外源胰島素和能量限飼對雞PPP1R3C表達的效應(yīng)

高林歌，邵冰豪，朱星浩，陳 博，郭鈺君，黃艷群，陳 文

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 飼料營養(yǎng)河南省工程實驗室，鄭州 450002)

本試驗擬通過研究外源胰島素和限飼處理對PPP1R3C的表達效應(yīng)，揭示雞PPP1R3C的表達調(diào)控特性和潛在功能。蛋白磷酸酶1(PP1)全酶是由催化亞基(PP1c)和調(diào)節(jié)亞基組成，其活性主要靠調(diào)節(jié)亞基的磷酸化和變構(gòu)調(diào)控來控制[1]。胰島素的一個基礎(chǔ)作用是通過促進葡萄糖進入肌肉和脂肪組織合成糖原，并抑制肝糖原的輸出來降低血糖濃度[2]。肌肉和肝中糖原的含量受兩種關(guān)鍵的酶調(diào)控，即糖原磷酸化酶(GP)和糖原合成酶(GS)[3]。GS和GP的活性受磷酸化和去磷酸化的調(diào)控，GS受蛋白激酶A和糖原合成酶激酶3(GSK3)的磷酸化抑制，通過糖原合成酶磷酸酶(GSP)去磷酸化激活，而GP可被磷酸化激酶激活，并被蛋白磷酸酶1的去磷酸化而抑制[4]。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫，共有7個調(diào)節(jié)亞基被推斷為人類糖原靶向亞基，而這7個 編碼調(diào)節(jié)亞基的基因分別被稱為PPP1R3A～PPP1R3G[5]。它們都包含有PP1c調(diào)節(jié)基序[6]、糖原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域[7-8]。PP1對糖原代謝酶具有調(diào)節(jié)作用，因此在糖代謝過程中起著非常重要的作用。

PPP1R3C是蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3C，在人體內(nèi)又被稱為PPP1R5或PTG，主要在骨骼肌和肝中高度表達[9-10]。目前，PPP1R3C的研究主要集中于哺乳動物的糖原代謝酶活性調(diào)節(jié)以及糖原的合成[11-12]。Zhai等[13]通過敲除小鼠PPP1R3C基因發(fā)現(xiàn)，小鼠胰島素敏感性顯著增強且能量消耗增加。另有研究表明，敲除小鼠原代肝細胞中的PPP1R3C降低了肝糖生成，與正常小鼠相比PPP1R3C在肥胖小鼠體內(nèi)表達量升高[14]。PPP1R3C也是一種新型的低氧誘導(dǎo)因子的靶基因，Mohindra等[15]發(fā)現(xiàn)，在短期缺氧條件下PPP1R3C在印度鯰魚的胰島素敏感組織(肌肉和肝)中表達量顯著增加。另外，PPP1R3C也與一些疾病的發(fā)生相關(guān)，Chown等[16]敲除PPP1R3C降低了大鼠骨骼肌葡聚糖的積累，減少了成年大鼠葡聚糖體病的發(fā)生；Dang等[17]發(fā)現(xiàn)，苓桂術(shù)甘湯能抑制大鼠PPP1R3C的表達，從而減輕非酒精性脂肪肝病。PPP1R3C在雞上鮮有研究報道，Ji等[18]利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，PPP1R3C是背部和腿部皮膚的一個差異表達基因，Tian等[19]通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，PPP1R3C是鉻中毒引起雞肝代謝異常的一個差異表達基因。

目前，關(guān)于PPP1R3C在家禽方面尚未有系統(tǒng)的研究。本試驗分析了雞PPP1R3C在不同組織和不同發(fā)育時期的表達特性，及外源胰島素和能量限飼對雞PPP1R3C的表達效應(yīng)。掌握雞PPP1R3C的時空表達特性，揭示外源胰島素和能量限飼對雞PPP1R3C表達的影響，相關(guān)研究將為深入揭示雞PPP1R3C基因生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及處理

試驗一：取相同批次的肉雞種蛋，于孵化箱37 ℃孵化，在孵化期間于14和19胚齡各挑選10只取胸肌等組織樣。待孵化后在相同條件下飼養(yǎng)，自由采食、飲水，飼糧配制參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)，分別飼喂至7和21日齡，各取10只雌性肉雞胸肌組織樣，于液氮速凍后-80 ℃保存。

試驗二：采用相同批次的雄性AA肉雞于相同條件下飼養(yǎng)，自由采食、飲水，飼糧配制參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)。參考本實驗室前期的試驗分組[20]，隨機取40只體重相近的24日齡的雞分為兩組(每組20只)，試驗開始前兩組均禁食12 h。試驗組腹腔注射0.05 mL·kg-1的胰島素處理，記為INS組；對照組腹腔注射同劑量的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)處理，記為PBS組。試驗期間所有雞只均保持自由飲水，試驗所用胰島素用PBS進行稀釋(胰島素∶PBS=1∶9)，所用胰島素為諾和銳短效胰島素(胰島素規(guī)格3 mL=300 IU)。禁食后在胰島素和PBS注射之前(0 min)屠宰5只，在胰島素和PBS注射后15、120和240 min各屠宰5只，采取胸肌、肝和腹脂等組織迅速置于液氮中速凍后-80 ℃ 保存。并以0 min組織樣為基礎(chǔ)狀態(tài)，檢測PPP1R3C在不同組織中的表達情況。

試驗三：相同批次的雌性AA肉雞于相同條件下飼養(yǎng)、自由采食、飲水，飼糧配制參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)，飼養(yǎng)至18日齡時隨機挑取40只體重相近的雞分為對照組和能量限飼組。對照組自由采食常規(guī)日糧，能量限飼組則實施30%的能量限制(在對照組平均日采食量的80%基礎(chǔ)上飼喂低能日糧)的處理，日糧配方參考本實驗室前期研究的能量限飼配方[21]。試驗進行至48天時，每組各屠宰10只雞，并采集胸肌和肝等組織置于液氮中速凍后-80 ℃保存。

試驗四：取相同批次的雌性AA肉雞于相同條件下飼養(yǎng)、自由采食、飲水，飼料標準參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)，飼喂至7日齡時隨機挑選30只體重相近的雞分為3組(對照組、能量限飼組和蛋白限飼組)。對照組自由采食常規(guī)日糧；能量限飼組自由采食能量限制飼糧(實行15%的能量限制)；蛋白限飼組自由采食蛋白限制飼糧(實行15%的蛋白限制)，能量限制飼糧和蛋白限制飼糧的其他營養(yǎng)水平與常規(guī)日糧均一致，飼糧配方參照本實驗室前期的限制配方[22]。試驗進行至21日齡時，每組各屠宰10只雞，并取胸肌等組織樣于液氮中速凍后-80 ℃保存。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)PPP1R3C基因序列(登錄號：XM_423102.5)，采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物，通過生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。本試驗所用的PPP1R3C及β-actin(登錄號：NM_205518.1)基因引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物信息

1.3 RNA提取和cDNA的合成

采用TRIzol法提取肉雞各組織RNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，利用分光光度計測定總RNA的濃度以及OD260 nm/OD280 nm。所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒為HiScript Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme，南京)。反轉(zhuǎn)錄體系包括兩步：1)去除基因組DNA：Total RNA 1 μg、5×gDNA wiper Mix 2 μL，用ddH2O補充至10 μL; 反應(yīng)程序：42 ℃ 2 min。2)合成cDNA：第一步的混合液10 μL、10×RT Mix 2 μL、HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL、Oligo(dT)20VN 1 μL、Random hexamers 1 μL、ddH2O 4 μL;反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，cDNA于-20 ℃保存。

1.4 qRT-PCR檢測基因表達量

利用qRT-PCR技術(shù)檢測PPP1R3C的相對表達量。所用qRT-PCR試劑盒為ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，南京)，qPCR反應(yīng)體系(20 μL)包括：cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，加ddH2O補充至20 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，每個反應(yīng)體系均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。所有qRT-PCR結(jié)果均采用2-ΔΔCt法計算相對表達量[23]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本試驗利用SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)分析。除同一時間點胰島素和PBS間的顯著性采用t檢驗外，其余數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析，并進行Duncan’s多重比較。以P<0.05為差異顯著性判斷標準。使用GraphPad Prism 8.0繪制圖表。

2 結(jié) 果

2.1 雞PPP1R3C基因組織表達分析

利用采集的試驗二肉雞基礎(chǔ)狀態(tài)(胰島素和PBS注射之前，0 min)組織樣品，首先利用表1中的引物信息，通過RT-PCR擴增檢測雞PPP1R3C在各個組織中的表達量(圖1A)，RT-PCR結(jié)果顯示，PPP1R3C在心、胸肌和腿肌中高表達，在脾、肌胃和腺胃等組織表達較低。然后利用qRT-PCR定量檢測PPP1R3C在AA肉雞不同組織中mRNA 的相對表達量(圖1B)，研究發(fā)現(xiàn)，PPP1R3C在胸肌中的表達量最高，而在脾組織中最低。胸肌中PPP1R3C mRNA水平顯著高于心肌和腿肌等其余8個組織(P<0.05)，PPP1R3C在心肌中的表達量顯著高于肝、脾、肺、肌胃、腺胃和腹脂(P<0.05)。而PPP1R3C在其他組織的表達量沒有顯著差異(P>0.05)。

A.瓊脂糖凝膠電泳檢測PPP1R3C組織表達譜；B.qRT-PCR檢測PPP1R3C 組織表達譜。β-actin為內(nèi)參基因。不同字母表示P<0.05；相同字母表示P>0.05。Marker.DNA相對分子質(zhì)量標準

2.2 PPP1R3C在雞不同發(fā)育時期胸肌中的表達

采用試驗一中采集的組織樣品檢測雞不同發(fā)育時期胸肌中PPP1R3C的表達量(圖2)。結(jié)果表明，PPP1R3C表達量呈現(xiàn)了明顯隨雞的發(fā)育而升高的趨勢。在胚胎發(fā)育早期(14胚齡)表達比較低，隨后各檢測時間點PPP1R3C的表達水平均極顯著高于前一個檢測時間點(P<0.01)。

**.P<0.01

2.3 外源胰島素對雞PPP1R3C表達的影響

利用試驗二中采集到的樣品檢測了胰島素注射0(胰島素和PBS注射之前)、15、120和240 min后胸肌、肝、脂肪組織中的PPP1R3C mRNA表達量(以PBS為對照，圖3)。在胸肌組織中(圖3A)，胰島素注射顯著降低了PPP1R3C在胸肌組織的表達水平，在胰島素注射后120 min時PPP1R3C mRNA的表達水平顯著低于0 min和15 min。PBS注射后PPP1R3C表達量在不同時間點間沒有發(fā)生顯著性變化(P>0.05)。在注射后120 min和240 min時，INS組與PBS組相比PPP1R3C表達量均顯著下降(P<0.05)，而在注射后15 min時INS組與PBS組的差異沒有達到顯著水平(P>0.05)。

在肝組織中(圖3B)，胰島素注射顯著降低了PPP1R3C在肝組織的mRNA表達水平，胰島素注射后15 min時PPP1R3C表達量顯著低于0 min(P<0.05)，而15、120、240 min間PPP1R3C mRNA水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。PBS注射后PPP1R3C的表達呈現(xiàn)波浪式的波動，但總體處于動態(tài)平衡。與PBS組相比，在胰島素注射后120 min時PPP1R3C表達量顯著降低(P<0.05)，胰島素注射后15和240 min時與PBS組的差異沒有達到顯著水平(P>0.05)。

在腹脂組織中(圖3C)，胰島素注射后PPP1R3C mRNA水平呈現(xiàn)了完全不同于胸肌和肝臟組織的表達變化趨勢。胰島素注射后PPP1R3C mRNA表達水平迅速上調(diào)后又逐漸回落到0 min水平，胰島素注射后15 min與0 min相比PPP1R3C表達量大約升高了2倍(P<0.05)，而120和240 min時與0 min相比PPP1R3C表達量無顯著差異(P>0.05)。PBS注射后PPP1R3C表達水平明顯降低，15、120和240 min時PPP1R3C表達量均明顯低于0 min，而PBS注射后15、120和240 min沒有顯著差異(P>0.05)。在注射后15 min時，INS組與PBS組相比PPP1R3C的表達水平顯著升高(P<0.05)，在注射后120和240 min時，INS組與PBS組相比PPP1R3C mRNA表達水平無顯著差異(P>0.05)。

A.胰島素/PBS注射后胸肌中PPP1R3C的表達；B.胰島素/PBS注射后肝中PPP1R3C的表達；C.胰島素/PBS注射后腹脂中PPP1R3C的表達。INS組不同時間點間，不同字母表示P<0.05，相同字母表示P>0.05。同一時間點不同處理間，*表示P<0.05，**表示P<0.01。INS.胰島素處理組；PBS.對照組

2.4 30%能量限飼對PPP1R3C表達量的影響

由于能量限飼可能導(dǎo)致體內(nèi)胰島素分泌水平的改變，本研究進一步開展了能量限飼對PPP1R3C在胸肌和肝表達效應(yīng)的研究。結(jié)果表明，30%的能量限制極顯著降低了PPP1R3C在肉雞胸肌和肝中的表達量(P<0.05)。在胸肌組織中限飼組PPP1R3C的表達量大約降低了73%(圖4A)，在肝組織中限飼組PPP1R3C表達量大約降低了94%(圖4B)。

A.30%能量限飼后胸肌中PPP1R3C的表達；B.30%能量限飼后肝臟中PPP1R3C的表達。**.P<0.01

2.5 15%能量限飼和15%蛋白限飼對胸肌中PPP1R3C表達的影響

為了驗證能量限飼對PPP1R3C表達的影響是否具有普遍性，利用實驗室構(gòu)建的群體分析了15%的能量限飼和15%蛋白限飼對PPP1R3C表達的效應(yīng)(圖5)。結(jié)果表明，對照組與15%能量限飼組相比，胸肌中PPP1R3C表達沒有顯著差異(圖5A)，蛋白限飼與對照組相比，胸肌中PPP1R3C的表達沒有顯著性變化(圖5B)。

A.15%能量限飼后胸肌中PPP1R3C的表達；B.15%蛋白限飼后胸肌中PPP1R3C的表達

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，雞PPP1R3C具有和哺乳動物[24]相似的組織表達特性，也在骨骼肌中表達較高；時空表達結(jié)果顯示，隨著雞體的發(fā)育胸肌中PPP1R3C的表達呈現(xiàn)升高的趨勢，顯示了雞PPP1R3C在肌肉發(fā)育中的潛在重要功能。另外，本研究表明，雞PPP1R3C是胰島素敏感基因，外源胰島素顯著改變了肉雞胸肌、肝和腹脂組織中PPP1R3C mRNA水平，且PPP1R3C對外源胰島素的響應(yīng)呈現(xiàn)了明顯的組織特異性。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，0.05 mL·kg-1的胰島素劑量在雞中是耐受的，胰島素注射能顯著降低肉雞的血糖水平，在胰島素注射后120 min內(nèi)肉雞血糖濃度幾乎呈線性下降，并在120 min時降至最低點[25]，直到240 min時仍然保持在低水平[26]。本研究中，胰島素注射后胸肌和肝組織中PPP1R3C表達呈現(xiàn)了和血糖相似的變化規(guī)律，顯示了雞胸肌和肝組織PPP1R3C對禁食血糖濃度的潛在正向調(diào)控作用。在哺乳動物中的研究也表明，PPP1R3C是胰島素敏感基因，在胰島素調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的過程中起著重要的作用。肝過表達PPP1R3C顯著降低了小鼠自由采食狀態(tài)下血漿胰島素水平，并提升了禁食狀態(tài)下的血糖水平[27]。

胰島素能夠刺激肌肉和肝中的糖原合成，在進食的碳水化合物中有20%被貯存在肝，30%貯存在肌肉中[28-29]。有研究表明，人肌肉細胞過表達PPP1R3C時細胞中糖原的積累顯著增加[30]；Greenberg等[31]發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1脂肪細胞中過表達PPP1R3C顯著提高了脂肪細胞的糖原合成，當添加胰島素后脂肪細胞中的糖原合成效率進一步增加；Jurczak等[32]發(fā)現(xiàn)，過表達PPP1R3C顯著增加了小鼠脂肪細胞的糖原積累；當全身性敲減PPP1R3C時小鼠胸肌、肝和脂肪中糖原水平均下降，且小鼠胸肌、肝和脂肪中糖原合成和葡萄糖攝取減少，而附睪脂肪中葡萄糖轉(zhuǎn)運補償性增加[23-24，33]。上述的研究顯示，組織PPP1R3C表達水平與糖原水平呈正相關(guān)，高水平的PPP1R3C能夠促進細胞中糖原的合成，低表達的PPP1R3C降低了細胞中糖原的積累。本研究中，外源胰島素降低了肉雞胸肌和肝中PPP1R3C的表達，上調(diào)了脂肪組織(15 min)的mRNA水平，提示雞體在對外源胰島素刺激下，一定程度上可能通過降低胸肌和肝臟PPP1R3C水平而減少胸肌和肝組織中糖原的合成和葡萄糖的攝取，而不完全補償性地增加腹脂中葡萄糖的轉(zhuǎn)運。

肥胖會導(dǎo)致多種并發(fā)癥，包括2型糖尿病、脂肪肝等[34-35]。長期高能量的攝入會引起胰島素抵抗，而低能量飲食能夠改善機體胰島素敏感性[36-38]。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，30%能量限飼顯著降低了AA肉雞的體重、腹脂重以及甘油三酯和葡萄糖水平[39]，而其血清胰島素水平?jīng)]有明顯的改變。本研究發(fā)現(xiàn)，30%能量限制產(chǎn)生了類似外源胰島素的效應(yīng)，顯著降低了胸肌和肝中PPP1R3C的表達。然而15%能量限飼和15%蛋白限飼均未能顯著改變雞PPP1R3C的mRNA水平，顯示了能量限飼對雞PPP1R3C的效應(yīng)具有劑量依賴性。另有研究表明，在高脂喂食的小鼠體內(nèi)PPP1R3C的表達升高了兩倍，禁食后再喂食小鼠體內(nèi)PPP1R3C的表達也顯著增加，另外高脂飼喂顯著增加了小鼠mTORC1的活性，而敲除PPP1R3C后小鼠的胰島素敏感性增加[40]。

4 結(jié) 論

本試驗發(fā)現(xiàn)，雞PPP1R3C呈現(xiàn)了明顯的時空動態(tài)表達特性，PPP1R3C在所檢測組織中廣泛表達，在胸肌組織中表達量最高，其在胸肌組織中的表達量隨個體發(fā)育逐漸上升。外源胰島素顯著下調(diào)了PPP1R3C在胸肌和肝的表達，而上調(diào)了PPP1R3C在脂肪組織中的早期表達。15%能量限飼和15%蛋白限飼均未能顯著影響胸肌中PPP1R3C的表達，而30%能量限飼顯著下調(diào)了胸肌和肝臟中PPP1R3C的表達，顯示了能量限飼對PPP1R3C基因表達影響的劑量依賴性。