荻草谷網(wǎng)蚜唾液蛋白基因Sm13498的克隆及功能分析

付 裕, 王 倩, 張 勇, 陳巨蓮

(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

荻草谷網(wǎng)蚜Sitobionmiscanthi為我國小麥Triticumaestivum主產(chǎn)區(qū)麥蚜優(yōu)勢種(陳其湖和俞水炎, 1988)，一直被誤定為麥長管蚜Sitobionavenae(張廣學, 1999)。在形態(tài)特征上，荻草谷網(wǎng)蚜與麥長管蚜的主要區(qū)別為：荻草谷網(wǎng)蚜的腹管長為尾片的1.40倍以上，后跗節(jié)Ⅱ短于喙節(jié)Ⅳ+Ⅴ的1.30倍，觸角節(jié)Ⅲ圓形次生感覺圈分布于近基部2/3(張廣學, 1999)。同時，Jiang等(2019)首次報道了荻草谷網(wǎng)蚜的基因組組裝和解析工作，從分子水平上證明我國北方麥區(qū)的優(yōu)勢種蚜蟲為荻草谷網(wǎng)蚜。

培育和利用抗蟲品種是害蟲綠色防控的重要措施，但由于蚜蟲對小麥適應(yīng)性強，導致目前生產(chǎn)上缺少優(yōu)良抗蚜小麥品種資源。蚜蟲唾液蛋白在蚜蟲-植物互作中起著重要作用(Willetal., 2007)。Jones和Dangl(2006)曾提出了一個病原菌與植物競爭此消彼長的“Z字模型”(Zig-Zag Model)來解釋病原菌與寄主植物復雜的動態(tài)互作關(guān)系。在此理論模型中，植物可通過細胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)感知病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMPs)，從而引發(fā)植物免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity, PTI)。為了成功定殖，病原菌可分泌效應(yīng)蛋白到寄主植物內(nèi)干擾PTI，導致效應(yīng)子引發(fā)的敏感(effector-triggered susceptibility, ETS)發(fā)生，但在長期進化中一些植物可產(chǎn)生抗性基因(resistance gene, R gene)，其表達的抗性蛋白可識別效應(yīng)子，進而引發(fā)效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng) (effector-triggered immunity, ETI)，由此進一步阻止病原菌的侵染和擴展。研究發(fā)現(xiàn)此模型也適用于解釋蚜蟲-植物間的互作關(guān)系，蚜蟲可通過針狀口器分泌唾液蛋白進入植物體內(nèi)進一步調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)(Hogenhout and Bos, 2011; Elzinga and Jander, 2013)。蚜蟲唾液中可誘導或抑制植物防御反應(yīng)的蛋白因子統(tǒng)稱為效應(yīng)子(Jaouannetetal., 2014)。

對于蚜蟲唾液蛋白效應(yīng)子篩選及功能研究主要有兩個途徑：(1)利用RNAi技術(shù)沉默潛在效應(yīng)子檢測對蚜蟲的影響；(2)在植物體內(nèi)過表達潛在效應(yīng)子檢測對植株防御反應(yīng)及蚜蟲的影響。Mutti等(2006, 2008)通過向豌豆蚜Acyrthosiphonpisum體內(nèi)注射siRNA，以及桃蚜Myzuspersicae取食含dsRNA的煙草植株，驗證了唾液蛋白C002對蚜蟲的寄主適應(yīng)性及取食起著重要作用。通過注射dsRNA沉默靶標基因，從豌豆蚜唾液腺基因中鑒定到一些可參與誘導或抑制植物防御的效應(yīng)子，如ACE(angiotensin-converting enzyme)和Armet等(Wangetal., 2015a, 2015b)。借鑒病原菌效應(yīng)子篩選及功能基因組學方法，Bos等(2010)成功鑒定了蚜蟲效應(yīng)子。將48個桃蚜候選效應(yīng)子在本氏煙Nicotianabenthamiana中瞬時過表達，篩選出Mp10參與抑制及誘導植物的防御反應(yīng)。進一步研究發(fā)現(xiàn)Mp10通過參與SA及JA介導的信號通路誘導植物防御反應(yīng)(Rodriguezetal., 2014)。在擬南芥Arabidopsisthaliana中過表達Mp55可顯著增加桃蚜繁殖率，蚜蟲對Mp55過表達植株選擇性更強，利用RNAi技術(shù)將Mp55沉默后，蚜蟲繁殖率顯著下降，表明Mp55可促進蚜蟲侵染，且可能參與抑制植株的防御反應(yīng)(Elzingaetal., 2014)。在本氏煙中過表達8個馬鈴薯長管蚜Macrosiphumeuphorbiae潛在效應(yīng)子，其中Me10及Me23可顯著提高桃蚜繁殖率，說明這兩個唾液蛋白作為潛在效應(yīng)子可能參與了抑制植株的防御反應(yīng)(Atamianetal., 2013)。

目前關(guān)于效應(yīng)子篩選及功能研究主要在豌豆蚜和桃蚜等模式昆蟲上，而對于麥蚜尤其是荻草谷網(wǎng)蚜唾液蛋白功能研究的相關(guān)報道較少。有研究通過酶活性測定方法在麥二叉蚜Schizaphisgraminum或荻草谷網(wǎng)蚜唾液中鑒定到多種蛋白酶類，并證實了蚜蟲唾液中的果膠酶及多酚氧化酶可誘導小麥的防御反應(yīng)(Liuetal., 2009; Maetal., 2010)。在前期研究中，我們通過二代轉(zhuǎn)錄組測序獲得了荻草谷網(wǎng)蚜唾液腺全轉(zhuǎn)錄組，并結(jié)合生物信息學以及組織表達特異性分析發(fā)現(xiàn)包括Sm13498(unigene名稱: cluster_13498_g1)在內(nèi)的表達豐度最高的前15個分泌蛋白都在唾液腺特異表達(Zhangetal., 2017)。利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)在荻草谷網(wǎng)蚜水溶性唾液中也成功鑒定到Sm13498蛋白(Zhangetal., 2021)。為進一步分析該唾液蛋白在蚜蟲-植物互作中的潛在功能，本研究中我們克隆了Sm13498基因，并分析其序列特征及其時空表達特性，進而通過根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens介導的瞬時表達方法對其功能開展初步分析，為進一步研究麥蚜唾液蛋白功能及蚜蟲-小麥互作分子機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲、質(zhì)粒和菌株

本實驗所用的荻草谷網(wǎng)蚜于2017年4月采自河北省廊坊市中國農(nóng)業(yè)科學院中試基地小麥田，在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所溫室中的養(yǎng)蟲籠內(nèi)使用小麥(中麥175)進行人工飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為20±1℃，相對濕度為65%～70%，光周期為16L∶8D。pSUC2T7M13ORI(pSUC2)載體、陽性對照pSUC2-Avr1b、陰性對照pSUC2-Mg87和釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeYTK12由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所王忠躍研究員提供。 pGR107載體、pGR107-BAX、pGR107-INF1及根癌農(nóng)桿菌GV101和EHA105菌株本實驗室保留。

1.2 RNA提取及cDNA的合成

取10頭生長期一致且饑餓處理6 h的荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜置于生態(tài)盒(2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm)內(nèi)，在小麥(中麥175)葉片上取食6, 12, 24和48 h后分別收集生態(tài)盒內(nèi)所有成蚜，置于無RNase的1.5 mL離心管中，液氮迅速冷凍后保存于-80℃冰箱內(nèi)備用。使用TRIzol(Invitrogen, 美國)提取不同取食時間的荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜的總RNA，通過超微量紫外可見光光度計DS-11(DeNovix, 美國)檢測濃度，并經(jīng)過2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。以1 μg總RNA為模板，按照EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金生物技術(shù)有限公司, 北京)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。

1.3 Sm13498基因克隆

基于前期獲得的荻草谷網(wǎng)蚜唾液腺全轉(zhuǎn)錄組中的Sm13498(unigene名稱: cluster_13498_g1)序列(Zhangetal., 2017, 2021)，使用Primer Premier 5.0軟件(PREMIER Biosoft, 美國)設(shè)計擴增Sm13498的ORF的PCR引物(表1)。PCR反應(yīng)體系(50 μL): 取1.2節(jié)中獲得的荻草谷網(wǎng)蚜成蟲cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL, ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件: 95℃預變性2 min; 95℃變性20 s, 50℃退火20 s, 72℃延伸60 s, 40個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并將條帶進行膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt克隆載體(全式金生物技術(shù)有限公司, 北京)中，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌EscherichiacoliTrans-1-T1感受態(tài)細胞內(nèi)，用M13引物篩選陽性克隆送到博邁德公司(北京)進行測序。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 序列生物信息學分析

利用OFR Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預測獲取Sm13498氨基酸序列；利用Expasy(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)分析Sm13498 預測分子量和等電點；利用SignalP4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測Sm13498信號肽序列；利用TMHMM 2.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析跨膜結(jié)構(gòu)域；利用Pfam(http:∥pfam.xfam.org/)預測功能結(jié)構(gòu)域，利用NLStradamus(http:∥www.Moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/)分析核定位信號。NCBI上利用Blast查找其他蚜蟲同源蛋白序列；利用Clustal Omega (https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行序列比對；利用MEGA6軟件的鄰接法構(gòu)建荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498和其他物種蛋白序列的系統(tǒng)進化樹，設(shè)置1 000次bootstraps進行檢驗。

1.5 Sm13498在取食小麥葉片不同時間的荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜中的相對表達量檢測

基于1.3節(jié)克隆的Sm13498序列使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計RT-qPCR引物(表1)。采用試劑盒TB Green Premix Ex Taq(TaKaRa, 大連)在實時熒光定量PCR儀ABI-7500(ABI, 美國)上進行。qPCR反應(yīng)體系(20 μL): cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL, TB Green Premix 10 μL, ROXⅡ 0.4 μL, ddH2O 6.6 μL。反應(yīng)條件: 95℃預變性2 min; 95℃變性30 s, 60℃退火30 s, 40個循環(huán)。以荻草谷網(wǎng)蚜β-actin(GenBank登錄號： NM_001126200)和NADPH(GenBank登錄號： NM_001162323)為內(nèi)參基因(Yangetal., 2014)，引物序列見表1。取生態(tài)盒內(nèi)10頭處理后的無翅成蚜樣品為一個生物學重復，每個處理設(shè)置3個生物學重復，每生物學重復樣品重復測定3次。

1.6 酵母分泌系統(tǒng)檢測信號肽功能

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點Sm13498信號肽PCR引物(表1)。以1.2節(jié)中獲得的荻草谷網(wǎng)蚜成蟲cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(50 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL, ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件: 95℃預變性2 min; 95℃變性20 s, 60℃退火20 s, 72℃延伸60 s, 40個循環(huán); 72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt克隆載體中，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Trans-1-T1感受態(tài)細胞內(nèi)，用M13引物篩選陽性克隆送到博邁德公司進行測序。用質(zhì)粒小提試劑盒(Axygen, 美國)提取測序正確的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ將重組質(zhì)粒和pSUC2同時進行雙酶切。利用凝膠回收試劑盒(Axygen, 美國)回收目的片段。將目的片段通過T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選出陽性重組質(zhì)粒pSUC2-Sm13498。

采用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒Frozen-EZ Yeast Transformation IITMKit(Zymo Research, 美國)將酵母菌株YTK12制備成酵母感受態(tài)細胞，將重組質(zhì)粒pSUC2-Sm13498、陽性對照pSUC2-Avr1b和陰性對照pSUC2-Mg87轉(zhuǎn)化到Y(jié)TK12中，在具有 pSUC2重組菌株篩選作用的CMD-W培養(yǎng)基(6.7 g YNB, 0.75 g Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplement, 20 g蔗糖, 20 g瓊脂, 1 000 mL去離子水)培養(yǎng)2～3 d。挑取驗證正確的酵母菌株在CMD-W液體培養(yǎng)基30℃ 250 r/min進行擴大培養(yǎng)48 h。在為所有菌株提供營養(yǎng)物質(zhì)的YPDA(YPDA 50 g, 瓊脂20 g, 1 000 mL去離子水)、CMD-W和具有信號肽功能鑒定作用的YPRAA(酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，棉籽糖20 g，瓊脂20 g，1 000 mL去離子水)的培養(yǎng)基平板中央滴加20 μL OD600=0.6的含有pSUC2-Sm13498, pSUC2-Avr1b和pSUC2-Mg87質(zhì)粒的YTK12菌株，倒放置培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)2～4 d。取1 mL菌液放于含2 mL 5%蔗糖(過濾滅菌)溶液的15 mL離心管中，震蕩混勻。加入1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)(索萊寶科技有限公司, 北京)溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配或避光保存)，使其終濃度為0.1%，避光水浴35℃ 30 min，邊孵育邊觀察，室溫放置5 min。通過菌落的生長情況和溶液顏色變化來驗證Sm13498信號肽的分泌活性。

1.7 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化本氏煙瞬時表達Sm13498

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計含有SalⅠ和SmaⅠ酶切位點的擴增Sm13498全長序列和去除N端信號肽序列的片段Sm13498-sp的PCR引物(表1)，進行PCR，反應(yīng)體系(50 μL): 取1.2節(jié)中獲得的荻草谷網(wǎng)蚜成蟲cDNA模板1 μL，上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL, ddH2O 22 μL。通過雙酶切再連接到pGR107載體中，轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株。將根癌農(nóng)桿菌的重組菌株用含卡那霉素(50 μg/mL)和利福平(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)過夜后，4 000 g離心收獲菌體，在浸潤緩沖液[10 mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸、20 mmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MgCl2]中重懸至OD600=0.3。室溫黑暗保存3 h，用1 mL不帶針的注射器將懸浮液浸潤到本氏煙(4周齡)葉片中。在本氏煙上分別注射包含pGR107-GFP(本實驗室所構(gòu)建并保存), pGR107-Sm13498和pGR107-Sm13498-sp根癌農(nóng)桿菌24 h，然后在對相應(yīng)位置上分別注射含Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, BAX)的pGR107-BAX和含晚疫霉Phytophthorainfestans中可誘導植物超敏反應(yīng)的激發(fā)子INF1(Kamounetal., 1993)的pGR107-INF1，5 d后觀察葉片表型，并將葉片置于脫色液(乙醇∶乙酸=6∶1， v/v)中至完全脫色后拍照。

1.8 Sm13498蛋白的煙草亞細胞定位

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計含有Eco31Ⅰ酶切位點去除N端信號肽的Sm13498 PCR引物(表1)，進行PCR，反應(yīng)體系(50 μL): 取1.2節(jié)中獲得的荻草谷網(wǎng)蚜成蟲cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL, ddH2O 22 μL。反應(yīng)程序: 95℃預變性2 min; 95℃變性20 s, 65℃退火20 s, 72℃延伸60 s, 40個循環(huán); 72℃延伸10 min。通過克隆連接到C端融合TagGFP的pBWA(V)HS-GLosgfp(作為對照組，本實驗室保存)載體中，構(gòu)建pBWA(V)HS-GLosgfp-Sm13498，轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株。28℃培養(yǎng)過夜后，4 000 g離心收獲菌體，在與1.7節(jié)相同的浸潤緩沖液中重懸至OD600=0.3。室溫保存4～6 h，用1 mL不帶針的注射器將懸浮液浸潤到本氏煙(4周齡)葉片中。4 d后，用蔡司LSM 880激光共聚焦顯微鏡(Zeiss, Jena, 德國)收集浸潤的葉片并觀察。GFP和葉綠素的自熒光分別在561和488 nm處被激發(fā)，在586-647和680-700 nm處采集。實驗重復進行3次。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計算Sm13498基因在取食不同時間的蚜蟲體內(nèi)的相對表達量變化(Livak and Schmittgen, 2001)，以0 h時的基因表達量作為對照，基因表達量以平均值±標準誤(SE)表示。所有數(shù)據(jù)采用SPSS20(IBM)軟件中Duncan氏新復極差法進行多重比較，顯著性差異水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 Sm13498基因克隆及序列特征

擴增獲得荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498開放閱讀框(ORF)(GenBank登錄號: MW346655)，序列全長783 bp，編碼260個氨基酸，預測分子量為28.01 kD，第1-22位氨基酸為N端信號肽序列，ORF中含有1個半胱氨酸，無功能結(jié)構(gòu)域，無跨膜結(jié)構(gòu)域和核定位信號。

序列比對結(jié)果表明(圖1)，Sm13498與豌豆蚜功能未注釋蛋白LOC100159087 precursor(GenBank登錄號: NP_001313548.1)氨基酸序列一致性為71.7%，與桃蚜未注釋蛋白LOC111028600(GenBank登錄號: XP_022163007.1)氨基酸序列一致性為60.9%。通過MEME分析，Sm13498、豌豆蚜LOC100159087 precursor(GenBank登錄號: NP_001313548.1)和桃蚜LOC111028600(GenBank登錄號: XP_022163007.1)這3個蛋白共預測得到5個motif(選擇較為準確得分較高的前2個motif在圖1中進行標注展示)，其中E值最高為9.0e-039的motif1定位在第77-126位氨基酸的位置，E值為4.7e-030的motif2定位在第162-219位氨基酸的位置。 系統(tǒng)發(fā)育樹表明，荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498與豌豆蚜的未注釋功能蛋白LOC100159087 precursor(GenBank登錄號: NP_001313548.1)親緣關(guān)系最近，與麥雙尾蚜Diuraphisnoxia的未注釋功能蛋白LOC107172580(GenBank登錄號: XP_015378361.1)親緣關(guān)系最遠，氨基酸序列一致性為45.74%。荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498與豌豆蚜LOC100159087 precursor以及桃蚜LOC111028600在同一分支上(圖2)。

圖1 荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498與其他昆蟲唾液蛋白的氨基酸序列比對Fig. 1 Amino acid sequence alignment of Sm13498 of Sitobion miscanthi with salivary proteins of other insects蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: Sm13498: 荻草谷網(wǎng)蚜 Sitobion miscanthi, MW346655; LOC100159087 precursor: 豌豆蚜Acyrthosiphon pisum, NP_001313548.1; LOC111028600: 桃蚜Myzus persicae, XP_022163007.1.

圖2 基于氨基酸序列的荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498和其他昆蟲唾液蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of Sm13498 of Sitobion miscanthi and salivary proteins of other insects based on amino acid sequences使用MEGA 6軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置1 000次bootstraps進行檢驗。The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method of MEGA 6 with 1 000 bootstrap replicates. 蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: Sm13498: 荻草谷網(wǎng)蚜 Sitobion miscanthi, MW346655; LOC100159087 precursor: 豌豆蚜Acyrthosiphon pisum, NP_001313548.1; LOC111028600: 桃蚜Myzus persicae, XP_022163007.1; AGLY_001142: 大豆蚜Aphis glycines, KAE9545599.1; LOC114130459: 棉蚜 Aphis gossypii, XP_027851238.1; FWK35_00017591: 苜蓿蚜Aphis craccivora, KAF0755754.1; LOC112598442: 高粱蚜 Melanaphis sacchari, XP_025200691.1; LOC113552996: 玉米縊管蚜Rhopalosiphum maidis, XP_026811885.1; LOC107172580: 麥雙尾蚜 Diuraphis noxia, XP_015378361.1.

2.2 Sm13498在取食小麥葉片不同時間的荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜中的相對表達量

結(jié)果(圖3)表明，荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜在取食小麥葉片的不同時間內(nèi)，Sm13498均有表達，取食6, 12, 24和48 h表達量分別是對照組的1.39, 1.68, 1.35和1.34倍，其中在取食12 h時表達量達到最高，且顯著高于在其他取食時間的表達量(F4,10=2.416,P<0.05)。

圖3 Sm13498基因在取食小麥葉片不同時間的荻草谷網(wǎng)蚜無翅成蚜中的相對表達量Fig. 3 Relative expression levels of Sm13498 inapterous adults of Sitobion miscanthi feedingon Triticum aestivum leaves for different time圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；以0 h時的基因表達量作為對照，柱上不同字母表示不同取食時間基因表達量差異顯著(P<0.05, Duncan氏新復極差法)。Data in the figure are mean±SE. The gene expression level at 0 h was used as the control. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different feeding time points (P<0.05, Duncan’s new multiple range test).

2.3 Sm13498信號肽功能

在YPDA培養(yǎng)基中，含pSUC2-Sm13498, pSUC2-Avr1b和pSUC2-Mg87重組酵母菌株YTK12以及野生型YTK12均可以正常生長；在缺少色氨酸的CMD-W培養(yǎng)基中，由于野生型YTK12缺少pSUC2質(zhì)粒無法生長；攜帶pSUC2-Sm13498和pSUC2-Avr1b的YTK12酵母菌株，能在以棉籽糖為唯一碳源的YPRAA培養(yǎng)基上生長，說明陽性對照Avr1b與 Sm13498信號肽都具有活性，可以與SUC2融合后能夠使蔗糖酶正常分泌到胞外，從而將棉籽糖分解為酵母可直接利用的單糖。pSUC2-Mg87信號肽不具備分泌活性，與野生型YTK12菌株一樣不能將合成蔗糖酶分泌到細胞外，因此不能在YPRAA培養(yǎng)基上正常生長(圖4)。

攜帶pSUC2-Sm13498和pSUC2-Avr1b的YTK12酵母菌株可以分泌蔗糖酶能把蔗糖水解成單糖，單糖則與無色的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)反應(yīng)產(chǎn)生暗紅色且不溶于水的氯化三苯基四氮唑(triphenylformazan, TTF)。野生型YTK12和pSUC2-Mg87不能分泌蔗糖酶，無法與TTC發(fā)生顯色反應(yīng)(圖4)。

圖4 酵母表達系統(tǒng)中荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498信號肽活性鑒定Fig. 4 Identification of the signal peptide activity of Sm13498 of Sitobion miscanthi in yeast expression system在YPDA培養(yǎng)基中，pSUC2-Sm13498, pSUC2-Avr1b和pSUC2-Mg87重組酵母菌株YTK12以及野生型YTK12可以正常生長；在CMD-W培養(yǎng)基中，由于缺少pSUC2質(zhì)粒，野生型YTK12無法生長；攜帶pSUC2-Sm13498和pSUC2-Avr1b的YTK12能在以棉籽糖為唯一碳源的YPRAA培養(yǎng)基上生長，無色的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)被還原為暗紅色且不溶于水的氯化三苯基四氮唑(TTF)；pSUC2-Mg87信號肽不具備分泌活性，含pSUC2-Mg87的菌株與野生型YTK12一樣不能在YPRAA培養(yǎng)基上正常生長。The YTK12 strains containing pSUC2-Sm13498, pSUC2-Avr1b and pSUC2-Mg87 and the wild-type YTK12 could grow normally on YPDA medium. The wild-type YTK12 could not grow on CMD-W medium due to the lack of pSUC2 plasmid. YTK12 carrying pSUC2-Sm13498 and pSUC2-Avr1b could grow on YPRAA medium with raffinose as the only carbon source, and catalyze the conversion of colorless 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to the insoluble dark-red-colored triphenylformazan (TTF). The signal peptide of pSUC2-Mg87 had no secreting activity and the strain containing pSUC2-Mg87 could not grow normally on YPRAA medium as the wild-type YTK12.

2.4 農(nóng)桿菌介導Sm13498在本氏煙中抑制細胞壞死的功能及亞細胞定位

在單獨注射pGR107-GFP和MgCl2的位點葉片沒有出現(xiàn)組織壞死；在分別單獨注射pGR107-Sm13498和pGR107-Sm13498-sp的位點也無組織壞死，說明唾液蛋白Sm13498本身不會引起細胞死亡。分別注射pGR107-BAX和pGR107-INF1能夠引起葉片的壞死反應(yīng)，pGR107-GFP不能抑制BAX和INF1引起的壞死，但分別注射pGR107-Sm13498和pGR107-Sm13498-sp24 h后，再次pGR107-BAX和pGR107-INF1不會引起葉片的壞死反應(yīng)(圖5)。結(jié)果表明Sm13498有效抑制BAX和INF1引發(fā)程序性細胞死亡。

圖5 根癌農(nóng)桿菌介導荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498在本氏煙中瞬時表達Fig. 5 Transient expression of Sm13498 of Sitobion miscanthi in Nicotiana benthamiana mediated by Agrobacterium tumefaciens左圖示意右圖中各圓圈對應(yīng)的處理。The left figure shows the corresponding treatments for circles in the right figure. Sm13498-sp: 去除N端信號肽Removal of N-terminal signal peptide; BAX: Bcl-2相關(guān)X蛋白Bcl-2-associated X protein; INF1: 晚疫霉Phytophthora infestans中可誘導植物超敏反應(yīng)的激發(fā)子Host-specific elicitor of Phytophthora infestans to induce the plant hypersensitivity. GFP+BAX/INF1: 注射pGR107-GFP 24 h后再注射pGR107-BAX/INF1 (Injection of pGR107-BAX/INF1 after 24 h of injection of pGR107-GFP); Sm13498+BAX/INF1: 注射pGR107-Sm13498 24 h后再注射pGR107-BAX/INF1 (Injection of pGR107-BAX/INF1 after 24 h of injection of pGR107-Sm13498); Sm13498-sp+BAX/INF1: 注射pGR107-Sm13498-sp 24 h后再注射pGR107-BAX/INF1 (Injection of pGR107-BAX/INF1 after 24 h of injection of pGR107-Sm13498-sp). 注射MgCl2和pGR107-GFP為對照組。Injections of MgCl2and pGR107-GFP were set as the control groups, respectively. 右側(cè)照片為左側(cè)葉片脫色處理后的照片。The right photo is the photo of the left leaf post decolorization treatment.

通過共聚焦顯微鏡觀察(圖6)顯示，pBWA(V)HS-GLosgfp對照組在本氏煙葉片的細胞的細胞質(zhì)和細胞核均顯示出熒光; Sm13498-GFP融合蛋白組的熒光只出現(xiàn)在細胞的質(zhì)膜上，初步表明Sm13498定位在本氏煙葉片細胞膜。

圖6 根癌農(nóng)桿菌介導荻草谷網(wǎng)蚜Sm13498在本氏煙葉片中的亞細胞定位Fig. 6 Subcellular localization of Sm13498 of Sitobion miscanthi in Nicotiana benthamiana leaves mediatedby Agrobacterium tumefaciensFluorescence: 熒光觀察Observation of fluorescence; Chloroplast: 葉綠體觀察Observation of chloroplast; Bright field: 明場Bright field; Merged: 前3張圖片融合Fusion of the former three pictures. 標尺Scale bars=20 μm.

3 討論

在前期研究中，我們通過轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學技術(shù)成功鑒定到一個表達豐度高且在荻草谷網(wǎng)蚜唾液腺特異表達的唾液蛋白，并將其命名為Sm13498(Zhangetal., 2017, 2021)。為進一步探究Sm13498在蚜蟲-寄主互作中的潛在功能，本研究首先通過基因克隆驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Sm13498序列的完整性與真實性，擴增得到該基因ORF全長序列，其編碼260個氨基酸，N端具有分泌蛋白特有的信號肽序列，氨基酸序列中含有1個半胱氨酸，無功能結(jié)構(gòu)域，無跨膜結(jié)構(gòu)域和核定位信號，符合效應(yīng)蛋白基本的序列特征。系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，Sm13498與豌豆蚜未注釋功能蛋白LOC100159087 precursor(GenBank登錄號: NP_001313548.1)氨基酸序列相似性較高，且親緣關(guān)系最近(圖2)。

在病原菌侵染寄主過程中，其相關(guān)分泌蛋白的基因表達量是否顯著升高，成為篩選潛在效應(yīng)子的重要指標之一(Yangetal., 2020)。本研究以此病原菌篩選效應(yīng)子的模式為參考，以取食0 h的荻草谷網(wǎng)蚜為對照，通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)Sm13498在荻草谷網(wǎng)蚜各個取食時間均有所表達，在取食12 h時表達量達到峰值且顯著高于在其他取食時間的表達量(圖3)。有研究表明，蚜蟲取食12 h后可誘導小麥葉片內(nèi)大量防御相關(guān)基因表達(趙麗艷, 2006)，因此Sm13498蛋白可能參與調(diào)節(jié)寄主植物的早期防御反應(yīng)。Sm13498基因在蚜蟲取食過程中的高表達及其在唾液腺組織特異表達模式，表明該唾液蛋白可能在荻草谷網(wǎng)蚜取食及其與寄主互作中發(fā)揮重要作用。

信號肽一般位于分泌蛋白的N端，并與蛋白質(zhì)的分泌特性有關(guān)(韋雪芳等, 2006)。效應(yīng)子只有被病原菌或者昆蟲分泌到植物組織或細胞內(nèi)，才能與寄主植物內(nèi)的互作蛋白結(jié)合，從而調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)或其他生理過程，因此具有分泌活性的N端信號肽也為效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)特征之一。Sm13498序列N端1-22氨基酸為預測信號肽，為進一步驗證其具有分泌活性，本研究利用酵母分泌系統(tǒng)對Sm13498的信號肽序列進行功能鑒定。結(jié)果顯示，含有Sm13498信號肽序列的酵母菌株可以在只含有棉籽糖的YPRAA培養(yǎng)基上生長，并使TTC顯色，證實了其信號肽序列能夠使缺陷型酵母重新分泌蔗糖酶(圖4)。這表明Sm13498的信號肽具有分泌活性，從而推斷Sm13498蛋白可能被分泌到細胞外來執(zhí)行生物學功能。Chaudhary等(2015)通過人工飼料飼喂馬鈴薯的蚜蟲以收集唾液蛋白，并通過蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定到Sm13498同源蛋白。Zhang等(2020)利用類似方法在荻草谷網(wǎng)蚜唾液蛋白中鑒定到Sm13498蛋白，進一步說明Sm13498可被蚜蟲分泌到體外。但是，有研究表明，用于收集蚜蟲唾液蛋白的人工飼料成分、蚜蟲數(shù)量等因素會直接影響唾液蛋白組分(Milesetal., 1999; Bosetal., 2010)，因此后續(xù)仍需通過Western blot或者免疫共定位等技術(shù)直接證實Sm13498可被荻草谷網(wǎng)蚜分泌到小麥組織內(nèi)。

亞細胞定位可以提供效應(yīng)子或唾液蛋白在細胞上的具體存在部位，為后續(xù)蛋白作用位點及功能研究提供重要信息。馬鈴薯長管蚜唾液蛋白Me10(Chaudharyetal., 2019)以及禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi唾液蛋白Rp1與Rp58(Escudero-Martinezetal., 2020)均定位在本氏煙葉片的細胞質(zhì)和細胞核上，而桃蚜唾液蛋白MpC002定位于煙草細胞膜中(Bosetal., 2010)。本研究通過類似方法確定了荻草谷網(wǎng)蚜唾液蛋白Sm13498定位在本氏煙葉片表皮細胞的細胞膜上(圖6)，說明其作用位點或者靶標蛋白可能存在于寄主細胞膜上。相比于對照組GFP，Sm13498- GFP融合蛋白在熒光信號較弱，推測可能Sm13498在煙草細胞中轉(zhuǎn)化率較低。不同蚜蟲唾液蛋白在細胞中的定位不同，這也表明蚜蟲唾液蛋白在寄主植株中作用位點或作用方式的多樣性。

農(nóng)桿菌介導的瞬時表達方法可實現(xiàn)對病原菌、蚜蟲及其他昆蟲的效應(yīng)蛋白的高通量鑒定及功能分析(Wangetal., 2011)。在煙草中瞬時過表達小鼠Bcl-2 家族的促凋亡因子(Boumelaetal., 2009)及馬鈴薯晚疫霉激發(fā)子INF1(Kamounetal., 1993)，可觸發(fā)程序性細胞死亡，出現(xiàn)類似于植物防御相關(guān)的過敏性壞死反應(yīng)(hypersensitive response, HR)，而且能夠激發(fā)寄主植物相關(guān)抗病蛋白的表達(Lacomme and Santa Cruz, 1999)。因此，在煙草葉片中過表達病原菌分泌蛋白或昆蟲唾液蛋白，并觀察對BAX或INF1誘導細胞死亡的抑制作用，可推斷該蛋白是否具有抑制植物防御反應(yīng)的功能活性。在本研究中，Sm13498以及去除N端信號肽的Sm13498片段均可以抑制由BAX和INF1誘導的煙草細胞死亡(圖5)，初步說明唾液蛋白Sm13498可抑制寄主植物的防御反應(yīng)，但Sm13498的具體功能仍需要進行后續(xù)實驗來進一步驗證。