時(shí)長增加而減小，表明紫外線對細(xì)菌的殺滅效果隨照射時(shí)間延長而加強(qiáng)。在相同輻照時(shí)長下，RA-GD和cΔrecA的CFU均明顯多于ΔrecA；與輻照時(shí)間0 min相比，輻照15、30和45 min時(shí)，RA-GD/ΔrecA和cΔrecA/ΔrecA的CFU的比值均顯著增大，說明recA基因滅活可使RA-GD對UV的抵抗力下降，生存能力降低(表3)。

表3 紫外線處理不同時(shí)間條件下RA-GD、cΔrecA和ΔrecA的CFUs

3 討 論

SOS反應(yīng)會(huì)引發(fā)大量的細(xì)菌細(xì)胞反應(yīng)，包括DNA修復(fù)、細(xì)菌細(xì)胞伸長、誘導(dǎo)易出錯(cuò)的DNA聚合酶、誘導(dǎo)潛伏噬菌體和抑制細(xì)胞分裂等[18-19]。RecA和LexA蛋白在SOS反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。在正常生長過程中，LexA二聚體通過結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域的特定操作序列，作為SOS調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子[20-21]。RecA作為一種輔蛋白酶，刺激LexA和其他相關(guān)蛋白的自裂解。鴨疫里默氏桿菌RecA蛋白是1個(gè)37 ku的蛋白，與大腸桿菌的RecA蛋白具有60.5%的氨基酸序列相似性，但是該蛋白的功能目前還未見報(bào)道。

關(guān)于鴨疫里默氏桿菌RecA蛋白在其受到外界因素?fù)p傷時(shí)是否發(fā)揮調(diào)控SOS反應(yīng)，目前還未見相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究對此問題進(jìn)行研究。首先構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌recA基因的缺失株和回復(fù)株。若recA基因滅活不明顯影響菌株的生長能力，可以更好地確定菌株其他性狀的改變與recA基因的功能相關(guān)。因此，對親本株和recA基因缺失株的生長能力進(jìn)行檢測。依據(jù)菌株在12 h內(nèi)的生長曲線，發(fā)現(xiàn)recA基因缺失沒有明顯影響菌株的生長能力，說明該基因與鴨疫里默氏桿菌的生長之間沒有明顯的相關(guān)性。此結(jié)果與一項(xiàng)關(guān)于脆弱擬桿菌的研究結(jié)論相符。該研究表明，與正常的野生株相比，脆弱擬桿菌recA突變株在正常條件下的生長時(shí)間沒有顯著延長[22]。

RecA蛋白是參與細(xì)菌SOS反應(yīng)并發(fā)揮關(guān)鍵作用的重組酶。當(dāng)細(xì)菌受到外界破壞因素刺激而損害到其基因組DNA時(shí)，細(xì)菌啟動(dòng)SOS反應(yīng)以應(yīng)對生存危機(jī)，此時(shí)RecA蛋白發(fā)揮促進(jìn)損傷DNA修復(fù)的功能，轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平可能上調(diào)。Niccum等[23]通過qRT-PCR法檢測了紫外線處理對大腸桿菌recA基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果顯示recA基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，表明recARNA是SOS應(yīng)答早期能檢測到的可靠指標(biāo)。筆者也檢測了鴨疫里默氏桿菌在紫外線輻照下的recA基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，經(jīng)紫外線輻照的菌株其recA基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，推測菌株啟動(dòng)了依賴于RecA蛋白的SOS反應(yīng)。

檢測細(xì)菌的存活能力及其dsDNA的損傷程度是判定SOS反應(yīng)的重要指標(biāo)，需要穩(wěn)定可靠的檢測方法。本試驗(yàn)中，在紫外線損傷下鴨疫里默氏桿菌親本株RA-GD和回復(fù)株cΔrecA的熒光信號顯著高于缺失株ΔrecA，說明其dsDNA損傷程度明顯小于缺失株，并且其存活能力顯著高于缺失株。這些數(shù)據(jù)說明recA基因的缺失阻礙了DNA的損傷修復(fù)反應(yīng)(SOS應(yīng)答)，提示鴨疫里默氏桿菌RecA蛋白在DNA損傷修復(fù)反應(yīng)中發(fā)揮正調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

鴨疫里默氏桿菌RecA蛋白與其生長能力無明顯相關(guān)性，參與紫外線損傷后細(xì)菌的存活及其基因組dsDNA的修復(fù)，調(diào)控鴨疫里默氏桿菌的SOS反應(yīng)。