黑水虻抗菌肽HI-3對人結(jié)腸癌HCT-8細胞谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路的影響

高嘉敏, 許曉燕, 胡紫媛, 陳映丹, 孫虹霞, 楊愈豐, 夏 嬙

(遵義醫(yī)科大學珠海校區(qū), 廣東珠海 519041)

黑水虻Hermetiaillucens隸屬于雙翅目(Diptera)水虻科(Stratiomyidae)，是世界廣泛關(guān)注的重要資源昆蟲，幼蟲生存能力強，主要用于禽畜糞便、廢棄農(nóng)作物及餐廚垃圾等有機廢物的無害化處理(鄧文輝等, 2019; Itesetal., 2020)。由于黑水虻幼蟲的特殊生存環(huán)境，近年來其抗菌肽的研究倍受關(guān)注，并取得了一定的研究成果，具有良好的應用前景。研究表明，從黑水虻幼蟲血淋巴中提取的抗菌肽HP/F9能有效抑制小鼠肺部肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumonia的繁殖，減輕小鼠肺部炎癥(Leeetal., 2020)；通過畢赤酵母Pichiapastoris表達的黑水虻抗菌肽DLP2和DLP4可以拮抗多重耐藥性金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus感染(Lietal., 2017)。此外，國外學者對黑水虻基因進行分析，得到了7個全新的抗菌肽基因片段，其中在大腸桿菌Escherichiacoli中表達的stomoxynzh1蛋白對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌以及真菌均具有良好的抑制作用(Elhagetal., 2017)。目前，國內(nèi)外關(guān)于黑水虻抗菌肽抑菌方面研究較多，但是關(guān)于其抑癌作用及其機理報道還較少，我們僅檢索到Hu X等(2018)分離得到的黑水虻抗菌肽cecropin-h1能夠通過誘導肺腺癌A549細胞凋亡來抑制其增殖，但是關(guān)于其抑癌機理并未深入研究。

本課題組從黑水虻幼蟲血淋巴中提取的抗菌肽HI-3，不僅具有良好的抑菌活性(田忠, 2017)，還可有效誘導人結(jié)腸癌細胞株HCT-8細胞凋亡，且其誘導凋亡與ROS相關(guān)(馮群, 2019)。昆蟲抗菌肽抑癌機理是多方協(xié)同作用，在各個領域均有研究，如破壞其膜結(jié)構(gòu)(Kunda, 2020)、誘導其凋亡(Chengetal., 2017)、調(diào)控其自噬(Adachietal., 2015)和影響其免疫效應(Hilchieetal., 2019)等，但應用代謝組學技術(shù)進行昆蟲抗菌肽抑癌機理的研究尚未見報道。

本研究基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技術(shù)并結(jié)合RT-qPCR, Western blot, ELISA和生化反應等生物學手段研究抗菌肽HI-3對人結(jié)腸癌HCT-8細胞谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路的影響，以豐富對黑水虻抗菌肽HI-3抑制HCT-8細胞增殖機理的認識，為進一步挖掘抗菌肽HI-3在結(jié)腸癌治療中的作用提供科學依據(jù)和理論支持，也有助于揭示抗菌肽HI-3在結(jié)腸癌治療中的作用靶點及相關(guān)代謝通路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑水虻抗菌肽HI-3由本課題組分離純化獲得，其純度為96.1%，分子量為5.98 kD。人結(jié)腸癌HCT-8細胞購自中國科學院上海ATCC細胞庫，人正常結(jié)直腸粘膜FHC細胞購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 HI-3對HCT-8細胞增殖的抑制檢測

HCT-8細胞和FHC細胞均在含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，杭州)和1%雙抗(氨芐青霉素和鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO，美國)于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用胰蛋白酶將培養(yǎng)狀態(tài)良好的HCT-8細胞和FHC細胞消化為單細胞懸液，分別加入96孔板中，培養(yǎng)24 h后吸出原培養(yǎng)基，分別向各培養(yǎng)孔中加入100 μL含80, 160和320 μg/mL的HI-3的培養(yǎng)基，每組4個復孔，同時設置不加HI-3(0 μg/mL)的陰性對照組以及空白對照組(培養(yǎng)基中無細胞)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去原培養(yǎng)基，將新鮮培養(yǎng)基與CCK-8試劑(DOJINDO，日本)以10∶1比例(體積比)混合，每孔各加110 μL此混合液，37℃孵育后，在波長450 nm處檢測吸光度值(A450)。 抑制率(%)=(A陰性對照組-A實驗組)/(A陰性對照組-A空白對照組)×100%，式中A為波長450 nm處吸光度值。

1.3 谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路靶標酶篩選

將濃度為3×105個/mL的HCT-8細胞懸液加入直徑為100 mm培養(yǎng)皿中(6 mL/皿)，培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)基，再加入6 mL終濃度為80, 160和320 μg/mL的HI-3培養(yǎng)基，同時設置不加HI-3(0 μg/mL)的陰性對照組，每組6個重復，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集樣本離心，液氮淬滅1 min。真空冷凍干燥后稱取各處理濃度下樣本各2 mg，分別加入1 000 μL提取劑(乙腈∶異丙醇∶水=3∶3∶2, 體積比)進行提取，利用肉豆蔻酸-d27溶液超聲萃取，取上清氮吹干燥。加入20 μL 40 mg/mL甲氧氨鹽酸鹽，30℃衍生處理90 min，加入90 μL含1%三甲基氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，37℃衍生30 min，離心取60 μL委托武漢安隆科訊技術(shù)有限公司完成GC-MS檢測。利用Golm代謝組學數(shù)據(jù)庫對結(jié)果圖譜進行對比分析,鑒定出具體的代謝物質(zhì)；采用正交偏最小二乘法分析(orthogonal single collection partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)對各實驗組與陰性對照組分別進行統(tǒng)計分析，建立統(tǒng)計模型，并利用R2Y值和Q2值對各組模型的準確性和可靠性進行評估；模型合格后，利用OPLS-DA的S-plot圖找出對分組貢獻明顯的代謝物并結(jié)合t檢驗，將同時滿足P<0.05的代謝物作為差異代謝物；將各實驗組數(shù)據(jù)與陰性對照組數(shù)據(jù)分別代入模式生物的通路中，在R軟件下進行通路分析，找出氨基酸含量差異最顯著的代謝通路，并依據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫代謝通路總圖進行分析，找出代謝通路靶標酶。

1.4 谷氨酰胺酶活力檢測

將濃度為3×105個/mL的HCT-8細胞懸液加入直徑為60 mm培養(yǎng)皿中(3 mL/皿)，培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)基，加入3 mL終濃度為320 μg/mL HI-3的培養(yǎng)基，同時設置不加HI-3(0 μg/mL)的陰性對照組，每組3個重復，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按照GLS活性試劑盒(南京建成生物科技有限公司，南京)檢測并計算其活力。GLS活力=0.083×(ΔA+0.005)(每1萬個細胞每分鐘催化谷氨酰胺生成1 μmol氨定義為1個活力單位，其中：ΔA=A測定管-A空白對照管)，式中A為吸光度值，空白對照管中除了試劑外加入蒸餾水，測定管加入實驗組/陰性對照組細胞的提取液。

1.5 谷氨酰胺酶mRNA表達檢測

將濃度為3×105個/mL的HCT-8細胞懸液加入6孔板(2 mL/孔)，培養(yǎng)24 h后加入2 mL終濃度為320 μg/mL HI-3的培養(yǎng)基，同時設置不加HI-3(0 μg/mL)的陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。利用Trizol RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，用AMV第1鏈cDNA合成試劑盒(生工生物工程股份有限公司，上海)合成cDNA第1鏈。以此cDNA為模板在實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)上進行RT-qPCR。谷氨酰胺酶基因擴增引物序列: F: 5′-CACTCAAATCTACAGGATTGCG-3′; R: 5′-CCAGAC TGCTTTTTAGCACTTT-3′。 反應體系(10 μL): cDNA 1 μL, 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL, 上下游引物(10 μmoL/L)各0.2 μL, ddH2O 3.6 μL。反應條件: 95℃預變性30 s; 95℃變性10 s, 60℃退火30 s, 循環(huán)40次。每組3個孔重復，用2-△△Ct法計算相對表達量。GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列: F: 5′-CATCTTCTTTGCGTCGCCA-3′; R: 5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成。

1.6 谷氨酰胺酶蛋白表達檢測

細胞培養(yǎng)和處理同1.5節(jié)，裂解細胞獲得細胞蛋白后進行蛋白濃度測定，SDS-PAGE凝膠電泳，每孔蛋白上樣量為5 μg，電泳完成后轉(zhuǎn)膜。用5% BSA封閉膜1 h，4℃孵育谷氨酰胺酶蛋白(GLS-1)抗體(Cell Signaling, 美國)和GAPDH抗體(Proteintech, 美國)過夜。TBST洗膜后孵育二抗1 h, TBST洗膜，使用雙色近紅外多功能成像儀(Analytik Jena，德國)曝光。使用Image J 1.8.0軟件進行灰度值分析。以目標蛋白GLS-1與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值比作為目標蛋白GLS-1的相對表達水平。

1.7 谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路重要代謝物含量檢測

細胞培養(yǎng)和處理同1.4節(jié)，按照谷氨酸(glutamic acid, Glu)測試盒、微量還原型谷胱甘肽(glutataione, GSH)測定試劑盒、ATP含量測試盒(南京建成生物科技有限公司，南京)、人谷氨酰胺(glutamine, Gln)ELISA試劑盒和人α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid, α-KG)ELISA試劑盒(藍基生物科技有限公司，上海)說明書檢測320 μg/mL HI-3處理濃度下HCT-8細胞內(nèi)Glu, GSH, ATP, Gln和α-KG含量，同時設置不加HI-3(0 μg/mL)的陰性對照組。

1.8 數(shù)據(jù)分析

GC-MS實驗數(shù)據(jù)使用R軟件，其他所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析。以平均值±標準差表示計量數(shù)據(jù)，兩兩對比采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，當P<0.05時具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 HI-3對HCT-8細胞增殖的抑制

80, 160和320 μg/mL黑水虻抗菌肽HI-3對HCT-8細胞的抑制率分別為33.85%±3.50%, 46.26%±0.90%和55.53%±1.70%；對人正常結(jié)直腸粘膜FHC細胞的抑制率均較小，分別為3.76%±0.80%, 4.93%±1.20%和6.92%±2.20%，與相同處理濃度條件下HI-3對HCT-8細胞抑制率相比極顯著降低(P<0.01)(圖1)，表明HI-3對正常細胞影響較小，但對HCT-8細胞具有很好的抑制作用。

2.2 谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路靶標酶

對陰性對照組和3個不同濃度HI-3(80, 160和320 μg/mL)給藥處理24 h后的衍生化樣品經(jīng)GC-MS分析后所得總離子流色譜圖中色譜峰分離效果較好，共有429個；經(jīng)Golm代謝組學數(shù)據(jù)庫對比分析,鑒定得到代謝物共36種，主要為纈氨酸、谷氨酸、異亮氨酸等氨基酸類物質(zhì)以及膽固醇、油酸、花生四烯酸等脂類物質(zhì)。另外，還包括羧酸類(乳酸)、醇類(肌醇)和糖類(半乳糖)等物質(zhì)(表1)。

表1 HCT-8細胞樣本代謝物質(zhì)定性檢測結(jié)果Table 1 Qualitative results of metabolites of HCT-8 cell samples

利用OPLS-DA對各組樣本進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)組內(nèi)樣本分布均勻，重現(xiàn)性較高，表明采集的樣本穩(wěn)定、可靠；80, 160和320 μg/mL HI-3處理組與陰性對照組分離完全，表明各處理組與陰性對照組相比差異顯著；且各組中的R2Y和Q2，均大于0.5，說明本研究所建立的模型準確、可靠。進一步依據(jù)OPLS-DA分析中3個濃度處理組與陰性對照組間的S-plot圖，并結(jié)合t檢驗，得到3個處理濃度下氨基酸類的共同差異代謝物有3種，分別為纈氨酸、谷氨酸和脯氨酸。其中，纈氨酸和脯氨酸含量隨處理濃度增加而增加，谷氨酸含量則隨處理濃度增加而降低(表2)。

分別將80, 160和320 μg/mL HI-3處理組細胞代謝產(chǎn)物與陰性對照組細胞代謝產(chǎn)物在R軟件下進行代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)所涉及氨基酸代謝通路有4條，分別為谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路，精氨酸和脯氨酸代謝通路，丙氨酸、天冬氨酸鹽和谷氨酸代謝通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路。其中在320 μg/mL處理濃度下谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路中的氨基酸代謝物含量與陰性對照組相比較差異最為顯著，因此選擇谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路作為后續(xù)分析的靶向代謝通路，并選擇320 μg/mL處理濃度為后續(xù)實驗濃度。

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路總圖分析表明，GLS能直接將Gln水解為Glu，是該通路的限速酶，同時結(jié)合表2中HI-3作用HCT-8細胞后Glu含量差異明顯，且隨處理濃度升高而降低(處理濃度最高時P值達到最小，為0.00028)，故推測GLS為谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路的靶標酶。

表2 不同濃度黑水虻抗菌肽HI-3處理后HCT-8細胞的氨基酸類差異代謝物Table 2 Differential amino acid metabolites of HCT-8cells treated by different concentrations of antimicrobialpeptide HI-3 from Hermetia illucens

2.3 谷氨酰胺酶活性和表達水平

與陰性對照組(0.069%±0.60%)相比，320 μg/mL HI-3處理HCT-8細胞的谷氨酰胺酶活性(U/104cells) 為0.029%±0.50%，極顯著降低(P<0.01)。RT-qPCR檢測結(jié)果表明，320 μg/mL HI-3處理后的HCT-8細胞其GLSmRNA表達量與陰性對照組相比極顯著降低(P<0.01)，是陰性對照組的0.649±0.01倍(圖2)。

圖2 黑水虻抗菌肽HI-3(320 μg/mL)對HCT-8細胞GLS基因表達量的影響Fig. 2 Effects of 320 μg/mL antimicrobial peptide HI-3from Hermetia illucens on the expression levelof GLS in HCT-8 cells圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；柱上雙星號表示320 μg/mL HI-3處理組與陰性對照組(0 μg/mL HI-3)相比GLS mRNA表達量差異極顯著(P<0.01, t檢驗)。Data in the figure are mean±SD, and the double asterisk above bars indicates extremely significant difference in GLS mRNA expression level between the 320 μg/mL HI-3 treatment group and the negative control group (0 μg/mL HI-3)(P<0.01, t-test).

Western blot檢測結(jié)果表明(圖3: A)，320 μg/mL HI-3處理組與陰性對照組相比其GLS蛋白表達水平明顯下降。對此結(jié)果進行灰度值分析表明，兩組間蛋白表達水平具有極顯著性差異(P<0.01)(圖3: B)。

圖3 黑水虻抗菌肽HI-3(320 μg/mL)處理的HCT-8細胞GLS蛋白表達Fig. 3 GLS protein expression in HCT-8 cells treatedby 320 μg/mL antimicrobial peptide HI-3from Hermetia illucensA: Western blot條帶Western blot bands; B: 條帶相對灰度值Relative gray level of bands. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；柱上雙星號表示320 μg/mL HI-3處理組與陰性對照組(0 μg/mL HI-3)相比GLS蛋白表達量差異極顯著(P<0.01, t檢驗)。Data in the figure are mean±SD, and the double asterisk above bars indicates extremely significant difference in GLS protein expression level between the 320 μg/mL HI-3 treatment group and the negative control group (0 μg/mL HI-3)(P<0.01, t-test).

2.4 谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路中重要代謝物含量

對谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路中處于重要地位的Gln, Glu和α-KG及其關(guān)鍵代謝產(chǎn)物GSH和ATP含量進行檢測，結(jié)果如圖4所示，320 μg/mL HI-3作用于HCT-8細胞后其細胞內(nèi)Gln含量顯著低于陰性對照組(P<0.05)(圖4: A)，其分解產(chǎn)物Glu含量和陰性對照組相比極顯著減少(P<0.01)(圖4: B)，與2.2節(jié)GC-MS檢測結(jié)果相一致。另外，Glu參與合成的抗氧化物GSH含量與陰性對照組相比亦極顯著降低(P<0.01)(圖4: C)。細胞能量代謝的重要中間產(chǎn)物α-KG含量及細胞內(nèi)重要的能源物質(zhì)ATP含量亦顯著減少(α-KG,P<0.05; ATP,P<0.01)(圖4: D, E)。這些結(jié)果均表明，HI-3作用后HCT-8細胞的谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路發(fā)生了顯著變化。

圖4 黑水虻抗菌肽HI-3(320 μg/mL)對HCT-8細胞谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路中重要代謝物含量的影響Fig. 4 Effects of 320 μg/mL antimicrobial peptide HI-3 from Hermetia illucens on the contentsof important metabolites in the glutamine and glutamic acid metabolic pathway in HCT-8 cellsA: Gln; B: Glu; C: GSH; D: α-KG; E: ATP. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；柱上星號表示320 μg/mL HI-3處理組與陰性對照組(0 μg/mL HI-3)相比相應代謝物含量差異顯著(*P<0.05, **P<0.01, t檢驗)。Data in the figure are mean±SD, and the asterisks above bars indicate significant difference in the content of the corresponding metabolite between the 320 μg/mL HI-3 treatment group and the negative control group (0 μg/mL HI-3)(*P<0.05, **P<0.01, t-test).

3 討論

細胞代謝組學是近年新興起的概念(Zhangetal., 2013)，是利用先進的技術(shù)對胞內(nèi)代謝物質(zhì)或者胞外代謝物質(zhì)進行分析(Leónetal., 2013)，鑒定出差異代謝物，在腫瘤研究方面具有無法比擬的優(yōu)勢性(Xieetal., 2019; Houetal., 2020)。本研究應用GC-MS技術(shù)對80, 160和320 μg/mL 3種處理濃度下HI-3作用后的HCT-8細胞進行細胞代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)HI-3主要對HCT-8細胞氨基酸代謝特別是谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路產(chǎn)生影響，并在320 μg/mL處理濃度時影響最大。

有研究表明，PIK3CA突變的結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)細胞會利用更多的谷氨酰胺并將其轉(zhuǎn)化為α-KG來補充TCA循環(huán)，進而產(chǎn)生更多ATP，為細胞生長提供能量(Haoetal., 2016)。GLS作為谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路中的重要代謝靶點，是將谷氨酰胺進行分解的限速酶，其高表達有助于CRC生長、擴散。GLS在CRC組織中的高表達與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及疾病惡化顯著相關(guān)，其功能的喪失能明顯抑制谷氨酰胺分解和有氧糖酵解，并使CRC細胞死亡(Songetal., 2017; Xiangetal., 2019)。另外，同時降低GLS和M2型丙酮酸激酶的表達能顯著逆轉(zhuǎn)CRC細胞對奧沙利鉑的耐藥，重新提高其對化療的敏感性(Luetal., 2017)。本研究結(jié)果表明，320 μg/mL HI-3可顯著抑制HCT-8細胞的增殖(圖1)，且在該濃度下GLS活性、mRNA和蛋白表達水平與陰性對照組相比均顯著下降(圖2和3)，說明HI-3對HCT-8細胞的抑制作用與GLS表達降低有關(guān)，我們推測GLS為HI-3抑制HCT-8細胞增殖的作用靶點。

在320 μg/mL HI-3作用下，HCT-8細胞谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路的關(guān)鍵代謝物Gln, Glu, α-KG以及代謝產(chǎn)物ATP和GSH含量與陰性對照組相比均顯著減少(圖4)，揭示此代謝通路受到明顯阻礙，與Hu M等(2018)研究木香烯內(nèi)酯通過降低HCT-116細胞內(nèi)GLS蛋白表達量及Glu, α-KG和ATP含量來抑制HCT-116細胞生長具有較好的一致性。谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路受到阻礙可抑制CRC細胞的增殖，可能是由于細胞內(nèi)ATP和GSH含量降低所致，因為ATP與細胞能量供應息息相關(guān)，而GSH則是維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)。另外，沉默CRC細胞中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因可減少NADPH的產(chǎn)生，降低GSH水平，從而通過ROS介導的損傷加強藥物誘導CRC細胞凋亡的效果(Juetal., 2017)，這也與本研究中GSH含量的降低以及本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HI-3處理后HCT-8細胞內(nèi)的ROS水平增加與凋亡相關(guān)(馮群, 2019)相吻合。

本研究雖然從代謝方面闡述了黑水虻抗菌肽HI-3對HCT-8細胞的增殖影響，但是，由于本研究僅利用GC-MS技術(shù)和簡單的生物學研究手段對谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路進行了初步研究，研究內(nèi)容尚不深入，對于抗菌肽HI-3的抑癌機理闡述尚不充分。后續(xù)將對GLS進行沉默或高表達，從而對其及谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路中的重要代謝物含量變化進行更為深入的研究。