敲減神經(jīng)肽F基因(npf)對亞洲玉米螟取食、生長發(fā)育和繁殖的影響

石 堅, 王 原, 梁 佳, 杜 娟, 趙章武

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲系, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物有害生物監(jiān)測與綠色防控重點實驗室, 北京 100193)

神經(jīng)肽F(neuropeptide F, NPF)屬于高等動物神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y, NPY)家族，是無脊椎動物特有的神經(jīng)肽，因其序列C末端的一個酪氨酸(Y)被苯丙氨酸(F)取代，故命名為NPF (Mauleetal., 1991; Rajparaetal., 1992; de Jong-Brinketal., 2001)。NPF最初在莫尼茲絳蟲Moniezaexpansa上發(fā)現(xiàn)(Mauleetal., 1991)，此后通過特異性血清，在馬鈴薯甲蟲Leplinotarsadecemlineata(Spittaelsetal., 1996)與沙漠蝗Schistoceracagregaria(Veenstra and Lambrou, 1995)等無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)由8～10個氨基酸組成的NPF短肽(short neuropeptide F, sNPF)。1999年在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中鑒定到了NPF長肽(Brownetal., 1999)。

昆蟲NPF主要在腦與腸道中表達(dá)(Brownetal., 1999; Wuetal., 2003, 2005a, 2005b; Krashesetal., 2009; Yueetal., 2016, 2017)，因此也稱之為腦-腸肽(brain-gut peptide)。通過原位雜交與免疫熒光技術(shù)，NPF首先定位在黑腹果蠅的腦和中腸中(Brownetal., 1999; Marianes and Spradling, 2013; Veenstraetal., 2014)。隨著NPF-Gal4果蠅轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的構(gòu)建，腦中NPF的定位更加精確。在黑腹果蠅3齡幼蟲腦中發(fā)現(xiàn)有6個表達(dá)NPF的神經(jīng)元，其中兩對在前腦背部與中部，另一對在食道下神經(jīng)節(jié)(Wuetal., 2003, 2005a, 2005b)。羽化后的果蠅成蟲其NPF在腦中的表達(dá)表現(xiàn)出雌雄的性二型性特征，其中雄成蟲腦中含有26個表達(dá)NPF的神經(jīng)元，而雌成蟲中在背側(cè)神經(jīng)元(lateral dorsal neurons, LNds)多出3對生物鐘相關(guān)的神經(jīng)元，參與果蠅睡眠和節(jié)律的調(diào)節(jié) (Leeetal., 2006)。此后在其他昆蟲腦中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)NPF的表達(dá)，如吸血蝽Rhodniusprolixus(Gonzalez and Orchard, 2008)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Huangetal., 2011)和東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis(Houetal., 2017)等。

在昆蟲中，NPF對幼蟲的取食具有重要的調(diào)控作用。在黑腹果蠅中，幼蟲隨著NPF及其受體NPFR1的升高而增加其取食量，當(dāng)幼蟲進(jìn)入徘徊期之前會停止取食而化蛹，此時幼蟲體內(nèi)的NPF表達(dá)量顯著下降(Wuetal., 2003)。此外，過表達(dá)NPF或其受體NPFR1，黑腹果蠅幼蟲取食更多的有害食物 (Wuetal., 2005b)，說明NPF不僅調(diào)控幼蟲的取食量，而且還調(diào)控著幼蟲對食物選擇的敏感性。Van Wielendaele等(2013)研究了NPF對沙漠蝗的取食調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)NPF表達(dá)量的增加伴隨著沙漠蝗體重和取食量的增加，而降低NPF后出現(xiàn)相反的情況。鱗翅目的棉鈴蟲、煙青蟲Helicoverpaassulta以及亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis在NPF取食研究中也得到了相似的結(jié)論(Liuetal., 2013; Yueetal., 2016; Yueetal., 2017; Yue and Zhao, 2017; Cuietal., 2020)。

近年來，由NPF的取食調(diào)控延伸出的發(fā)育和壽命調(diào)控得到廣泛的關(guān)注。在發(fā)育調(diào)控方面，Kannangara等(2020)報道了黑腹果蠅中攝食和發(fā)育協(xié)調(diào)的機(jī)制。NPF受體通過反向調(diào)控胰島素信號通路和正向調(diào)控前胸腺中蛻皮激素的分泌來影響發(fā)育過程，包括發(fā)育時間、生長速率和體型大小。由于NPF并不在幼蟲的前胸腺中表達(dá)，表明NPF釋放可能激活前胸腺細(xì)胞中的NPFR (Kannangaraetal., 2020)。因此，在營養(yǎng)應(yīng)激下產(chǎn)生的NPF既可以通過腦內(nèi)的NPFR神經(jīng)元調(diào)節(jié)攝食行為，也可以通過前胸腺中的NPFR調(diào)節(jié)發(fā)育，從而協(xié)調(diào)攝食行為和發(fā)育。

亞洲玉米螟是一種鱗翅目螟蛾科的害蟲，主要分布在包括中國在內(nèi)的東亞及東南亞等地區(qū)。作為一種發(fā)生面積廣、危害嚴(yán)重的害蟲，亞洲玉米螟在我國每年會造成春玉米減產(chǎn)10%，夏玉米減產(chǎn)20%～30%左右，嚴(yán)重的年份甚至可造成30%以上的損失。在熱帶農(nóng)業(yè)國家，如菲律賓，亞洲玉米螟已經(jīng)成為最具破壞性的玉米害蟲。此外，玉米螟寄主植物廣泛，除為害玉米外，田間寄主植物有8科20種，包括酸模葉蓼Polygonumlapathifolium、谷子和薏苡Setariaitalica等(袁志華等, 2015)。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種通過同源雙鏈RNA(dsRNA)特異性敲低目的基因表達(dá)量的技術(shù)，在基因功能領(lǐng)域它是一種有效的研究手段(Hannon, 2002; Geley and Müller, 2004)。這種基因沉默的方式是一種內(nèi)源轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)機(jī)制, dsRNA轉(zhuǎn)化為小干擾RNA(siRNA)，最終使得mRNA快速降解，這種降解發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，可導(dǎo)致正?；蚬δ艿某聊?Hammond, 2005)。在過去的幾十年間，已經(jīng)有許多文章報道了該技術(shù)在害蟲防治領(lǐng)域的有效應(yīng)用，包括噴灑、飼喂和注射(Baumetal., 2007; Wangetal., 2011; Zhangetal., 2013)。昆蟲dsRNA的飼喂方法首次在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans中使用以來 (Fireetal., 1998)，已成功地應(yīng)用于昆蟲發(fā)育、繁殖、行為和免疫等多種生理過程的基因功能鑒定。例如，通過飼喂雙鏈RNA，可以引起蘋果淺褐卷葉蛾觸角中某些基因的表達(dá)量降低 (Turneretal., 2010)。在本研究中，為了增加其有效和實用性，我們利用了一種RNaseⅢ缺陷型的大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)菌株，其內(nèi)部由于插入了Tn10轉(zhuǎn)座子，導(dǎo)致rnc基因無法表達(dá)RNase Ⅲ，從而使得dsRNA可以大量表達(dá)(Maetal., 2020)。

我們在亞洲玉米螟中發(fā)現(xiàn)，NPF調(diào)控幼蟲取食行為(Yueetal., 2017)。然而，下調(diào)NPF的幼蟲是否能正常生長發(fā)育、正常化蛹以及正常交配和生殖？為了進(jìn)一步闡明這些問題，本研究通過連續(xù)飼喂dsNPF和dsGFP，探究了NPF對亞洲玉米螟生長發(fā)育和繁殖的影響和調(diào)控作用，為NPF在田間害蟲的防治應(yīng)用提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

實驗所用亞洲玉米螟采自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實驗站，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生理生化與分子生物學(xué)實驗室飼養(yǎng)。幼蟲以人工飼料飼喂于塑料養(yǎng)蟲盒(20 cm×14 cm×8 cm)中，亞洲玉米螟化蛹后從飼料中揀出，轉(zhuǎn)入養(yǎng)蟲籠中以5%蜂蜜水喂養(yǎng)，養(yǎng)蟲籠頂部罩一層蠟紙供成蟲產(chǎn)卵，每天將有卵的蠟紙?zhí)鎿Q下來放到養(yǎng)蟲盒中待其孵化。飼養(yǎng)條件為：溫度28℃，相對濕度60%左右，光周期16L∶8D。

亞洲玉米螟人工飼料配方如下：玉米粉150.0 g，大豆粉150.0 g，葡萄糖75.0 g，抗壞血酸4.0 g，瓊脂22.0 g，酵母粉90.0 g，山梨酸5.0 g，水1 400 mL。具體配制方法如下：玉米粉150 g，大豆粉150 g，酵母粉90 g， 充分混勻后在烘箱中120℃烘烤1 h； 食用葡萄糖75 g，抗壞血酸4 g，加1 000 mL水溶解后倒入烘烤好的混合物中，充分?jǐn)嚢?，靜止發(fā)酵1 h；稱取40 g玉米粉加適量水煮沸，稱取22 g瓊脂加適量水(共700 mL)攪拌均勻，倒入沸騰的水中繼續(xù)小火煮沸，煮沸后5 min停火晾涼至60℃左右；稱取山梨酸5.0 g加入混合物中并充分?jǐn)嚢?，快速倒入滅菌的醫(yī)用白瓷盤中，冷卻后置于4℃冷藏備用。

1.2 dsRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與dsRNA的合成

本實驗參考Ma等(2020)基于工程菌高效合成dsRNA的方法，分別構(gòu)建dsNPF和dsGFP表達(dá)載體。其中，dsNPF表達(dá)載體的構(gòu)建是通過設(shè)計的dsNPF雙鏈序列擴(kuò)增出393 bp和349 bp兩個片段，然后分別用XbaⅠ-HindⅢ(TaKaRa)和XhoⅠ-HindⅢ酶切消化，形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)。而dsGFP表達(dá)載體的構(gòu)建是通過設(shè)計的dsGFP雙鏈序列擴(kuò)增出447 bp和403 bp兩個片段，然后分別用XbaⅠ-HindⅢ(TaKaRa)和XhoⅠ-HindⅢ酶切消化，形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)。將形成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)片段克隆到pET-28a的XbaⅠ-XhoⅠ位點，生成pET28-NPF和pET28-GFP。以上載體構(gòu)建引物由生工生物股份有限公司合成，序列詳見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

將pET28-NPF和pET28-GFP分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3) RNaseⅢ菌株(Maetal., 2020)，細(xì)胞于37℃孵育過夜。挑取單個克隆，在Kan抗性培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。將100 μL培養(yǎng)液稀釋至15 mL含有Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩。當(dāng)OD值到達(dá)0.4時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG, 29℃在搖床中220 r/min誘導(dǎo)過夜。用乙醇固定法提取含有大量雙鏈目的基因的總RNA。

1.3 飼喂dsGFP和dsNPF進(jìn)行RNAi

待人工飼料冷卻至少10 min后，分別將dsGFP和dsNPF與人工飼料混合，使其終濃度分別為0.01%(10 mg dsRNA混合100 g飼料)和0.02%(20 mg dsRNA混合100 g飼料)，分別飼喂剛孵化的亞洲玉米螟1齡(低齡)及剛蛻皮的3齡(中齡)和5齡(高齡)幼蟲，其中1齡開始處理的蟲數(shù)為150頭，3齡和5齡開始處理的蟲數(shù)為80頭；每處理包含3個生物學(xué)重復(fù)。每天更換含有dsGFP和dsNPF的人工飼料，以確保雙鏈的有效干擾。

1.4 RNAi后亞洲玉米螟幼蟲npf基因表達(dá)量的檢測

以含dsGFP和dsNPF的人工飼料飼喂10頭5齡初幼蟲24 h后,利用Trizol法(寶生物工程, 大連)提取亞洲玉米螟幼蟲中腸總RNA，并用超微量紫外分光光度計NanoDrop8000(Thermo, 美國)檢測RNA濃度和純度。以提取的總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(TaKaRa, 大連)合成單鏈cDNA。

利用Primer Premier 5設(shè)計npf基因的熒光定量引物(表1)。引物的合成由生工生物股份有限公司合成。根據(jù)SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 試劑盒(天根生化，北京)進(jìn)行qPCR檢測。每處理含3個生物學(xué)重復(fù)，每生物學(xué)重復(fù)含有3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系(20 μL): 2×Taq MasterMix 10 μL, 50×ROX 2 μL, RNase-Free dH2O 5.8 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL, cDNA 1 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 15 min; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán)。

1.5 RNAi后亞洲玉米螟生長發(fā)育和繁殖指標(biāo)觀測

從飼喂dsGFP和dsNPF的人工飼料后持續(xù)觀察直至蟲體死亡，每日測量并記錄幼蟲體長、體重、原始人工飼料重、剩余飼料重、無幼蟲飼料重(對照，排除水分蒸發(fā)對結(jié)果的影響)、糞便重、存活數(shù)、死亡數(shù)和幼蟲齡期。取食量的計算方法為：稱量新鮮的含dsRNA飼料的重量(mL)及表面積一致的不含dsRNA飼料的重量(n1，空白對照，用于檢測水分蒸發(fā)量)，飼喂24 h后，將蟲子和糞便挑出，再次稱量取食后的含dsRNA重量(m2)及空白對照飼料重量(n2)，此24 h的取食量=m1-m2-(n1-n2)?；悸视嬎惴椒椋河紨?shù)/5齡幼蟲數(shù)×100%；羽化率計算方法為：成蟲數(shù)/蛹數(shù)×100%。幼蟲各齡期和蛹發(fā)育歷期統(tǒng)計和計算方法為：50%個體進(jìn)入到下一齡期或下一蟲態(tài)所需天數(shù)；成蟲壽命是指羽化進(jìn)成蟲至死亡的時間；單雌產(chǎn)卵量是指單頭雌蟲產(chǎn)卵的總量。

體重、體長和取食量的檢測為5齡檢測指標(biāo)的平均值；除存活率、化蛹率和羽化率外，其余指標(biāo)均為個體數(shù)據(jù)。以上實驗均含3個生物學(xué)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用GraphPad Prism, version 5.01(GraphPad Software, San Diego, CA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 dsGFP和dsNPF的鑒定及干擾效率驗證

將850 bp的GFP基因片段和742 bp的npf基因片段分別以正義和反義方向克隆到pET28a載體上，其中分別含有一個86 bp和一個79 bp的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3) RNaseⅢ中生成目標(biāo)dsRNA，利用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行大小鑒定，其中dsNPF為322 bp，dsGFP為412 bp (圖1: A)。

將獲得的dsRNA與玉米螟人工飼料混合，飼喂5齡初幼蟲24 h后，解剖亞洲玉米螟幼蟲中腸，檢測npf的表達(dá)量。結(jié)果顯示，dsNPF干擾后，npf在亞洲玉米螟幼蟲中腸中的表達(dá)量顯著下降了40.9%(P<0.001)(圖1: B)，證明dsRNA是有效的。

2.2 NPF對亞洲玉米螟幼蟲的影響

2.2.1對幼蟲取食量的影響：我們用0.01%和0.02%的dsNPF和dsGFP(對照)分別飼喂剛孵化的1齡幼蟲、剛蛻皮的3齡幼蟲和剛蛻皮的5齡幼蟲，然后測定5齡幼蟲的平均取食量。從1, 3和5齡幼蟲開始飼喂0.01% dsNPF時，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，處理組5齡幼蟲取食量分別顯著下降了13.84%(P<0.05), 33.33%(P<0.001)和36.40%(P<0.01) (圖2: A)；同樣情況下從1, 3和5齡幼蟲開始飼喂0.02% dsNPF時，與飼喂0.02% dsGFP的對照相比，5齡幼蟲取食量分別顯著下降了34.33%(P<0.01), 38.20%(P<0.01)和42.52%(P<0.01)(圖2: B)。這些結(jié)果說明，0.01% dsNPF對亞洲玉米螟幼蟲取食的影響是非常有效的；dsNPF處理不同幼蟲期對其取食量的影響是相似的。

圖2 0.01%(A)和0.02%(B) dsNPF處理對亞洲玉米螟5齡幼蟲取食量的影響Fig. 2 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the food consumption of the 5th instar larvae of Ostrinia frunacalis圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。Data in the figure are mean±SE. nsP>0.05; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001(獨立樣本t檢驗Independent samples t-test). 下圖同The same for the following figures.

2.2.2對幼蟲體重的影響：用0.01% dsNPF飼喂亞洲玉米螟1齡直至5齡幼蟲時，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，處理幼蟲的體重顯著下降了25.84%(45.95±2.88 mgvs61.96±1.82 mg,P<0.01)；從3齡開始飼喂到達(dá)5齡時，0.01% dsNPF處理組幼蟲體重顯著下降了23.16%(44.20±2.10 mgvs57.52±1.76 mg,P<0.01)；從5齡初開始飼喂到達(dá)5齡末時，0.01% dsNPF處理組幼蟲體重顯著下降36.85%(40.82±0.84 mgvs64.64±1.31 mg,P<0.001) (圖3: A)。

圖3 0.01% (A)和0.02%(B) dsNPF處理對亞洲玉米螟5齡幼蟲體重的影響Fig. 3 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the body weight of the 5th instar larvae of Ostrinia frunacalis

用0.02% dsNPF飼喂1齡幼蟲直至5齡時，與飼喂0.02% dsGFP的對照相比，處理幼蟲的體重顯著下降了30.88%(46.98±2.24 mgvs67.97±1.76 mg,P<0.01)；從3齡開始飼喂到達(dá)5齡時，0.02% dsNPF處理組幼蟲體重顯著下降了32.61%(45.97±1.87 mgvs68.21±1.02 mg,P<0.001)；0.02% dsNPF從5齡初開始處理到5齡末，處理組幼蟲體重顯著下降了45.04%(34.82±1.86 mgvs63.35±0.91 mg,P<0.001)(圖3: B)。

上述結(jié)果說明，兩種濃度dsNPF處理的不同幼蟲期均引起體重的顯著下降。此外，因為5齡幼蟲是暴食期，在暴食期下調(diào)NPF嚴(yán)重干擾或影響了幼蟲的生長發(fā)育。

2.2.3對幼蟲體長的影響：用0.01% dsNPF飼喂亞洲玉米螟1齡直至5齡幼蟲時，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，處理幼蟲的體長顯著下降了26.26%(16.54±0.43 mmvs22.43±0.30 mm,P<0.001)；從3齡開始飼喂到達(dá)5齡時，0.01% dsNPF處理的幼蟲體長顯著下降了19.12%(17.81±0.40 mmvs22.02±0.28 mm,P<0.001)；從5齡初開始飼喂到達(dá)5齡末時，0.01% dsNPF處理的幼蟲體長顯著下降19.70%(17.41±0.38vs21.68±0.33 mm,P<0.01)(圖4: A)。

0.02% dsNPF飼喂1齡幼蟲直至5齡時，與飼喂0.02% dsGFP的對照相比，處理幼蟲的體長顯著下降了30.20%(15.28±0.72 mmvs21.89±0.80 mm,P<0.01)；從3齡開始飼喂到達(dá)5齡時，0.02% dsNPF處理的幼蟲體長顯著下降了31.18%(14.81±0.26 mmvs21.52±0.78 mm,P<0.01)；0.02% dsNPF從5齡初開始處理到5齡末，其幼蟲體長顯著下降28.16% (15.59±0.52 mmvs21.70±0.37 mm,P<0.001)(圖4: B)。

圖4 0.01%(A)和0.02%(B) dsNPF處理對亞洲玉米螟5齡幼蟲體長的影響Fig. 4 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the body length of the 5th instar larvae of Ostrinia frunacalis

上述結(jié)果說明，無論是從1齡、3齡還是5齡幼蟲開始飼喂，dsNPF處理組5齡幼蟲體長均顯著低于對照個體，而高濃度dsNPF較低濃度有更大的影響。

2.2.4對幼蟲存活率的影響：用0.01% dsNPF分別飼喂亞洲玉米螟1齡和3齡幼蟲直到5齡幼蟲，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，處理幼蟲的存活率分別顯著下降了50.91%(P<0.001)和26.23%(P<0.01) (圖5: A)。同樣情況下飼喂0.02% dsNPF后，與飼喂0.02% dsGFP的對照相比,處理幼蟲的存活率分別顯著下降了88.57%(P<0.001)和27.44%(P<0.05) (圖5: B)。

圖5 0.01% (A)和0.02% (B) dsNPF處理對亞洲玉米螟幼蟲存活率的影響Fig. 5 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the survival rate of Ostrinia frunacalis larvae

上述結(jié)果說明：(1)0.01%的低濃度足以對其存活率產(chǎn)生巨大影響; (2)開始飼喂dsNPF的幼蟲期越早，其存活率也越低；(3)從1齡開始飼喂dsNPF的個體，其存活率的大幅下降主要集中在3齡前，且隨著dsNPF濃度的增加急劇下降；(4)從3齡開始飼喂dsNPF的個體，其存活率的下降相對較緩，說明dsNPF對3齡前幼蟲的存活率影響較大。

2.2.5對幼蟲發(fā)育歷期的影響: 用0.01% dsNPF從1齡初開始處理，1-5齡的發(fā)育歷期與飼喂0.01% dsGFP的對照相比平均延遲了7.00 d(22.00±0.00 dvs15.00±0.58 d,P<0.001)，發(fā)育延緩的時期主要發(fā)生在3齡到5齡幼蟲階段；0.01% dsNPF從3齡初開始處理，3-5齡的發(fā)育歷期與對照相比平均延遲了5.00 d(14.00±0.58 dvs9.33±0.33 d,P<0.01)，而發(fā)育延緩的時期主要發(fā)生在4-5齡階段；0.01% dsNPF從5齡初開始處理，5齡的發(fā)育歷期與對照相比平均延遲了2.00 d(5.67±0.33 dvs3.33±0.33 d,P<0.01)(表2)。

表2 0.01% dsNPF和dsGFP分別處理亞洲玉米螟1, 3和5齡初幼蟲后不同幼蟲齡期、蛹發(fā)育歷期和成蟲壽命Table 2 Developmental duration of different larval instars and pupae and adult life span after the early 1st, 3rd and5th instar larvae of Ostrinia furnacalis were fed with 0.01% dsNPF and dsGFP, respectively

0.02% dsNPF從1齡初開始處理，1-3齡的發(fā)育歷期與飼喂0.02% dsGFP的對照相比平均延遲了6.00 d (13.00±0.58 dvs7.33±0.33 d,P<0.01)，到4齡時已經(jīng)有90%以上的個體死亡，不再具有可比性；0.02% dsNPF從3齡初開始處理，3-5齡的發(fā)育歷期與飼喂0.02% dsGFP的對照相比平均延遲了8.00 d(17.67±0.67 dvs9.00±0.00 d,P<0.001)，發(fā)育延緩的時期主要發(fā)生在4-5齡階段；0.02% dsNPF從5齡初開始處理，其5齡的發(fā)育歷期與對照相比平均延遲了4.00 d (7.33±0.33 dvs3.67±0.33 d,P<0.01) (表3)。

表3 0.02% dsNPF和dsGFP分別處理亞洲玉米螟1, 3和5齡初幼蟲后不同幼蟲齡期、蛹發(fā)育歷期和成蟲壽命Table 3 Developmental duration of different larval instars and pupae and adult life span after the early 1st, 3rd and5th instar larvae of Ostrinia furnacalis were fed with 0.02% dsNPF and dsGFP, respectively

綜合上述結(jié)果，NPF對幼蟲的發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，npf的RNAi干擾嚴(yán)重影響了幼蟲發(fā)育的時間，主要表現(xiàn)在：1)相同RNAi濃度下，處理的幼蟲齡期越早，幼蟲死亡率越高，發(fā)育歷期越長；2)不同RNAi濃度下，處理濃度越高對發(fā)育歷期的影響越大，死亡率也越高。

2.2.6對幼蟲化蛹率的影響：用0.01% dsNPF分別飼喂亞洲玉米螟1, 3和5齡幼蟲，與飼喂0.01% dsGFP的對照組相比，處理組幼蟲化蛹率分別下降了27.03%, 18.92%和14.59%(圖6: A)。相同條件下用0.02%dsNPF分別飼喂1, 3和5齡幼蟲，其中飼喂1齡的幼蟲到5齡時死亡率已>90%，從3和5齡開始飼喂的幼蟲，與飼喂0.02% dsGFP的對照組相比，處理組幼蟲的化蛹率分別下降了39.20%和25.55%(圖6: B)。這些結(jié)果說明NPF對亞洲玉米螟幼蟲的化蛹有顯著影響，濃度越高影響越大。

圖6 0.01% (A)和0.02%(B) dsNPF處理對亞洲玉米螟化蛹率的影響Fig. 6 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the pupation rate of Ostrinia frunacalis

2.3 NPF對亞洲玉米螟蛹的影響

2.3.1對蛹發(fā)育歷期的影響：dsRNA從亞洲玉米螟1齡幼蟲開始處理時，50%以上個體從蛹到成蟲所需時間，飼喂0.01% dsGFP的對照組為3.33±0.33 d，而飼喂0.01% dsNPF的處理組超過90%的個體死亡，不再具有可比性；從3齡幼蟲開始飼喂dsRNA時，50%以上個體從蛹期發(fā)育到成蟲所需時間，對照組為3.00 d，而dsNPF處理組為7.33±0.33 d，延遲了4.33 d(P<0.001)；從5齡幼蟲開始飼喂dsRNA時，50%的個體從蛹期發(fā)育到成蟲所需時間，處理組與對照組相比延遲了2.33 d(5.33±0.33 dvs3.00 d,P<0.01)(表2)。

0.02% dsNPF從3齡開始飼喂幼蟲，50%以上個體從蛹期發(fā)育到成蟲所需時間，飼喂0.02% dsGFP的對照組為3.67±0.33 d，0.02% dsNPF處理組超過90%的個體死亡，不再具有可比性。從5齡幼蟲開始飼喂dsRNA時，50%以上個體從蛹期發(fā)育到成蟲所需時間，飼喂0.02% dsNPF的處理組與飼喂0.02% dsGFP的對照組相比延遲了2 d(5.67±0.33 dvs3.67±0.33 d,P<0.05)(表3)。這些結(jié)果說明，NPF對蛹的發(fā)育有極其顯著的影響。

2.3.2對蛹羽化率的影響: 用0.01% dsNPF分別飼喂亞洲玉米螟1, 3和5齡幼蟲，其中飼喂的1齡幼蟲至5齡死亡率已>90%。與飼喂0.01% dsGFP的對照組相比，從3齡和5齡幼蟲開始飼喂0.01% dsNPF的處理組成蟲個體的羽化率分別下降了46.61%和15.95%(P<0.01)(圖7: A)。相同條件下0.02% dsNPF分別飼喂1, 3和5齡幼蟲，其中飼喂的1齡和3齡幼蟲至4齡和蛹期死亡率已>90%，不具有可比性。從5齡幼蟲開始飼喂0.01% dsNPF的處理組與飼喂0.01% dsGFP的對照組相比，羽化率下降了2.62%(圖7: B)。這些結(jié)果說明NPF對亞洲玉米螟羽化率有極其顯著的影響，處理幼蟲期的時間越早影響越大。

圖7 0.01% (A)和0.02%(B) dsNPF處理對亞洲玉米螟蛹羽化率的影響Fig. 7 Impacts of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the eclosion rate of Ostrinia frunacalis pupae

2.4 NPF對亞洲玉米螟成蟲的影響

2.4.1對成蟲壽命的影響：用0.01% dsNPF飼喂亞洲玉米螟1齡幼蟲，在蛹期死亡率超過了90%，不再具有可比性；用0.01% dsNPF飼喂3齡幼蟲，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比成蟲約提前3 d死亡(8.00±0.58 dvs5.33±0.67 d,P<0.05)；用0.01%dsNPF飼喂5齡幼蟲，與0.01% dsGFP的對照相比成蟲提前3 d死亡(6.67±0.33 dvs3.33±0.33 d,P<0.01)(表2)。用0.02% dsNPF飼喂1齡和3齡幼蟲，它們分別在4齡幼蟲和蛹期個體死亡率高于90%，不再具有可比性；從5齡幼蟲開始飼喂0.02% dsNPF，與飼喂0.02%的對照相比成蟲提前4 d死亡(6.33±0.33 dvs2.33±0.67 d,P<0.01)(表3)。綜上所述，下調(diào)NPF對成蟲的壽命有顯著影響。

2.4.2對成蟲產(chǎn)卵的影響：用0.01% dsNPF飼喂1齡初幼蟲，羽化到到成蟲時雌蟲平均個體數(shù)僅有6頭，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比, 成蟲單雌產(chǎn)卵量下降了92.70%(50.68±12.13vs3.70±2.42,P<0.05)；用0.01% dsNPF飼喂3齡初幼蟲，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，成蟲單雌產(chǎn)卵量下降了90.15%(44.69±7.37vs4.40±0.65,P<0.01)，而用0.01% dsNPF飼喂5齡初幼蟲，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比，成蟲單雌產(chǎn)卵量下降了44.12%(41.48±9.33vs23.18±5.91,P>0.05)(圖8: A)。

用0.02% dsNPF飼喂1齡初幼蟲，羽化到成蟲時雌蟲平均個體數(shù)僅有1頭，不再具有可比性； 用0.02% dsNPF飼喂3齡初幼蟲，雌蟲平均個體數(shù)僅有8頭，與飼喂0.01% dsGFP的對照相比, 成蟲單雌產(chǎn)卵量下降了23.55%(36.60±6.10vs27.98±7.80，P>0.05)；用0.02%dsNPF飼喂5齡幼蟲，與飼喂0.02% dsGFP的對照相比，成蟲單雌產(chǎn)卵量下降了2.31%(63.11±4.56vs61.65±8.85,P>0.05)(圖8: B)。這些結(jié)果表明，dsNPF干擾對1齡和3齡開始處理的幼蟲其單雌產(chǎn)卵量有顯著的抑制作用。

圖8 0.01%(A)和0.02%(B) dsNPF對亞洲玉米螟成蟲單雌產(chǎn)卵量的影響Fig. 8 Effect of 0.01% (A) and 0.02% (B) dsNPF on the number of eggs laid per female by Ostrinia frunacalis adults

3 討論

NPF是一種多功能的神經(jīng)肽，涉及取食、交配與產(chǎn)卵(Wielendaeleetal., 2013)，睡眠與生物鐘節(jié)律(Heetal., 2013a, 2013b)，學(xué)習(xí)行為(Krashesetal., 2009)，酒精敏感度(Wenetal., 2005)，攻擊行為(Dierick and Greenspan, 2007)，保幼激素的合成(Wangetal., 2012)和聚集/分散狀態(tài)(Houetal., 2017)等調(diào)控。其中重要的功能之一是對幼蟲取食的調(diào)控，充分了解NPF對亞洲玉米螟幼蟲取食調(diào)控和生長發(fā)育的影響，將為玉米螟的新型防治策略提供理論依據(jù)。

在本研究中，我們采用了一種新的基于工程菌大量生產(chǎn)dsRNA的方法替代傳統(tǒng)的試劑盒合成dsRNA，可以更經(jīng)濟(jì)地獲得大量的dsRNA(圖1)，同時通過每天更換含有一定濃度dsRNA的飼料，保證個體在幼蟲取食階段均在dsRNA的有效干擾之下，使得研究NPF對亞洲玉米螟整個生活史的影響成為可能。

近年來，在果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)，NPF協(xié)調(diào)攝食行為和發(fā)育過程，即NPF通過腦內(nèi)的NPFR神經(jīng)元調(diào)節(jié)攝食行為，同時通過前胸腺中的NPFR調(diào)節(jié)發(fā)育，從而協(xié)調(diào)攝食行為和發(fā)育。當(dāng)敲低前胸腺中的NPFR表達(dá)時，僅果蠅幼蟲的個體大小發(fā)生差異，并未有取食量的降低(Kannangaraetal., 2020)，說明NPF調(diào)控的生長發(fā)育和取食行為是相互獨立的。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)敲減npf基因表達(dá)對亞洲玉米螟幼蟲的取食、存活率、體重、體長，以及化蛹率和羽化率均產(chǎn)生很顯著的影響(圖2～8)，其中對取食量的影響(圖2)是十分重要的，取食量的降低直接導(dǎo)致生長發(fā)育的延緩(表2～3)，和死亡率的顯著提高(圖5)。

從本研究中可以看出，不同濃度的dsRNA、不同的處理階段均會對RNAi的效率產(chǎn)生影響，且處理的幼蟲期越早其效果越佳(圖2～8)。此外，0.01% dsNPF對亞洲玉米螟的生長發(fā)育就具有重要的影響，反映出NPF的重要性。已有文章報道，不同的條件會決定RNAi的效率，例如更高劑量的dsRNA可以通過激活RNAi機(jī)器(RNAi machinery)增強(qiáng)RNAi反應(yīng)(Garbuttetal., 2013)；由于體型較小、發(fā)育更不完全，因此低齡幼蟲的RNAi效果會更佳(Araujoetal., 2006)。

CRISPR/Cas9最早于2012年被報道(Jineketal., 2012)。CRISPR表示有規(guī)律的成簇間隔短回文重復(fù)，Cas表示CRISPR相關(guān)核酸酶。該系統(tǒng)是細(xì)菌和真菌對病毒和質(zhì)粒的適應(yīng)性免疫過程中存在的一種RNA可編程的基因組編輯方法。該系統(tǒng)利用CRISPR RNAs (crRNAs)引導(dǎo)入侵核酸沉默。本研究的結(jié)果表明，從1齡開始飼喂dsNFP的幼蟲，其5齡幼蟲的平均死亡率高達(dá)92.5%(圖5)。因此，通過傳統(tǒng)方式構(gòu)建亞洲玉米螟NPF的缺失突變體是不可行的，但是，近年來有文獻(xiàn)陸續(xù)報道了條件性CRISPR-Cas9技術(shù)，例如通過四環(huán)素(tetracycline)或四環(huán)素衍生物比如多西環(huán)素(doxycycline)調(diào)控的Tet-on和Tet-off系統(tǒng)與CRISPR-Cas9系統(tǒng)的結(jié)合(Zhangetal., 2019)；在植物中，還有通過熱激(Nandyetal., 2019)和光照(Polstein and Gersbach, 2015)誘導(dǎo)的CRISPR-Cas9技術(shù)等。以上技術(shù)均為我們后續(xù)深入研究NPF的功能及調(diào)控機(jī)制提供了有效的手段。